¥ 凶 )

恒国

‑ S

副診

﹄ hu wp

﹃ ︑同

C M

日目

F A

c

・3 0

・3 0 5 0

今

司

L ' a ' z n v n u

( ‑ a ω

‑

副b F 旬h

︒a ω

︒ ︒

‑¥ ω )

三

ω

芯注

目

a

z u

健康に対して有用な作多紡績の慎取は腸内フローラおよび腸内フローラを介して，

高用量撲取した場 b

ある穫の海藻そのものを(通常の摂取量ではなく) 用を示すが，

海藻多糖類だけではなくその他の成分も盲腸あるいは大腸まで到達し，腸‑

合には，

特に本実験粗抽出した海藻多糖類の摂取の影響とは内フローラおよび腸内環境に対して深く関与しするものと考えられる

.

見かけの影響は，

で用いたアラメの場合，

M M

大きく異なることが示された

.

F i g . 3 1 Ef

fects of polysacch釘idesand methanolic extract of

arame

on body

，

fec

a 1 ，

cecal and liver weight in rats

アラメに限らず海藻中の低分子の生理活性物質について多くの研究が行われ，

The rats were grou戸d(4 rats per group) and fed the following diets: Control diet (C). di巴i

∞

n凶凶ng5%

a r a m e

(A)， 0.75% ofO.lN HCJ extra(;t (Fl)， 2.2% of 1% NaCOj ex回ct(8)， 1.5% of insoluble contents (F3) and methanoLic extract eq山va1entsω511も

a r a m e

(M).

Vertica1 bars rcpresent lhe standard eπor of lhe mean.

* Significanl difference from the co附'01 ap < 0.05，ゆく0.01. 司"

'‑

その生理活性は同定されると思われるが，

れからも様々な化合物が海藻から分離，

海藻を摂取した

本研究の主題である食物繊維の生理活性と深く関わるものである.

∞

.!: 1000

。

Z ^{Q N}

、

E~ …v

e ^o ^b

∞ 334 ∞

32 ∞ 。

C A FIF2F3

E E

!

1117.0

60 6.5

A

FI F2F3

8.0

ミ

7.5

2 r •

<<:

υ

剖 7.0

食物繊維および低分子化合物の両方の影響さらに明確で有用な知見になると考えられる.

際の健康への影響に関する研究結果は，

が明らかにされることにより，

C M

150 ICぬ

却

120

u

官l

∞

ヒき即

5

ご 60 a ω ー‑

Q.; C 寸V

o

C A Fl F2F3

C M

a a

。 ^C

^AFI^F2F3

∞

2s1

却

二 g g

ご l

∞

e唱。a :.. c ₅₀

0 C M

F i g . 3 2

Effects of polysaccharides and methanolic extract of α

rame

00 cecal pH， ammonia and leveIs of plasma lipid in rats See

. r ∞

tnoles 01" Figs 22， 23叩d32.

7 1

70

t:IC

、、.

a 3 。

唱』 a圃. .

』

=

‑.b圃.

ー

。

^園

。

冨制

ー

8acteroid.aceae Eubacteria PeptococC8ceae 11 b 11 1I

10 10

9 9

8 8 9

7 7 7 8

6 6 6

5C A FI F2F3C M C AFIF2F3

C

ルf

Bltidobacteria Lactobacilli Streptococci

!I 11 IU 11

10 10 11

y 9 9 10

δ 8 8 9

7 7

。

₆ ₆

コCAFIF2f3 5 C A Fl F2F3C M _コC AFJ F:!F3 C M Enterobacteriaceae Total Ratio of bifidobacteria 11 11 12 50 to total viable counts 10 10

9 9 40

8 8 ^~30

7 7 20

6 6 10

5e AFl

F 2 F 3

_{C M} _コ_C AFl_F2F3 _{C M} _o_C_A_Fi F2F3C_M

Fig.33 E質問ofpolysaccharides組 dme出組olicextract of 翻

meon

cec

a 1 血

iao

f !

ora

i n

rats

See footnotes of Fig. 31. Values are m田nof log no. of viable COU1出土SE.

2.5 r 7.0 2.0ト ̲̲，‑y 6.5

[

，51

"

⁶^.⁰

S

^ME

z

⁵^目⁵

。

1.0 ^Q^，

。

5.0 0.5

4.5

0.0 0 12 24 36 ‑48

。

₁₂₂₄ ₃₆ _‑₄₈

Incobation time (h)

Fig.

34

Effect of

arame

methanolic extract on lactic acid bacteria

i n v i t r o

Bifido何CUriumbtFdurn‑8.breve aI1d tactobrUNIts acidophiHGs were lnCU

凶吋

inGAM1I2 (0.5% glucose) wi出(→ ー)or wo山oul( ‑0‑)

methanolic eXlraCl soJution of arame (1 %

v / v ) .

第

5

章

C l o s t r i d i u m ramosum によるラミナランからの分解生成物の腸内菌による利用

ラミナランは貯蔵多結額として褐藻類に含有される s‑1，3結合グルカンで，その硫酸化物は血液凝悶阻止作用や抗

撞寝込:性などの生理活性が報告されている

115) ラ

ミナランは食物繊維の中では腸内菌により分解されやすい物質とされる

加

が，第 1

章の実験で分解能を示したヒト腸内の菌株はBacteroides

ovatusと C l o s t r i d i w n 属の数種のみであった ( T a b l e2 ， 3 ) .しか

し第

3

章の実験でラットに

0

.4%また

は 2.0% ラミナラン食を 7 日間投与した場合，盲腸内の pH が顕著に低下，盲腸内容物の増加などラット富腸内フローラによる発酵が示されただけではなく，ラミナラン分解能を持たないと考えられる b i f i d o b a c t e r i a の菌数およびフローラ全体の総菌数に対する占有率(ピフィズス菌占有率)が増加する傾向を示した.

森下

116)

はセルロース分解能は B a c t e r o i d e ssuccinogenesや Rwninococus a l b u sなどの特定の菌種に認められるが，ラットに 15 %セルロース含有飼料を 7 週間与えた場合， b a c t e r o i d a c e a e や嫌気性球菌だけではなくセルロース分解能を持たない B i f i d o b a c t e r i w nも増加したことを示した.彼はこの堵加の原因としてセル

ロース分解菌によるセルロースの発酵状態が B i f i d o b a c t e r iumの発育を助けていると推察しいる.また， Akiya

工

na e t a 1 .

¹¹⁷^Jは

i n v i t r oにおいてアルギン酸のオリコ。精類が数種の B i f i d o b a c t e r i um の発育を促進することを示し，アルギン酸摂取の影響について森下と同様の考えを述べているが，実際に通常のヒトあるいは実験動物の腸内に存在する分解菌により菌体外に生成されるものか，検討すべき点がある.これらの報告は食物繊維の娯取による腸内フローラの改善のメカニズムを推察してお

り非常に興味が持たれるが，その実証が必要であると思われる.

本研究のこれまでの結果から

，

i n v i t r o ( T a b l e 4 ) においてセルロースは短期間ではヒト腸内菌によって発酵されないことや，アルギン酸もラミナランと比較する

と発酵されにくく，またラット盲腸内の pH の低下作用などからも，セルロースやアルギン酸よりもうミナランのほうが腸内フローラおよび、腸内環境に影響を及ぼしやすいと考えられる.上述したようにラミナランは食物繊維の中で発酵されやすい

ことは知られていたが，腸内フローラに対する影響を調べた例も本研究が品初であり，当然その分解物がBifidobacteriumをはじめその他の腸内菌種に及ぼす影響について検討した例もなかった.

そこで本章では，ヒト腸内のラミナラン分解菌による分解生成物が，ラミナラン分解能を持たない他の腸内菌，特に Bifidobacteriumの発育に与える影響をわ vitroで調べた.

実験材料および方法

供託菌株

第

1

章で用いた菌株

( T a b l e3 )

の中から，脇・内の代表的なラミナラン分解菌としてClostridiumramos^{山刀}

ATCC25582

およびBacteroidesovatus

HAN5

を用いた.ラミナラン分解能を持たない代表的な菌株としては

T a b l e18

に示した

1 1

菌種を用いた.供試菌株は全て

GAM1

で

37

'C，

24 h

前培養後，実験に用いた.

C .

ramosumおよび B.ovatusによるラミナランの資化性

ラミナラン(東京化成)を

2 . 0%

含む

G

必

t f l /2

を試験管に

10r r u ずつ調製し，

前培養したC.

ramos

ωη

または B.ovatusの菌液を 0 . 4 r n lずつ接種した.スチー

ルウール法を用い

3 7

'cで培養し，

0 ， 6

，

12 および 24h で培養を止め，第 l

なと同様の方法で培養液の

pH

および濁度

( 6 0 0

nm)を測定し，発酵能の強い菌株をラミナラン分解菌として以下の実験に用いた.

ラミナラン分解物の調製

ラミナランを

2 . 0 %

含む

GAM1/2

を

200 ml ずつ三角フラスコ 4 個に調製

し

GAM1

で前培養したラミナラン分解歯の構益液を

2 r r u

ずつ接種した.フラスコ内

を無酸素

CO z

ガス置換後，ブチルゴム絵をして

37

'cで培養した.培養開始

0

，

6 . 12

および

24h

後の培養液を逮心分離

( 1 0

，

000rpm

1 5 r n i n )

し，上前について

pH

を

1N

水酸化ナトリウムで

7 . 0 に調製した.その後，沸騰水中で 5 r n i n

加熱し酵素を失活させ，冷却後孔径

0 . 22μm

のフィルターでろ過滅菌し，ラミナラ

ン分解物を含む溶液とした.対照としてラミナランを含まない

GAM1/2

を用いて同様の調製を行った.

74 ラミナラン分解物の活性炭吸着クロマトグラフィー

培養液中の単糖，て新および二橋穎を活性炭吸宕クロマトグラフィ一切を川いて確認した.すなわちクロマトグラフ用活性炭ぷ(和光純薬)を充填した7

mrn

1 3 0 mrn

のカラムに試料

0 . 5ml

を注入し，移動相として

O . 5

，

1 0

および

1 5 %

/

v)エタノールを順次

30 ロ U

流し，熔出液を

2 r r u

ずつ分取し，フェノール硫隊法制により糖を検出した.*な

t

副組詰紡!5i猿煩

i

の打抗杭s;p1

ス

( α I C N

Biochernical) およびラフイノ一ス(和光純薬)を各滞籾精:~f2g

/

1 合む/木k治.

液を則いた.

代表的な腸内菌によるラミナラン分解生成物の利用

上記のように調製したラミナラン分解坐成物を含む溶液

5ml

をfrilほの

GAM1

に加えたものを試験培地とした.これに前応益したヒトの代表的な腸内的株の菌液

0 . 2

ml を接種し，無般素 CO~ ガス罰換後 37 'cで培養し，

0

，

12

，

24

および

48h

培養した.培養後，濁度

(600nm)

および

pH

を調べラミナラン分解生成物の利用能を検討した.

結果

ラミナラン分解菌による資化性

C. ramosumおよび B.ovatusの発育および培養液の

pH

に対するラミナランの影響を

Fig.35

に示した.

r

Jii簡妹の的益液ともラミナランの存在により濁j変が噌加

し

pH

が低下したが，

C .

r.^釘

ηos

山ηでより顕著で

pH

は

4 . 5

(対照は

5 . 7 )

まで低下し，濁度は対照の

2 " ' 3

倍の値をボした.この結果より以下の実験にはラミナラン分解菌としてC.re1I

ηos

山

η

を用いた.

ラミナランからの単糖およびオリゴ糠の生成

C. ramoswη培溶液中の市粕¥ー結および、二三糖について活性炭クロマトグラフィーを用いて調べた結果を

Fig.36

に示した.

2%

ラミナラン含有借地において応益

1 2 h

後に培養液(菌体外)に

48 8

の供成が，

24h

後に二糖および単糖知が

l L :

成され，三結類は減少していることがぷされた.ラミナランを合有しない崎地ではこれ

らの糖類は検出されなかった.

75

代表的な腸内菌によるラミナラン分解生成物の利用

ヒトの代表的な腸内菌株の

C .

rmηos山ηによるラミナラン分解生成物の利用能を t~益後の濁度から判定した結来を Table

1 8

に示した. C. ramos

ωn

を崎益して

12 h

後の生成物を

1 1

株中

7

株が.

24h

後の生成物を

1 1

株中

8

妹が利用能を示し，

24h

後の生成物がより強く腸内菌の発育を促進させた.特に Bifidobacteri

um b i f i

^・

dum.B . a d o l e s c e n t i s .

Enterococcus faeduIn， Peptostreptococcus

productus

など，乳酸を生成する的

i

f1!に強く発酔され，発育を促進させることがぷされた

( F i g . 3 7 ) . Bifodobacterium

でも

B.longum

には利用能は認められなかった.また，

Bacteroides v

u1g

atus

および

E .

coliにも利用能は認められなかった.

考察

第

3

章および第

4

章の実験で，ラットに市販のラミナランまたはアラメから抽出した粗ラミナランを投与した場合，ラミナラン分解菌を合むと推察される(第 1

1 3

のin

v i t r o

の実験結果から)

b a c t e r o i d a c e a e

以外に，加ぱ

t r o

ではラミナラン発酵:

能を示さなかった

b i f i d o b a c t e r i a

が盲腸内で増加傾向あるいは有意な地加を示した

( F i g . 2 9 . 3 3 )

.また，同様の影響が低分子主主アルギン酸ナトリウム(A

G5)

^でも示された

( F

氾

. 3 0 . 3 3 )

.森下11白}はラットに

15%

セルロース含有食を

7

週間投与

した場合に

b i

^白

d o b a c t e r i a

が期加したことについて，セルロース分解菌の菌体表面または菌体外に生成されたオリゴ糖を，他の菌群よりもオリゴ糖による摺殖促進を受けやすい

b i f i d o b a c t e r i a

が優先的に利用しているのではないかと説明した.若者者

.

もラミナランや

AG5

による

b

凶

i f

抗

i d o b a c t e

^釘

r i

泊

a

の増加の理由について第

3

章4宅号

儀の

J

身雪えを述ぺた.

本実験でC.

ramos

山ηはラミナランを強く発酵し，第

l

章でヒト糞便をt忠義した場合

( T a b l e 5 )

の結果と一致しており，

B.ovatus

による発酵はC.

r a . r

os

山ηほ

ど顕著ではなく，ラット盲腸内容物を培益した結果

( T a b l e7 )

^{と一致していた.}

l

財内でどちらが優勢なラミナラン分解的となるかで

H

易内環境や宿主に対する彫響も見なってくると考えられるが，本実験ではより強く，ヒト糞便と同慌の発酔性を示したC.

r a . r

^刀

o s

山

η

によるラミナラン分解物について検討した.その結果.

t

苦主主

1 2h

7 6

後に三糖類の作在が認められ.24h 後にはより低分子量の一二糖類，単純~iの生成が認められ，三糖類は極端に減少していた.データはボしていないが，さらに応益を長時間延長した場合にはこれらの惟糖およびオリゴ糖類は検出されなくなるため，

C . r a . r η o s ω η

によって速やかに矩鎖脂肪綾などに代謝されるものと考えられる.

この培養

1 2 h

および

24h

後に的体外に生成された分解物が.in vitroにおいてラミナランを発酵できないいくつかの的拘が利用した.とくに Bifidobacterium

bifldum

および

B .

adolescentisによる明{確な利用能を示した本結果は，

I

ニ

i l l

の持者，また森下の仮説を説付けるものである.

腸内にはアルギン殴分解的が仔白し，アルギン酸のオリゴ糖が BifidobacteriU^l^T¹ の発育を促進することが報告されている.17)にもかかわらず，第

3

草の実験では尚粘・度のアルギン酸ナトリウム

(HAG)

投与では

b i f i d o b a c t e r i a

の増加などは認められず，低分子量で粘性の低いアルギン酸ナトリウム

(AG5)

のみが

b i f i d o b a c t e r i a

菌数およびピフィズス菌占有率の増加傾向，顕著な盲腸内

pH

の低下を示した.この相違の原因として，

HAG

はその粘性のため盲腸内での発酵条件を変えたことと，

AG5

の方が低分子であるため分解速度が

HAG

よりも速いことが考えられる

.

本章の実験で用いた市販のラミナランは，アラメ由来で主に

s‑

グルカンのみで構成されており78) (海首長粍によっては・部の選元末端にマンニトールが結合してい

る場合もある)， C. r81η

os

^山η1(1益液t[Jに生成されたオリゴ糖は，グルコースのみから情成されるラミナリピオースとラミナリトリオースであると考えられる.

HAG

についても投与期間を森下らの実験のように長期にすれば.

AG5

と同様の京

l l i J 4 4

がれ}

られると思われるが，ラミナランの織成結であるグルコースからなるオリゴ糖と，

アルギン援の構成糖であるマンヌロン酸やグルロン酸冷却からなるオリゴ精

( F i g . 38)

では，前者のほうが腸内摘に資化されやすいと考えられ，腸内での発僻:やjお内環境に対する作用の発現も速く，また顕著であると考えられる.

以上の結果からラミナランの棋1&による腸内フローラ，また腸内フローラを介した宿主へ及ぼす影響については以下のように推察される

( F i g .39). r

^{版取された}

ラミナランは大腸あるいは首!湯まで到達し .

B a c t e r o i d e s s p p .

や Clostridium

s p p .

などの一部の細菌によって分解され，的体外あるいは菌体表面にその

t t t

糖やオリゴ糖などが生成される.この~-粕やオリゴ結などはラミナラン分解幽 l可身ももちろん利用するが，オリゴ糖穎によって発汗支持を受けやすい

Bi

万

dobacterium

も活性化され腸内フローラのバランスが改善される.さらに，その発酵によるた鎖脂肪酸の

77

ドキュメント内海藻および海藻多糖類の腸内菌への影響に関する研究 (ページ 39-44)

c

︒ ︒

ω

a

z u

.

.

F i g . 3 1 Ef

arame

，

a 1 ，

∞

a r a m e

a r a m e

本研究の主題である食物繊維の生理活性と深く関わるものである.

∞

。

、

e o b

∞ 334 ∞

32 ∞ 。

E E

!

A

ミ

2 r •

υ

食物繊維および低分子化合物の両方の影響 さらに明確で有用な知見になると考えられる.

C M

u

∞

ヒ き 即

5

o

C M

。 C

∞

2s1

二 g g

∞

F i g . 3 2

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. r ∞

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=

ー

。

。

。

ー

C

。

F 2 F 3

meon

a 1 血

f !

i n

"

S

z

。

。

。

34

arame

i n v i t r o

凶吋

v / v ) .

5

C l o s t r i d i u m ramosum によるラミナランからの 分解生成物の腸内菌による利用

ラミナランは貯蔵多結額として褐藻類に含有される s‑1，3結合グルカンで，そ の硫酸化物は血液凝悶阻止作用や抗

撞寝込:性などの生理活性が報告されている

ミナランは食物繊維の中では腸内菌により分解されやすい物質とされる

が，第 1

ovatusと C l o s t r i d i w n 属の数種のみであった ( T a b l e2 ， 3 ) .しか

3

0

e ^o ^b

食物繊維および低分子化合物の両方の影響さらに明確で有用な知見になると考えられる.

ヒき即

。 ^C

C l o s t r i d i u m ramosum によるラミナランからの分解生成物の腸内菌による利用

ラミナランは貯蔵多結額として褐藻類に含有される s‑1，3結合グルカンで，その硫酸化物は血液凝悶阻止作用や抗

ロース分解菌によるセルロースの発酵状態が B i f i d o b a c t e r iumの発育を助けていると推察しいる.また， Akiya

i n v i t r o ( T a b l e 4 ) においてセルロースは短期間ではヒト腸内菌によって発酵されないことや，アルギン酸もラミナランと比較する