Glyco-Biomarkers for novel Diagnosese and Regenerative Medicine

GlycoStation

TM

_{Reader 1200}

LecChip

TM

Gold Standard

糖鎖プロファイリング

テクノロジープラットフォーム

:

GlycoStation

TM

レクチンマイクロアレイ

:

糖鎖は細胞の顔

:

生命は糖鎖なしでは存在し

ない

Alberts et al. (eds.) Molecular biology of the cell (3rd ed.) p.502

P.M.Rudd et al., J. Mol. Biol. 293, 351-366

癌

免疫

再生医療

感染症

80% の分化マーカーは糖

鎖抗原です。

ex. SSEA-3,

TRA-1-60

感染症のターゲット分子

の多くが糖鎖抗原です。

ex. インフルエンザウイル

スとシアル酸

●ヒトのタンパク質の50%以上が糖鎖修飾を受けている。

●糖鎖構造は、生命の発生、分化、癌化などで大きく変化する。

●組織毎に糖鎖構造は異なり、そしてまたそれは種によっても異なる。

●個々人の間でも幾つかの糖鎖構造は異なる (たとえば, A, B, O血液型)

●それ故、医療行為におけるほとんどの現象には糖鎖の構造変化が何らかの形で関係していると言って過言

ではない。

どうして糖鎖は重要なのか

?

腫瘍マーカーの

70% 以上は糖鎖抗原。

ex)CA19-9, CA125

免疫系には多くの糖鎖抗原

が関与している。

ex. NKT細胞と糖脂質抗

原

Ga

in115

133

mS

ec

1000

500

250

125

62.5

(ng/mL)

クルードサンプルの糖鎖プ

ロファイリング例

:

ラットの組織

肝臓と脳から抽出したタンパク質

で次の糖鎖構造で大きな違いが

見られる

・

Sia

a

2-6

・

T-antigen

GlycoStation

TM

_{は、スライドグラス上に}

固定化された多数のレクチンを持つマイク

ロアレイ

(“

LecChip

TM

”)に蛍光ラベリング

を行ったタンパク質溶液をアプライし、蛍

光画像を取得する。レクチンが認識する

糖鎖エピトープ情報を元に、糖鎖のプロ

ファイリングを行うシステムの名称である。

得られた蛍光画像は、専用の解析ソフト

GlycoStation

TM

_{Tools Pro}

_{を用いて解}

析される。

Lectin

n

レクチンアレイを使って、糖鎖構造のバイオロジ

カルなプロファイリングを行う

Evanescent-field fluorescence-assisted lectin microarray: a new strategy for glycan profiling,

A. Kuno, J. Hirabayashi et al., Nature Methods, vol2, No.11, November (2005) pp851-856

LecChip™

LAA07B00701

アレイ表面の洗浄操

作なしに、ダイレクトに

液層から蛍光画像を

取得する。

得られた蛍光

画像

45 種類のレクチンが3重に固

定化されている

固定化パターン

LecChip

TM

_ver.1.0

Fuc

Sia

O-Glycan

Asialo

Agalacto

High-Man

Gal

Chitin

Others

Branch

LecChip™ Ver.1.0

LTL

1

PS

A

2

LC

A

3

U

EA

_I

4

AO

L

5

AA

L

6

M

AL_

I

7

SNA

8

SS

A

9

TJ

A-I

10

PH

A(

L)

1

1

EC

A

12

RC

A1

20

1

3

PH

A(

E)

1

4

D

SA

1

5

GS

L-II

1

6

NP

A

17

Co

nA

1

8

GN

A

19

H

H

L

20

AC

G

21

TxLC

_I

2

2

BP

L

23

TJ

A-II

2

4

EE

L

25

AB

A

26

LE

L

27

STL

28

U

D

A

29

PW

M

3

0

Ja

ca

lin

3

1

PNA

3

2

W

FA

3

3

AC

A

34

M

PA

3

5

H

PA

3

6

VV

A

37

D

BA

3

8

SB

A

39

Ca

ls

ep

a

40

PTL_

I

41

M

AH

4

2

W

GA

4

3

GS

L_

I_

A4

4

4

GS

L_

I_

B4

4

5

M

ar

ke

r

46

BG

47

CV

1

0.95

0.9

0.85

0.8

0.75

0.7

0.65

0.6

0.55

0.5

0.45

0.4

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0

LecChip

TM

_{: 世界TOPクラスの性能を誇るプロテイン（レクチン）アレイ}

Good control of the shape of

each spot and the CV-value

CV value

Configuration

45 species, 3 spots per lectin

Number of

Lectins

7 wells on a slide glass, well volume=100

m

L

Number of Wells

- 20

o

_C

Storage Condition

Approx. 180 days

Storage Life

<20% (over all)

LecChip

TM

Ver.1.0

CV=20%

糖鎖

/レクチン:

K

d

10

-4

〜

10

-7

M

抗原

/抗体: 10

-6

〜

10

-9

M

アビジン

/ビオチン： 10

-12

M

Lectin

Glycan

Washing

Interaction between glycan and lectin is so weak

Lose binding

3-4 nm

4-6 nm

エバネッセント波蛍光励起：

高感度で使いやすい

Edited by M. Yamada, 8/21/2007 Lectin No. Lectin Reported specificity

1 LTL Fuca1-3Gal1-4)GlcNAc, Fuca1-2Gal1-4GlcNAc 2 PSA Fuca1-6GlcNAc, a-D-Glc, a-D-Man

3 LCA Fuca1-6GlcNAc, a-D-Glc, a-D-Man 4 UEA-I Fuca1-2Gal1-4GlcNAc

5 AOL Fuca1-6GlcNAc (core fucose)

6 AAL Fuca1-6GlcNAc, Fuca1-3(Gal1-4)GlcNAc 7 MAL Siaa2-3Gal1-4GlcNAc

8 SNA Siaa2-6Gal/GalNAc 9 SSA Siaa2-6Gal/GalNAc 10 TJA-I Siaa2-6Gal/GalNAc

11 PHAL tri/tetra-antennary complex-type N-glycan 12 ECA Gal1-4GlcNAc

13 RCA120 Gal1-4GlcNAc

14 PHAE bi-antennary complex-type N-glycan with outer Gal and bisecting GlcNAc 15 DSA (GlcNAc1-4)n, Gal1-4GlcNAc

16 GSL-II agalactosylated tri/tetra antennary glycans, GlcNAc 17 NPA High-Mannose, Mana1-6Man

18 ConA High-Mannose, Mana1-6(Mana1-3)Man 19 GNA High-Mannose,Mana1-3Man

20 HHL High-Mannose,Mana1-3Man, Mana1-6Man 21 ACG Siaa2-3Gal1-4GlcNAc

22 TxLCI Mana1-3(Mana1-6)Man, bi- and tri-antennary complex-type N-glycan, GalNAc 23 BPL Gal1-3GalNAc, GalNAc

24 TJA-II Fuca1-2Gal1-> or GalNAc1-> groups at their nonreducing terminals 25 EEL blood group B antigen,Gala1-3Gal

26 ABA Gal1-3GalNAc 27 LEL GlcNAc trimers/tetramers

28 STL GlcNAc oligomers, oligosaccharide containing GlcNAc and MurNAc 29 UDA GlcNAc1-4GlcNAc, Mixture of Man5 to Man9

30 PWM (GlcNAc1-4)n 31 Jacalin Gal1-3GalNAc, GalNAc 32 PNA Gal1-3GalNAc

33 WFA GalNAc1-4GlcNAc, Gal1-3(-6)GalNAc 34 ACA Gal1-3GalNAc

35 MPA Gal1-3GalNAc, GalNAc 36 HPA a-linked terminal GalNAc

37 VVA a-linked terminal GalNAc, GalNAca1-3Gal 38 DBA blood group A antigen, GalNAca1-3GalNAc 39 SBA a- or -linked termincal GalNAc, GalNAca1-3Gal 40 Calsepa Mannose, Maltose

41 PTL-I a-linked terminal GalNAc 42 MAH Siaa2-3Gal1-3(Siaa2-6)GalNAc 43 WGA chitin oligomers, Sia

44 GSL-I A4 a-linked GalNAc 45 GSL-I B4a-linked Gal

Remarks) These data were collected from lectin vendors and reports found by internet searches.

特徴的な糖鎖結合性を有する

45 種

類のレクチン（主に天然型）が固定化

されている

10,000種以上の相互作用をカバーする

lectin-glycan affinity (FAC) データベースが2009年8月

19日に公開された。

Glycoprotein

Glycolipid

Endogenous lectin/

Receptor

(抗体オーバーレイ法も)

生きた細胞表面を

そのままに

細胞や組織から抽出

されたタンパク質

Cultured cells

精製されたタンパク質

各種サンプルが取り扱える

糖タンパク質溶

液

蛍光ラベリング

レクチンアレイ

スキャン、数値

化

071227_Gain85_E00133_LAA07C00802_155253_well5 071227_Gain85_E00133_LAA07C00805_162416_well5 LT L 1 PS A 2 LC A 3 U EA _I 4 A OL 5 A A L 6 M A L_ I 7 SN A 8 SS A 9 TJ A -I 1 0 PH A (L ) 11 EC A 1 2 R CA 12 0 13 PH A (E ) 1 4 D SA 1 5 G SL -I I 16 N PA 1 7 Co nA 1 8 G N A 1 9 H H L 20 A CG 2 1 Tx LC_ I 22 BP L 23 TJ A -II 2 4 EE L 25 A BA 2 6 LE L 27 ST L 28 UD A 2 9 PW M 3 0 Ja ca lin 3 1 PN A 3 2 W FA 3 3 A CA 3 4 M PA 3 5 H PA 3 6 VV A 3 7 D BA 3 8 SB A 3 9 Ca ls ep a 40 PT L_ I 41 M A H 4 2 W G A 4 3 G SL _I _A 4 44 G SL _I _B4 4 5 M ar ke r 4 6 BG 4 7 N et In te ns ity 65,000 60,000 55,000 50,000 45,000 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000 0 071227_Gain85_E00133_LAA07C00802_155253_well5 071227_Gain85_E00133_LAA07C00805_162416_well5 LT L 1 PS A 2 LC A 3 U EA _I 4 A OL 5 A A L 6 M A L_ I 7 SN A 8 SS A 9 TJ A -I 1 0 PH A (L ) 11 EC A 1 2 R CA 12 0 13 PH A (E ) 1 4 D SA 1 5 G SL -I I 16 N PA 1 7 Co nA 1 8 G N A 1 9 H H L 20 A CG 2 1 Tx LC_ I 22 BP L 23 TJ A -II 2 4 EE L 25 A BA 2 6 LE L 27 ST L 28 UD A 2 9 PW M 3 0 Ja ca lin 3 1 PN A 3 2 W FA 3 3 A CA 3 4 M PA 3 5 H PA 3 6 VV A 3 7 D BA 3 8 SB A 3 9 Ca ls ep a 40 PT L_ I 41 M A H 4 2 W G A 4 3 G SL _I _A 4 44 G SL _I _B4 4 5 M ar ke r 4 6 BG 4 7 N et In te ns ity 65,000 60,000 55,000 50,000 45,000 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000 0

解析

30~60 min.

90 min. (incl. 60 min incubation)

3~20 h incubation

About 15 min.

実例

: CHO vs. Lec1 mutant cells

CHO - Chinese hamster ovary

Lec1 mutant -

GlcNAc-T1をノックアウト

=> N型糖鎖の糖鎖修飾に大きな変化が起こる

GlcNAc

Glc

Man

Gal

Sia

GlcNAc-T1

L

ecti

n

I

n

ten

si

ty

CHOに比べてLec1では

･ 複合型N型糖鎖

↓

･ シアル酸

↓

･ ガラクトース

↓

･ マンノース

↑

Lectin Intensity

L

ecti

n

I

n

ten

si

ty

Lectin Intensity

どんな変化が見られるの

?

(A) A scheme of total procedures, (B) Scan images of brain glyoblastoma, stomach adenocarcinoma, colon normal control (N), and

adenocarcinoma (T), and (C) The obtained profiling patterns were normalized by a lectin showing the maximum intensity in each case;

UDA for brain glyoblastoma, stomach adenocarcinoma and adenocarcinoma (T), and STL for colon normal control (N).

パラフィン固定化組織切片からの糖鎖プロファイリング

超高感度

:

わずか

500個の細胞

から右図のようなき

れいな蛍光画像が得

られる。

0 1 2 3 4 5 6 L T L 1 PSA 2 L CA 3 UEA _I 4 AO L 5 AA L 6 MA L _I 7 S NA 8 S S A 9 T JA-I 10 PHA(L ) 11 ECA 12 R CA 120 13 PHA(E) 14 D S A 15 G S L -I I 16 NPA 17 _{ConA 18} GNA 19 HHL 20 AC G 21 T xL C_I 22 _BPL 23 T JA-II 24 EEL 25 ABA 26 LEL 27 S T L 28 UD A 29 PWM 30 Jaca lin 31 PNA 32 WFA 33 AC A 34 MPA 35 HPA 36 VV A 37 D B A 38 S B A 39 Cal sep a 40 PTL _I 41 MA H 42 WGA 43 G S L _I _A 4 44 G S L _I _B 4 45 Mark er 46 _BG 47 No rm al is ed Net I nt ens it y(Al l S p ots ) NKNT-3 NKNT-3/3-9-2

規格化されたデータ

培養液中へ分泌されたタンパク質からの糖鎖プ

ロファイリング

Courtesy of Dr. H. Nakabayashi, Hokkaido Information Univ.

NKNT-3: 正常株

NKNT-3/3-9-2: 癌化した株

O型糖鎖に明瞭な違い

Drs. H. Tateno, J. Hirabayashi et al. Glycobiology, vol17, No.2, pp.1138-1146, (2007)

生きた細胞表面の糖鎖

プロファイリング

Cell-Tracker Orange CMRA を

細胞全体をラベリングするために

使用する

LecChip

TM

Lec1： Lack the glycosyltransferase termed GlcNAc-TI, which produces incomplete

intermediates of N-linked carbohydrates

Lec2： Sia-transporter mutant, unable to transport CMP-sialic acid into the golgi compartment

Lec8： Gal-transporter mutant, unable to transport UDP-galactose into the golgi compartment

どんな複雑な糖鎖であっても

(混合物であってさえ), GlycoStationは、タンパ

ク質から糖鎖を切出すことなく、糖鎖のエピトープイメージをハイスループット、高

感度、高精度で解析することができる。

・

GlycoStationのメリット

洗浄操作なし（高い再現性）

実時間液層計測が可能

どんな弱い相互作用も見逃さない missing any weak interactions

N型糖鎖もO型糖鎖も

異性体

・超高感度（

LOD)

100pg/mL

糖タンパク質

100pM

糖鎖

10

3

_細胞

・クルードサンプルも可能

・高い汎用性と広い応用性

N. Uchiyama et al., Proteomics 2008, 8, 3042-3050

Specs.

Appendix

Light source

metal halide lamp: 350W

durability： >1500 hours (60% of

initial intensity）

Fluorescent label

Cy3 etc.

wavelength is selected by a filter

Control PC

internal high performance PC, Windows XP

Function

resolution

5

m

m

scanning, automatic scanned data saving

scanning time: 2min./slide

（ exposure time: 34msec）

variable exposure time

33.3msec～34. 3sec

variable camera gain

1～127 （25

o

_{C、Max.: 1000Gain)}

continuous scanning

acquisition of scanning pictures at

different gain

hour indicator

life time of metal halide lamp

External terminal

USB2×3, LAN（1000M）×1, VGA×1, Mouse,

key board terminal

Input Voltage

AC100V-240V 50/60Hz

Power Consumption

650W (body) 450W (light source)

Size of outward form

W440×D592×H585 (mm) (body)

W170×D340×H225 (mm) (light source)

Weight

70kg (body), 8.5kg (light source)

GlycoStation

TM

_{Reader 1200}

_{は、GlcyoStationを構成するスキャナー。エバネッセン}

ト波蛍光励起法を使用し、ハイスループットで高感度にレクチンマイクロアレイ (“LecChips”) をスキャンすることができる。

High power white light source

Wavelength is selected by a filter

World fastest scanner: < 2min.

High resolution 5

m

m

GlycoStation

TM

_Reader

Method

Mass Spectrometry

HPLC

Lectin Microarray

Protocol

Glycan cleaving from Protein by

_PNGase

Glycan cleaving from protein by

_PNGase

No glycan cleaving from protein

Purification of cleaved glycans

Gel Filtration

Cy3 labeling and Gel Filtration

PA labeling and Gel Filtration

PA labeling and Gel Filtration

Incubation on Lectin Microarray

Mass Spectroscopy

Separation by

_{DEAE(Diethylaminoethyl) Column Fluorescence Image Scan}

Data analysis and matching

Separation by ODS(Octadecyl

_{Silane)Column}

Data Analysis (differential analysis)

Separation by Amide Column

Data analysis and matching

Protein

100

m

g

100

m

g

1

m

g ~ 10ng Order

Glycan

only N-glycans

only N-glycans

both N- and O-glycans

limited performance for O-glycans limited performance for O-glycans

Isomers

Poor

So-So

Very GOOD

Structure Analysis GOOD (difficult in isomer

_{identification)}

GOOD (depend on database size)

Epitope Profiling (not definite

identification of detailed glycan

structure)

Processing time

2days

4days

3hours (except for incubation time)

Price

~US$1M

~US$200,000

20 HHL Conc. (ng/mL) 10 100 1,000 10,000 100,000 1,000,000 N et I nt en si ty 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000 0 24 TJA-II Conc. (ng/mL) 10 100 1,000 10,000 100,000 1,000,000 Net I nten si ty 50,000 40,000 30,000 20,000 10,000 0 27 LEL Conc. (ng/mL) 10 100 1,000 10,000 100,000 1,000,000 Net I nten si ty 80,000 70,000 60,000 50,000 40,000 30,000 20,000 10,000 0

競合法

は、蛍光ラベリングが難しいサンプルの場合に

使用できる。 たとえば、

GAG, 糖脂質 etc.

標識されていない分子

蛍光標識されたプローブ

解析ソフト

GlycoStationToolsPro 1.5

数値化ソフト

SignalCapture 1.1

GlycoStation™ToolsPro Suite 1.5

・糖鎖プロファイリング用の専用ソフト

Main Window

Gain marging

Graph window

Binding Curves window

Option

setting

1. バイオ医薬品やその発現細胞の糖鎖プロ

ファイリング

2. 糖鎖マーカーの探索とその検査キット開発

3. 幹細胞やその分化細胞のキャラクタリゼー

ション

4. 病理学的応用

主なアプリケーション例

!!

バイオシミラー

FDAがこの3月10日に、GlycoStationを用いた抗体医薬品

Lei Zhang et al., MABS, 2016, Vol.0, No.0, 1-11, http://dx/doi.org/10.1080/19420862.2015.1117719

LecChipの特徴は、糖鎖を切り出す必要がなく、ごく単純なプロセス（蛍光標識のみ）で糖鎖解析ができるということ、

更に、ハイスループットで糖鎖のエピトーププロファイリングができること、異性体判別が容易であること、O-型糖鎖の

解析ができることも大きなメリットとして謳われています。

Lei Zhang et al., MABS, 2016, Vol.0, No.0, 1-11, http://dx/doi.org/10.1080/19420862.2015.1117719

Erythropoietin（EPO）

Epoietin

a

(ESPO, Kirin Pharma)

Epoietin



(EPOJIN, Chugai Pharma)

Danbepoietin

a

(NESP, Kirin Pharma)

赤芽球系前駆細胞に作用し、赤血球への分化、増殖を刺

激する造血因子。

現在、腎性貧血及び自家血輸血の適応で、臨床の場で

用いられている。

各社は、CHO細胞を用い、遺伝子組み換え型EPO

（rhEPO）を生産し、注射用製剤として販売している。

「NESP®」はhEPOのアミノ酸配列の一部を変更し、新たな糖鎖を

付加させた新規の貧血治療薬。

従来のEPO製剤と比べて、持続的な赤血球増加作用を発揮します。

その結果、これまでより少ない投与頻度で貧血改善効果を示す特

長を有しています。

Danbepoietin

a

(NESP, Kirin Pharma)

第

2世代 EPO の出現

rhEPO

NESP

Asn 24

Asn 30

Asn 38 Asn 83

Asn 88

Ser 126

Asn 24

Asn 38 Asn 83

Ser 126

:O-glycan

:N-glycan

:Sialic Acid

（

Pharmacological and clinical profiles of long-lasting erythropoietin（darbepoetin alfa;NESP®）,

Nobuo Nagano,日薬理誌(Folia Pharmacol,Jpn.)131, 291～299）

rhEPO

NESP

30,400Da

分子量

37,100Da

14

最大シアル酸側鎖数

22

40%

糖鎖の割合

51%

高い

受容体結合親和性

低い

短い

血中消失半減期

長い

弱い

造血効果

強い

rhEPO と NESPの違い

LTL

1

PS

A

2

LC

A

3

U

EA

_I

4

AO

L

5

AA

L

6

M

AL_

I

7

SNA

8

SS

A

9

TJ

A-I

10

PH

A(

L)

1

1

EC

A

12

RC

A1

20

1

3

PH

A(

E)

1

4

D

SA

1

5

GS

L-II

1

6

NP

A

17

Co

nA

1

8

GN

A

19

H

H

L

20

AC

G

21

TxLC

_I

2

2

BP

L

23

TJ

A-II

2

4

EE

L

25

AB

A

26

LE

L

27

STL

28

U

D

A

29

PW

M

3

0

Ja

ca

lin

3

1

PNA

3

2

W

FA

3

3

AC

A

34

M

PA

3

5

H

PA

3

6

VV

A

37

D

BA

3

8

SB

A

39

Ca

ls

ep

a

40

PTL_

I

41

M

AH

4

2

W

GA

4

3

GS

L_

I_

A4

4

4

GS

L_

I_

B4

4

5

M

ar

ke

r

46

BG

47

No

rm

al

iz

ed

I

nte

ns

ity

(Ne

t

In

te

ns

ity)

280

260

240

220

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

ESPO Kirin（62.5ng/mL）

EPOJIN Chugai（62.5ng/mL）

＊

Normalized by UDA

このふたつの製品

, rhEPOs, は非常に類似した糖

鎖プロファイルを示す、が若干フコシル化に違いがあ

る

(see

AAL

).

LTL

1

PS

A

2

LC

A

3

U

EA

_I

4

AO

L

5

AA

L

6

M

AL_

I

7

SNA

8

SS

A

9

TJ

A-I

10

PH

A(

L)

1

1

EC

A

12

RC

A1

20

1

3

PH

A(

E)

1

4

D

SA

1

5

GS

L-II

1

6

NP

A

17

Co

nA

1

8

GN

A

19

H

H

L

20

AC

G

21

TxLC

_I

2

2

BP

L

23

TJ

A-II

2

4

EE

L

25

AB

A

26

LE

L

27

STL

28

U

D

A

29

PW

M

3

0

Ja

ca

lin

3

1

PNA

3

2

W

FA

3

3

AC

A

34

M

PA

3

5

H

PA

3

6

VV

A

37

D

BA

3

8

SB

A

39

Ca

ls

ep

a

40

PTL_

I

41

M

AH

4

2

W

GA

4

3

GS

L_

I_

A4

4

4

GS

L_

I_

B4

4

5

M

ar

ke

r

46

BG

47

No

rm

al

iz

ed

I

nte

ns

ity

(Ne

t

In

te

ns

ity)

300

280

260

240

220

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

ESPO Kirin（62.5ng/mL）

NESP Kirin（62.5ng/mL）

＊

Normalized by UDA

NESPに特徴的な糖鎖構造が PHA(L), LEL and STL

に現れている

PHA(L)

: 4分岐N型糖鎖

LEL

: ポリラクトサミン

STL

: GlcNAc

N型糖鎖の末端は強くシアル酸修飾を受けている

(see

MAL_I

:

a

2-3Sia)

フコシル化に違いが見られる

(see

AAL

).

• h-IgGにおける糖鎖構造

– 2本のN型糖鎖を持ち（H鎖, C

_H

2）, 立体構造を保つ為にも重要

– 糖鎖構造は多様性を持つ、即ち非常に不均一だが、健常人ではその存在相

対比率は安定している

• 治療用製剤としてのIgG

– ADCC活性

core Fucを除去すると100倍ADCC活性up.

協和キリンのポテリジェント技術

V

_H

C

H

1

C

_H

2

C

_H

3

C

_L

V

_L

L-chain

H-chain

Fc region

β1-α2-6

α2-6

β1-4

β1-4

β1-2

β1-2

β1-4

α1-3

α1-6

β1-4

α

1

-6

Asn

β1-4

β1-α2-6

α2-6

β1-4

β1-4

β1-2

β1-2

β1-4

α1-3

α1-6

β1-4

α

1

-6

Asn

β1-4

Clone-1

Clone-2

Clone-3

Clone-4

Clone-5

Clone-6

Clone-7

Clone-8

Clone-9

Clone-10

Clone-11

Clone-12

Clone-13

Clone-14

Clone-15

Clone-16

望ましい糖鎖構造にチューニングする

分泌タンパク質から

R&D回転の高速化

・最適なクローンの選定

・培養条件のチューニング

β 1 -

α 2 - 6

α 2 - 6

β 1 - 4

β 1 - 4

β 1 - 2

β 1 - 2

β 1 - 4

α 1 - 3

α 1 - 6

β 1 - 4

α

1

- 6

Asn

β 1 - 4

β 1 -

α 2 - 6

α 2 - 6

β 1 - 4

β 1 - 4

β 1 - 2

β 1 - 2

β 1 - 4

α 1 - 3

α 1 - 6

β 1 - 4

α

1

- 6

Asn

β 1 - 4

GTAJ14-1_Gain105_E00299_Cy3_i_2

g

f

e

d

c

b

_g

_f

_e

_d

_c

_b

GTAJ14-2_Gain105_E00299_Cy3_i_4

LTL

1

PS

A

2

LC

A

3

U

EA

_I

4

AO

L

5

AA

L

6

M

AL_

I

7

SNA

8

SS

A

9

TJ

A-I

10

PH

A(

L)

1

1

EC

A

12

RC

A1

20

1

3

PH

A(

E)

1

4

D

SA

1

5

GS

L-II

1

6

NP

A

17

Co

nA

1

8

GN

A

19

H

H

L

20

AC

G

21

TxL

C_

I

22

BP

L

23

TJ

A-II

2

4

EE

L

25

AB

A

26

LE

L

27

STL

28

U

D

A

29

PW

M

3

0

Ja

ca

lin

3

1

PNA

3

2

W

FA

3

3

AC

A

34

M

PA

3

5

H

PA

3

6

VV

A

37

D

BA

3

8

SB

A

39

Ca

ls

ep

a

40

PTL_

I

41

M

AH

4

2

W

GA

4

3

GS

L_

I_

A4

4

4

GS

L_

I_

B4

4

5

BG

No

rm

al

iz

ed

I

nte

ns

ity

(Ne

t

In

te

ns

ity)

650

600

550

500

450

400

350

300

250

200

150

100

50

0

■

Cetuximab、

■

a

-Gal を持たない参照タンパク質

a

-Gal

モノクロナール抗体の異種糖鎖抗原

糖鎖マーカー

正常でない細胞からの

糖タンパク質

正常細胞からの

糖タンパク質

分化

病態に特徴

的な糖鎖が

発現

コアのタンパク

質は同じ

糖鎖マーカー探査における基本的

なコンセプト

AFP

：anti-AFP antibody

肝炎

肝硬変

肝癌

AFP

：LCA (lectin)

：

Fucose

細胞の分化度や病態の悪性度がことなると、その糖鎖修

飾のパターンが変化する

(例, AFP-L3：肝臓癌）

レクチンアレイを用いた肝臓線維化マーカーの探索

と検査キットの実用化

Multilectin Assay for Detecting Fibrosis-Specific Glyco-Alteration by Means of Lectin Microarray, A. Kuno et al., Clinical Chemistry 57:1, pp48-56 (2011)

AGP, M2BPをキャリアータンパク質とし、

感度、特異度はともに

80%を凌ぐ

糖鎖マーカー開発の基本的パイプライン

The most suspicious glycan

changes and key lectins

Lectin Array Analysis

SDS-PAGE

2D Electrophoresis

LC-MS

Identification of

Carrier Proteins

Screening of 1

st

_{set of}

Marker Candidates

High throughput Screening

(Antibody-overlay Lectin Microarray)

Large Scale Validation

Narrowing down

Marker Candidates

Searching papers

And Database

Y

Lectin-ELISA Assay

再生医療

造血幹細胞

: WGA, CD34, CD133

神経幹細胞

:

LeX/SSEA-1, CD133

ES, iPS 細胞:

Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-4

内皮細胞

:

UEA-1

レクチンは、ヒトの幹細胞を認識する上で、

そんなに異端児ではありません

9-15c: MSC

KUM5: 軟骨芽細胞

KUSA-A1: 骨芽細胞

H-1/A: 前駆脂肪細胞

間葉系幹細胞とその分化細胞の判別

Lectin microarray analysis of pluripotent and multipotent stem cells, M. Toyoda et al., Genes to Cells 16, pp1-11 (2011)

hMSC と ECのクラスタリング解析

LecChipは、 MSCの

Specific lectin biomarkers for isolation of human pluripotent stem cells identified through array-based glycome analysis,

Yu-Chieh Wang, Shinya Yamanaka, Jeanne Loring et al., Cell Research advance online publication 6 September 2011; doi:10.1038/cr.2011.148(2011)

多分化能を持つ

iPS, ES 細胞 が明瞭に

LecChipで判別される

UEA-I, AOL, TJA-II が多分化能を持つ幹細胞に特異性が高く、

中でも

UEA-I がこの中では、高いS/Nを持っていることが分かった

: Fuc

a

1-2Gal



1-4GlcNAc

Specific lectin biomarkers for isolation of human pluripotent stem cells identified through array-based glycome analysis,

幹細胞特有の糖鎖マーカー

を認識するレクチンを用いた

カラムで将来癌化する可能

性のある細胞を除去

Specific lectin biomarkers for isolation of human pluripotent stem cells identified through array-based glycome analysis,

Glycome Diagnosis of Huma Induced Pluripotent Stem Cells Using Lectin Microarray, H. Tateno et al., J. of Biological Chem., Vo.286, No.23,

pp.20345-20353 (2011)

iPSにおける糖鎖構造の変化

rBC2LCN is a good probe for pluripotent stem cells,

:Fuc

a

1-2Gal



1-3GlcNAc(GalNAc)

プロバイオティクス

ー腸内細菌ー

腸内細菌は、

IgAの産生を促すと同時に、免疫寛容にも

Lectin Microarray Reveaqls Binding Profiled of Lactobacillus casei Strains in a Comprehensive Analysis of Bacterial Cell Wall Polysaccharides, E. Yasuda et.

Al. Applied and Environmental Microbiology, July 2011, p.4539-4546

病理学的応用

どの治療法を使うのが最も良いかな

?

組織片からの糖鎖プロファイリングから癌の悪性

度を評価する。副次的な数値化判断指標となりう

る。

実例

: 子宮体がん, G1, G2, and G3

G1=抗がん剤が効く

G3=抗がん剤が効かない

T細胞からATLの病態を評価

H. Iha et al., Bio Clinia Vo.26, No.10, Sep.2011, pp54-57

PBL-M, PBL-I: CD3+, CD4+ Helper T-cells, Health persons

ATL4, ATL9: ATL patient’s peripheral blood cells

まとめ

• R&D 用途,

• 糖鎖マーカーの探索,

• バイオシミラーの評価,

• 幹細胞や分化細胞の評価, そして

• 病理学的悪性度の評価,

GlycoStation

TM

_{は、いろいろな応用分野において、}

もっとも高感度でハイスループットに糖鎖プロファイリン

グを行うことができる簡単かつシンプルなシステムです。

Glycan Profiling technologies and

Services

GlycoBiomarker

_{Therapeutic Proteins}

Stem Cells

Simple & Quick to use

Diagnosis