チタン表面における浸漬溶液処理後の生物学的影響

神奈川歯科大学大学院歯学研究科

2014 年度 博 士 論 文

溶液浸漬処理後のチタン表面が生物学的応答

に及ぼす影響

Effects of Biological Responses of Titanium Surfaces

Treated with Various Solutions

原田泰光

Yasumitsu Harada

神奈川歯科大学大学院歯学研究科

咀嚼機能制御補綴学講座

1 諸 言 イ ン プ ラ ン ト 治 療 に よ り ， 口 腔 機 能 が 回 復 さ れ ， 生 活 の 質 が 向 上 す る こ と が 国 民 に 対 し て も 周 知 さ れ て き て い る 。 ま た ， 口 腔 機 能 の み な ら ず 全 身 的 な 機 能 回 復 の 有 用 性 か ら イ ン プ ラ ン ト 治 療 へ の 期 待 も 高 ま っ て き て い る 1，₂）_{。 そ れ に 伴 い ， 幅 広 い 年 齢 層 ， 口 腔 内 状 態 ， 全 身 状} 態 に 関 わ ら ず イ ン プ ラ ン ト 治 療 を 行 う 場 合 も 増 え て き て お り ， 現 在 報 告 さ れ て き て い る 高 い 成 功 率 や 安 全 性 な ど ， こ れ ま で の 成 績 の よ う に 達 成 で き な い こ と が 報 告 さ れ て き て い る 3）_{。 そ の た め ， イ ン プ ラ ン ト} 治 療 の 成 功 率 の 向 上 や 治 癒 期 間 の 短 縮 ， 適 応 の 拡 大 な ど に 幅 広 く 対 応 で き る こ と が 求 め ら れ て お り ， 現 在 で も 症 例 に よ っ て は 高 い 成 功 率 を 保 っ て い る が ， よ り 成 功 率 を 高 め イ ン プ ラ ン ト 治 療 を よ り 良 く し て い く た め に は ， こ れ ま で 以 上 に 骨 形 成 が 促 進 さ れ る イ ン プ ラ ン ト 体 の 改 良 が 必 要 と さ れ て い る 。 そ の た め ， 現 在 ま で に 様 々 な イ ン プ ラ ン ト 表 面 改 良 ， 改 質 研 究 が 継 続 し て 行 わ れ て お り ， 多 く の 基 礎 研 究 や 臨 床 経 過 が 報 告 さ れ て き て い る 4 -6）_。 代 表 的 な 表 面 改 質 の 方 法 と し て ， 表 面 構 造 形 態 を 変 え る 方 法 7）_， 生 体 活 性 材 料 を つ け る 方 法 8 , 9）_{， 表 面 を 親 水 化 す る 方 法} 1 0 , 11）_{な ど が 検} 証 さ れ て い る 。

2 イ ン プ ラ ン ト 表 面 に 骨 形 成 が な さ れ る 場 合 ， 最 初 に イ ン プ ラ ン ト 表 面 と タ ン パ ク が 吸 着 す る こ と が 重 要 で あ り ， 表 面 構 造 の 改 良 や 親 水 化 な ど の 改 質 を 行 う こ と に よ っ て イ ン プ ラ ン ト 表 面 の タ ン パ ク 吸 着 能 が 向 上 し ，そ の 後 の 細 胞 接 着 能 も 高 く な る と 考 え ら れ て い る 1 4 , 1 5）_{。近 年 ，} イ ン プ ラ ン ト 体 製 作 後 ， 水 溶 液 に 保 存 す る こ と に よ っ て 骨 形 成 能 力 を 向 上 さ せ る 方 法 が 注 目 さ れ ，検 討 さ れ て き て い る 1 2 , 1 3）_{。こ れ ら の 研 究} に 使 用 さ れ て い る 水 溶 液 は 主 に ， 純 水 ま た は 生 理 食 塩 水 に 類 似 し た 塩 化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 が 用 い ら れ て お り ， こ の 理 由 と し て ， 体 液 と ほ ぼ 等 張 で あ り ， 組 織 障 害 性 が 少 な い こ と に よ り 用 い ら れ て い る 。 水 溶 液 保 存 に よ り ， 骨 形 成 能 力 を 向 上 さ せ る 報 告 が あ る 一 方 で ， チ タ ン イ ン プ ラ ン ト 表 面 の 細 胞 接 着 能 の 低 下 や 臨 床 的 評 価 が 変 わ ら な い と い っ た 報 告 な ど も さ れ て お り ， 骨 形 成 能 力 向 上 の た め の 最 適 な 水 溶 液 は い ま だ 確 立 さ れ て い な い の が 現 状 で あ る 1 4 , 1 5）_。 保 存 す る 水 溶 液 の 種 類 に お い て ，影 響 が あ る 可 能 性 が 言 わ れ な が ら ， 溶 液 の 種 類 や 濃 度 に よ っ て イ ン プ ラ ン ト 体 へ の 生 物 学 的 影 響 を 明 ら か に し た 研 究 は 少 な く ，イ ン プ ラ ン ト 体 へ の 骨 形 成 能 力 を 考 慮 す る 場 合 ， よ り 詳 細 に す る 必 要 が あ る と 考 え ら れ る 。 今 回 我 々 は ， イ ン プ ラ ン ト 体 へ の 骨 形 成 能 促 進 の た め の 最 適 な 表 面 構 築 の 一 貫 と し て ， 種 類 の 異 な る 水 溶 液 に 浸 漬 し ， タ ン パ ク 吸 着 能 ， 細 胞 接 着 能 ， 細 胞 生 存 率 に 影 響 を 及 ぼ す か ど う か 検 証 を 行 っ た 。

3 材 料 お よ び 方 法 １ ． 実 験 用 チ タ ン 板 と 表 面 処 理 in vitro 実 験 に は ， 直 径 20 mm， 厚 さ 2 mm の グ レ ー ド 2 チ タ ン 板 を 用 い た 。表 面 を 旋 盤 に よ る 研 削 加 工 を 行 い ，滅 菌 水 に て 3 回 洗 浄 し た 。 そ の 後 ， 超 音 波 洗 浄 お よ び 高 圧 蒸 気 滅 菌 に よ り 洗 浄 ， 滅 菌 を 行 い ， 滅 菌 済 み 培 養 プ レ ー ト に 入 れ 暗 所 に て 4 週 間 以 上 保 管 し た 。 in vivo 実 験 に は ，直 径 2 mm，長 さ 4 mm の シ リ ン ダ ー 型 グ レ ー ド 2 チ タ ン 棒（ イ ン プ ラ ン ト ） を 用 い ， 洗 浄 ， 滅 菌 を 行 い 同 様 の 保 管 を 行 っ た 。 浸 漬 処 理 液 と し て ， 超 純 水 ， 塩 化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 （ 以 下 ， NaCl）， 塩 化 カ リ ウ ム 水 溶 液（ 以 下 ，KCl），塩 化 カ ル シ ウ ム 水 溶 液（ 以 下 ，CaCl2）, 塩 化 マ グ ネ シ ウ ム （ 以 下 ， MgCl2） を 用 い ， そ れ ぞ れ の 溶 液 濃 度 は ， 0.05M, 0.15M, 0.30M と し た 。 各 種 濃 度 の 溶 液 に ， 実 験 用 チ タ ン 板 を 3 時 間 浸 漬 し た 。 ２ ． 異 な る 表 面 処 理 液 浸 漬 後 の 生 細 胞 率 の 検 証 本 研 究 で 使 用 す る 溶 液 が 細 胞 毒 性 お よ び 細 胞 死 に 影 響 を 与 え る か ど う か 検 証 を 行 う た め に ， 各 種 溶 液 と 異 な る 濃 度 で 処 理 を 施 し た チ タ ン 板 上 に 骨 芽 細 胞 様 細 胞 を 播 種 し ，培 養 を 行 い ，12 時 間 後 ト リ プ シ ン に

4

よ り 細 胞 を 剥 が し 回 収 し た 。 用 い た 骨 芽 細 胞 様 細 胞 は ， 雄 性 Sprague-Dawley ラ ッ ト (8 週 齢 )の 大 腿 骨 か ら 骨 髄 細 胞 を 播 種 し ， 15％

ウ シ 胎 児 血 清 (Gibco, USA)， 10-8 _{M デ キ サ メ タ ゾ ン (Sigma, USA)，}

10 mM β – グ リ セ ロ 燐 酸 塩 (Sigma, USA)， 50 µg/ml ア ス コ ル ビ ン 酸 2 リ ン 酸 (Sigma, USA)，抗 生 物 質 合 剤（ 100 U/ml ペ ニ シ リ ン G ナ ト リ ウ ム ，100 mg/ml ス ト レ プ ト マ イ シ ン 硫 酸 塩 ，250 ng/ml ア ン ホ テ リ シ ン B，Invitrogen, USA）含 有 の α – MEM (Invitrogen, USA) と 混 合 し て ， 直 径 100 mm 細 胞 培 養 皿 (Corning, USA) に 播 種 し て 静 置 培 養 し ，そ の 後 ， 継 代 培 養 し た も の を 用 い た 。 な お ， 本 実 験 プ ロ ト コ ー ル は 神 奈 川 歯 科 大 学 の 動 物 実 験 倫 理 委 員 会 の 承 認 を 受 け て 実 施 さ れ た 。

回 収 し た サ ン プ ル は ， Apoptosis Detection kit (ANNEXIN V-FITC kit: BECKMAN, USA) の プ ロ ト コ ー ル に 従 っ て ，4℃ 5 分 間 の 遠 心 分 離 を 行

い ， 上 清 を 吸 引 除 去 し ， binding buffer に て 5 X 106 _{個 /ml と な る よ う}

細 胞 数 を 調 整 し ， 100 µl に 対 し 5 µl Annexin V-FITC 溶 液 ， 2.5 µl Propidium lodide (PI)溶 液 を 反 応 さ せ ， 400 µl binding buffer を 加 え た 。 そ の 後 ，フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー を 用 い ，488 nm レ ー ザ ー 波 長 に て 計 測 を 行 い 計 測 結 果 か ら パ ラ メ ー タ ー ヒ ス ト グ ラ ム を 作 製 し ， Annexin V-FITC と PI の 両 者 に 染 色 さ れ な い（ ネ ガ テ ィ ブ ）細 胞 を 正 常 細 胞（ 生 細 胞 ） と 判 定 し ， そ の 割 合 か ら 生 細 胞 率 を 検 証 し た 。

5 ３ ． 表 面 濡 れ 性 試 験 各 条 件 溶 液 に 浸 漬 し た 後 ， 大 気 中 に て 保 管 し ， 表 面 が 乾 燥 し た こ と を 確 認 し て か ら 計 測 を 行 っ た 。 チ タ ン 表 面 に お け る 濡 れ 性 の 性 状 及 び 定 量 は ， 1 μl 超 純 水 の 滴 下 に よ り 測 定 し た 。 計 測 に は 自 動 接 触 角 計 （ CA－ X， 協 和 界 面 科 学 ， 埼 玉 ） に よ り 行 い ， θ /2 法 に よ り 滴 下 し た 液 滴 か ら 接 触 角 を 求 め た （ 図 １ ）。 ４ ． タ ン パ ク 吸 着 能 試 験 モ デ ル タ ン パ ク と し て 牛 血 清 由 来 の ア ル ブ ミ ン (Pierce Biotechnology, Inc., USA) を 用 い ， 各 条 件 の チ タ ン 板 上 に ， 1 mg/ml 濃 度 に 調 整 し た 300 µl の タ ン パ ク 溶 液 を ， 37 ºC, 5% CO2, 95% Air の イ ン キ ュ ベ ー タ ー 中 で 1 時 間 接 触 さ せ た 。 条 件 終 了 後 ， 溶 液 を 全 て 回 収 し ， さ ら に 0.9 ％ 生 理 食 塩 水 300 µl を チ タ ン 板 上 に 入 れ ，水 平 に 揺 れ 動 か す こ と に よ り 洗 浄 し ， 溶 液 の 回 収 を 行 っ た 。 こ の 洗 浄 を 2 回 繰 り 返 し ， 回 収 し た 溶 液 中 の タ ン パ ク 量 を BCA 法 (Pierce Micro BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific Pierce, IL, USA ) を 用 い ， マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー に て 測 定 し た 。測 定 値 を 既 知 の 100％ 濃 度 の タ ン パ ク 溶 液 測 定 値 か ら 減 じ ，そ の 回 収 溶 液 か ら 吸 着 し て い る タ ン パ ク 量 の 理 論 値 を 算 出 し た 。

6 ５ ． 骨 芽 細 胞 様 細 胞 の 細 胞 接 着 試 験 各 溶 液 濃 度 で 処 理 を 施 し た チ タ ン 板 上 に ， ラ ッ ト 大 腿 骨 骨 髄 か ら 採 取 ， 培 養 を 行 っ た 骨 芽 細 胞 様 細 胞 を 3 X 104 _{個 /cm}2 _{の 濃 度 で 播 種 し ，} 12 時 間 後 に 細 胞 骨 格 の ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト を ロ ー ダ ミ ン 蛍 光 標 識 に よ り 染 色 を 行 い ， 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 に て 観 察 を 行 っ た 。 ６ ． in vivo に お け る 骨 結 合 力 の 定 量 雄 性 Sprague-Dawley ラ ッ ト （ 8 週 齢 ） (n=28) を 用 い ， チ ト ゾ ー ル に よ る 腹 腔 麻 酔 を 行 っ た 後 ，大 腿 骨 骨 端 部 よ り 11 mm の 位 置（ 図 2A） に イ ン プ ラ ン ト 埋 入 の た め の 直 径 2 mm の 穴 を エ ン ジ ン 用 ラ ウ ン ド バ ー に て ， イ ン プ ラ ン ト を 浸 漬 さ せ た 各 濃 度 溶 液 を 注 水 し な が ら ， 皮 質 骨 の み 貫 通 さ せ た 。 尚 ， イ ン プ ラ ン ト 埋 入 は ， １ つ の 大 腿 骨 に 対 し て １ 本 と し ， 各 溶 液 条 件 後 に そ れ ぞ れ 埋 入 (n=4)を 行 っ た 。 埋 入 後 2 週 間 後 に ， 大 腿 骨 を 取 り 出 し ， 即 時 重 合 レ ジ ン に よ り 周 囲 を 固 定 し ，イ ン プ ラ ン ト 骨 結 合 力 を Push-in test に よ り 計 測 し た（ 小 型 卓 上 試 験 機 EZ-S, 島 津 製 作 所 ，京 都 ）。Push-in test は ，1 mm /分 の ク ロ ス ヘ ッ ド 速 度 で 鉛 直 下 方 に イ ン プ ラ ン ト を 押 し 込 み (図 2B)， 骨 結 合 力 の 計 測 は ，荷 重 - 変 位 曲 線 の 最 大 値 を 測 定 す る こ と に よ っ て 決 定 し た (図 2C)。

7 ７ ． 統 計 解 析 統 計 学 的 検 討 に は ， 各 群 間 の 濃 度 と 浸 漬 溶 液 の 種 類 に 対 し て 2 元 配 置 分 散 分 析 （ two-way ANOVA） を 行 っ た 後 に ， 多 重 比 較 検 定 と し て Bonferroni/Dunn 法 を 用 い た 有 意 差 検 定 を 行 っ た 。な お ，統 計 学 的 有 意 差 は ， 有 意 水 準 を 5％ と し た 。

8 結 果 １ ． 異 な る 種 類 と 濃 度 の 水 溶 液 浸 漬 後 の 生 細 胞 率 各 種 水 溶 液 に チ タ ン 板 を 浸 漬 し ， そ の 後 チ タ ン 板 上 に 播 種 さ れ ， Annexin V-FITC と PI に よ っ て 染 色 さ れ ず 生 細 胞 と し て 検 出 さ れ ，そ の 細 胞 割 合 か ら 算 出 さ れ た 生 細 胞（ 正 常 細 胞 ）率 を 示 す（ 図 3）。本 実 験 で 行 っ た 全 て の 溶 液 ，濃 度 条 件 に お い て ，播 種 し た 細 胞 の 生 細 胞 率 は ， い ず れ も 約 80％ 以 上 を 保 っ て お り ，細 胞 の 生 存 率 は 高 い こ と が 確 認 さ れ た 。 本 実 験 で 用 い た 異 な る 種 類 ， 濃 度 の 水 溶 液 浸 漬 後 の 各 条 件 下 に お け る 生 細 胞 率 に は 有 意 な 差 は 認 め ら れ ず ， 使 用 溶 液 に よ り 細 胞 毒 性 や ア ポ ト ー シ ス や ネ ク ロ ー シ ス な ど の 細 胞 死 へ の 影 響 は 少 な い こ と が 確 認 さ れ た 。 ２ ． 異 な る 種 類 と 濃 度 の 水 溶 液 浸 漬 後 の 濡 れ 性 の 変 化 各 条 件 溶 液 で 浸 漬 さ せ た 後 の チ タ ン 板 に 超 純 水 を 1 μl 滴 下 し た 写 真 を 示 す（ 図 4）。今 回 用 い た 異 な る 種 類 ，濃 度 の 水 溶 液 浸 漬 後 に お い て は ，ど の 表 面 に お い て も 約 60 度 以 上 の 接 触 角 を 示 し ，各 条 件 間 に お い て 表 面 の 濡 れ 性 に 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 ま た ， 未 処 理 表 面 の 接 触 角 は ， 今 回 行 っ た 全 て の 浸 漬 条 件 と 比 較 し ， 有 意 な 差 は 認 め ら れ

9 ず ， 表 面 の 濡 れ 性 に よ る 表 面 性 状 の 条 件 は 同 じ で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。 ３ ． 異 な る 種 類 と 濃 度 の 水 溶 液 浸 漬 後 の タ ン パ ク 吸 着 能 率 未 処 理 表 面 お よ び ，異 な る 種 類 の 溶 液 を 各 濃 度 に 浸 漬 さ せ ，そ の 後 ， チ タ ン 表 面 に お け る ア ル ブ ミ ン タ ン パ ク 接 触 1 時 間 後 の タ ン パ ク 吸 着 能 率 を（ 図 5）示 す 。本 実 験 で 用 い た 溶 液（ NaCl， KCl，CaCl2お よ び MgCl2） に お い て ， 浸 漬 濃 度 0.05M, 0.15M, 0.30M の 濃 度 の 異 な る 条 件 下 に お け る ア ル ブ ミ ン タ ン パ ク 吸 着 率 に は ， 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た 。ま た ，未 処 理 表 面 の ア ル ブ ミ ン 吸 着 率 は ，11.3±4.1％ ，超 純 水 に 浸 漬 し た 表 面 で は ， 13.2±3.6％ を 示 し ， 今 回 用 い た NaCl お よ び KCl に て 浸 漬 さ せ た 条 件 と 比 較 し 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 し か し な が ら ， CaCl2 お よ び MgCl2 に 浸 漬 さ せ た チ タ ン 板 の ア ル ブ ミ ン タ ン パ ク 吸 着 率 は ， 未 処 理 表 面 ， 超 純 水 ， NaCl お よ び KCl に て 浸 漬 さ せ た チ タ ン 板 と 比 較 し ， ど の 濃 度 間 に お い て も 有 意 な 差 が 認 め ら れ た 。 CaCl2 と MgCl2 と の 間 に は 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 ４ ． 異 な る 種 類 と 濃 度 の 水 溶 液 浸 漬 後 の 骨 芽 細 胞 様 細 胞 接 着 能 異 な る 種 類 と 濃 度 の 水 溶 液 浸 漬 後 ，各 チ タ ン 板 表 面 に 細 胞 を 播 種 し ， 12 時 間 の 培 養 後 の 結 果 を 示 す（ 図 6）。未 処 理 表 面 と NaCl お よ び KCl

10 の 各 濃 度 に て 浸 漬 さ れ た チ タ ン 板 で は ， 細 胞 接 着 数 ， 細 胞 形 態 に は 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た 。浸 漬 溶 液 と し て CaCl2 お よ び MgCl2 を 用 い た 場 合 ，未 処 理 お よ び NaCl，KCl に 浸 漬 し た 表 面 と 比 較 し ，今 回 設 定 し た 濃 度 条 件 の 全 て に お い て ， 細 胞 接 着 数 の 増 加 が 認 め ら れ ， さ ら に 細 胞 個 々 の 大 き さ も ， 広 が り を 見 せ る こ と が 確 認 さ れ た 。 各 種 溶 液 の そ れ ぞ れ の 濃 度 間 に お い て は 細 胞 接 着 数 ， 細 胞 形 態 に は 大 き な 変 化 は 認 め ら れ な か っ た 。 ５ ． in vivo に お け る 異 な る 水 溶 液 浸 漬 の 違 い に よ る 骨 結 合 力 イ ン プ ラ ン ト を 各 種 溶 液 に 浸 漬 さ せ 大 腿 骨 部 に 埋 入 し ， ２ 週 間 の 治 癒 後 の イ ン プ ラ ン ト と 骨 と の 結 合 力 を 示 す（ 図 ７ ）。未 処 理 お よ び 超 純 水 ，NaCl，KCl に 浸 漬 し た 後 の イ ン プ ラ ン ト と 骨 結 合 力 に は ，ど の 濃 度 に お い て も 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 浸 漬 溶 液 と し て CaCl2 お よ び MgCl2を 用 い た 場 合 で は ， 未 処 理 ， 超 純 水 ， NaCl お よ び KCl と 比 較 し 有 意 な 差 を 認 め た （ p < 0.05）。 ま た ， NaCl， KCl, CaCl2お よ び MgCl2 に お け る ， そ れ ぞ れ の 各 濃 度 間 に お い て は ， 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 CaCl2 お よ び MgCl2 と の 間 で は ， ど の 濃 度 条 件 に お い て も 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た 。

11 考 察 本 報 告 は ， チ タ ン 表 面 に ナ ト リ ウ ム ， カ リ ウ ム ， カ ル シ ウ ム お よ び マ グ ネ シ ウ ム を 含 む 水 溶 液 に 浸 漬 す る こ と に よ り 表 面 処 理 を 行 う こ と で ， タ ン パ ク 吸 着 率 や 細 胞 接 着 率 ， お よ び チ タ ン イ ン プ ラ ン ト と 骨 結 合 力 に 影 響 を 与 え る か ど う か 検 証 し た も の で あ る 。 異 な る 溶 液 と し て 塩 化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 お よ び ，塩 化 カ リ ウ ム 水 溶 液 に よ る 浸 漬 後 で は ， 超 純 水 に 浸 漬 し た 表 面 と 比 較 し ， タ ン パ ク 吸 着 能 率 ， 細 胞 接 着 能 お よ び チ タ ン イ ン プ ラ ン ト と 骨 と の 結 合 力 に は 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 一 方 ， 塩 化 カ ル シ ウ ム 水 溶 液 お よ び 塩 化 マ グ ネ シ ウ ム 水 溶 液 に 浸 漬 し た 後 で は ， 今 回 用 い た 全 て の 実 験 に お い て 有 意 な 差 を 認 め た 。 ま た ， こ れ ら の 異 な る 溶 液 の 浸 漬 に よ り 生 細 胞 率 に は 有 意 な 差 を 認 め な か っ た 。 本 研 究 で は ， チ タ ン イ ン プ ラ ン ト を 生 体 内 に 使 用 す る 前 に ， カ ル シ ウ ム お よ び マ グ ネ シ ウ ム 水 溶 液 に よ り 浸 漬 処 理 す る こ と で ， タ ン パ ク 吸 着 能 や 細 胞 接 着 能 を 向 上 さ せ る 可 能 性 が あ る こ と を 見 出 し た 。 チ タ ン イ ン プ ラ ン ト が 生 体 内 の 骨 に 埋 入 さ れ ， 骨 結 合 が 促 進 さ れ る 場 合 は ， タ ン パ ク が 早 期 に 吸 着 し ， そ の 後 ， 細 胞 接 着 が 起 こ り ， 周 囲 の 骨 形 成 が 促 進 さ れ る と 考 え ら れ て い る 1 6 , 1 7）_{。よ っ て ，チ タ ン 表 面 に} タ ン パ ク が よ り 多 く 吸 着 す る こ と は ， 骨 結 合 を 促 進 す る た め に も 非 常

12 に 重 要 と 考 え ら れ る 。 本 研 究 で 用 い た ア ル ブ ミ ン は ， 血 液 中 の 血 漿 成 分 の 中 で 最 も 多 く 含 ま れ て い る タ ン パ ク で あ り ， ホ ル モ ン や カ ル シ ウ ム な ど の 分 子 運 搬 作 用 に よ っ て 生 体 内 に お い て フ ィ ブ ロ ネ ク チ ン な ど の 生 体 外 基 質 成 分 と と も に チ タ ン 表 面 へ の 細 胞 接 着 を 促 進 す る も の と 考 え ら れ て い る 1 8 , 1 9）_{。そ の た め ，本 研 究 に お け る 浸 漬 後 の 表 面 に お い} て ， こ の よ う な タ ン パ ク が 速 や か に ， ま た 吸 着 量 が 増 加 す る 環 境 に あ る こ と か ら ，生 体 内 で の 骨 形 成 能 が 向 上 し ，そ の 後 の in vivo に お け る 結 果 に お い て も イ ン プ ラ ン ト と 骨 と の 間 に 有 意 な 骨 結 合 力 の 向 上 を 認 め た も の と 考 え ら れ ， 本 研 究 で 用 い た カ ル シ ウ ム お よ び マ グ ネ シ ウ ム を 含 む 水 溶 液 を 使 用 し た 浸 漬 に よ る 効 果 は ， 初 期 の タ ン パ ク 吸 着 能 だ け で な く ，そ の 後 の 骨 形 成 過 程 に も 影 響 を 及 ぼ す 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 チ タ ン イ ン プ ラ ン ト 表 面 に タ ン パ ク お よ び 細 胞 が 吸 着 す る 際 に は ， チ タ ン 表 面 に カ ル シ ウ ム 沈 着 が 起 こ り ， カ ル シ ウ ム ブ リ ッ ジ を 形 成 す る と 一 つ の 説 と し て 考 え ら れ て い る 。 こ れ は ， 通 常 pH=7 付 近 の チ タ ン 表 面 は ， 負 （ マ イ ナ ス ） の 荷 電 状 態 で 存 在 し て お り ， 吸 着 す る 際 の タ ン パ ク も 同 様 に 負 の 帯 電 を し て い る た め 互 い に 反 発 す る 。そ の た め ， 両 者 を つ な ぐ 働 き と し て ， 血 液 中 の カ ル シ ウ ム な ど の 二 価 の 陽 イ オ ン が 沈 着 し ， 橋 渡 し を す る カ ル シ ウ ム ブ リ ッ ジ を 形 成 す る こ と に よ り ， タ ン パ ク 吸 着 が 促 進 さ れ る と 考 え ら れ て い る （ 図 8）2 0）_{。 一 方 で ， 一} 価 の 陽 イ オ ン と し て 代 表 的 な も の が ナ ト リ ウ ム ， カ リ ウ ム で あ る 。 こ

13 れ ら は チ タ ン 表 面 に は 付 着 す る が ， 陽 イ オ ン の 帯 電 が な く な る た め ， そ れ 以 降 の タ ン パ ク 吸 着 を 阻 害 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 現 在 ま で の 研 究 報 告 か ら 本 実 験 結 果 を 推 考 す る と ， カ ル シ ウ ム ， マ グ ネ シ ウ ム な ど の 二 価 の 陽 イ オ ン が 関 与 し て い る 可 能 性 が 高 い と 考 え ら れ る が ， 本 研 究 で 用 い た 水 溶 液 に は 塩 化 物 も 含 ま れ て い る た め ， チ タ ン 表 面 上 に タ ン パ ク が 吸 着 す る 際 に 塩 化 物 が ， タ ン パ ク 吸 着 に 促 進 ま た は 阻 害 作 用 を 起 こ し て い る 可 能 性 も あ る た め ， カ ル シ ウ ム ， マ グ ネ シ ウ ム お よ び 塩 化 物 と タ ン パ ク お よ び 細 胞 と の 相 互 作 用 を 今 後 ， よ り 明 ら か に す る 必 要 が あ る と 思 わ れ る 。 そ の た め ， 単 に カ ル シ ウ ム イ オ ン に よ り 生 物 学 的 応 答 が 向 上 す る と い う こ と を 結 論 付 け る に は 慎 重 を 期 す る 必 要 が あ る と 思 わ れ る が ， 二 価 の 陽 イ オ ン が 関 与 し て い る と 仮 定 し た 場 合 ， チ タ ン を 浸 漬 す る 際 に 使 用 す る 溶 液 の 選 択 が 非 常 に 重 要 に な る と 考 え ら れ る 。 ま た ， 骨 と チ タ ン 表 面 と の 分 子 結 合 形 態 や 組 織 学 的 構 造 に お い て は ， よ り 上 流 の 細 胞 応 答 経 路 お よ び 組 織 学 形 態 の 観 察 を 行 う こ と に よ り 本 研 究 に 使 用 し た 溶 液 の 効 果 に よ る ， よ り 詳 細 な メ カ ニ ズ ム が 明 ら か と な る と 考 え ら れ る た め ， 今 後 検 証 し て い く 必 要 が あ る と 思 わ れ る 。 本 研 究 中 に 使 用 し た ナ ト リ ウ ム ， カ リ ウ ム ， カ ル シ ウ ム ， マ グ ネ シ ウ ム の 他 に ，一 価 の 陽 イ オ ン と し て は ，銀 イ オ ン (Ag+)，ア ン モ ニ ウ ム イ オ ン (NH4+)が あ り ，二 価 の 陽 イ オ ン ま た は そ れ 以 上 の 陽 イ オ ン と し

14 て は ， バ リ ウ ム イ オ ン (Ba2 +_{)， 銅 イ オ ン (Cu}2 +_{)， 亜 鉛 イ オ ン (Zn}2 +_{)， ス} ズ イ オ ン (Sn2 +_{)，ア ル ミ ニ ウ ム イ オ ン (Al}3 +_{)な ど が 挙 げ ら れ る 。し か し ，} こ れ ら の 陽 イ オ ン が 含 ま れ る 溶 液 に お い て ， 血 漿 中 に も 含 ま れ ， 人 体 に 対 し て 悪 影 響 が 少 な い 溶 液 を 考 慮 す る と ， 本 研 究 で 用 い た ナ ト リ ウ ム ， カ リ ウ ム ， カ ル シ ウ ム ， マ グ ネ シ ウ ム イ オ ン を 含 む 水 溶 液 が 検 証 の 対 象 と な る と 考 え ら れ た 。本 研 究 に お い て 使 用 し た 塩 化 カ ル シ ウ ム ， 塩 化 マ グ ネ シ ウ ム 水 溶 液 は ， 細 胞 生 存 率 に 影 響 を 与 え ず ， 細 胞 毒 性 が 少 な い こ と が 認 め ら れ た 。 一 般 に ， 溶 液 の 種 類 や 濃 度 に よ っ て 細 胞 へ の 影 響 が 生 じ る 場 合 は ， 細 胞 の 核 の 萎 縮 ， 断 片 化 が 生 じ る ア ポ ト ー シ ス と ， 細 胞 小 器 官 が 膨 潤 し ， 細 胞 膜 が 破 裂 す る ネ ク ロ ー シ ス が 引 き 起 こ さ れ る 。 本 研 究 で 用 い た フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 法 は ， 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス ， ネ ク ロ ー シ ス の 割 合 を 検 出 す る こ と が 可 能 で あ り ， 本 研 究 に 用 い た 全 て の 溶 液 ， 濃 度 に お い て ， 正 常 細 胞 率 の 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た こ と か ら ， 溶 液 に よ る 細 胞 毒 性 お よ び 細 胞 死 へ の 影 響 は 少 な い も の と 考 え ら れ た 。 本 研 究 に お い て ， 特 に カ ル シ ウ ム イ オ ン が 含 ま れ る 塩 化 カ ル シ ウ ム 水 溶 液 に よ り 生 物 学 的 応 答 が 増 加 し て い た が ， カ ル シ ウ ム イ オ ン は ， 負 の 電 荷 に 対 し て ， カ リ ウ ム ， ナ ト リ ウ ム イ オ ン よ り も 高 い 親 和 性 が あ る こ と が 示 さ れ て い る 2 1 )_{。さ ら に ，チ タ ン 表 面 へ の 親 和 力 も カ ル シ} ウ ム イ オ ン が 一 番 高 い と の 報 告 も な さ れ て い る 2 2 )_{。そ の た め ，イ ン プ}

15 ラ ン ト を 生 体 内 に 埋 入 し 骨 形 成 が な さ れ る 際 に は ， チ タ ン イ ン プ ラ ン ト 表 面 に カ ル シ ウ ム の 付 着 が 優 位 で あ り ， 重 要 と さ れ る が ， イ ン プ ラ ン ト と 接 す る 血 漿 成 分 中 に は カ リ ウ ム や ナ ト リ ウ ム が カ ル シ ウ ム よ り も は る か に 多 く 存 在 す る 。 そ れ に も 関 わ ら ず ， カ ル シ ウ ム が 優 位 に 付 着 す る 可 能 性 が あ る の は ， チ タ ン 表 面 が 負 に 帯 電 し て お り ， カ ル シ ウ ム が カ リ ウ ム ， ナ ト リ ウ ム よ り も 高 い 親 和 性 を 持 っ て い る た め と 考 え ら れ ， チ タ ン 表 面 の カ ル シ ウ ム 濃 度 が 僅 か で も 増 加 す る こ と に よ り ， 生 物 学 的 応 答 に 影 響 を 与 え る も の と 考 え ら れ た 。 現 在 ， 骨 形 成 能 力 を 向 上 す る 目 的 で チ タ ン イ ン プ ラ ン ト 表 面 に ア パ タ イ ト を 施 し た イ ン プ ラ ン ト が あ り ， 多 く の 研 究 も な さ れ て い る 。 こ の よ う な イ ン プ ラ ン ト は ， 表 面 に カ ル シ ウ ム を 主 と し た ア パ タ イ ト が 存 在 す る た め ，す で に カ ル シ ウ ム ブ リ ッ ジ が 形 成 さ れ て い る こ と よ り ， タ ン パ ク 吸 着 能 や 細 胞 接 着 能 が 有 利 で あ る と さ れ て い る 。 し か し 一 方 で ， チ タ ン イ ン プ ラ ン ト も 数 多 く 存 在 し て お り ， チ タ ン イ ン プ ラ ン ト を 使 用 す る 場 合 に は ， カ ル シ ウ ム 被 覆 層 が 存 在 し な い た め ， 骨 形 成 条 件 と し て は 不 利 で あ る と 考 え ら れ て い る 。 そ の た め ， 骨 形 成 能 を 促 進 す る 表 面 形 態 や ， 表 面 修 飾 が 必 要 と さ れ て お り ， 本 研 究 で 用 い た 溶 液 浸 漬 に よ る 方 法 は ， 現 在 の チ タ ン イ ン プ ラ ン ト の 骨 形 成 能 力 を 向 上 さ せ る シ ン プ ル で 簡 便 な 表 面 処 理 方 法 の 一 つ に な り う る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。

16 現 在 の 日 常 臨 床 に お け る イ ン プ ラ ン ト 治 療 の 成 功 率 は ， 98％ と も 言 わ れ て お り ， 16 年 間 の サ バ イ バ ル レ ー ト も 82.94％ と 高 い 数 値 が 報 告 さ れ て い る 2 3）_{が ，よ り 骨 形 成 を 促 進 さ せ る こ と で ，イ ン プ ラ ン ト 周 囲} に 形 成 さ れ る 骨 量 お よ び 骨 質 に 影 響 を 与 え ， よ り 良 い 条 件 で イ ン プ ラ ン ト 結 合 が 形 成 さ れ る も の と 考 え ら れ る 。1998 年 に 示 さ れ た 現 代 の イ ン プ ラ ン ト 成 功 の 基 準 の 指 標 と な る ト ロ ン ト 会 議 で は ， イ ン プ ラ ン ト の 機 能 開 始 1 年 以 降 の 経 年 的 な 垂 直 的 骨 吸 収 は 平 均 0.2mm 以 下 と さ れ て い る 。 イ ン プ ラ ン ト 周 囲 の 骨 量 お よ び 骨 質 が ， よ り 強 固 に な っ た 場 合 は ， 垂 直 的 骨 吸 収 に お い て も 最 小 限 に 予 防 出 来 ， イ ン プ ラ ン ト 生 存 率 も 向 上 す る こ と が 予 測 さ れ る 。 本 結 果 よ り ，イ ン プ ラ ン ト 治 療 を よ り 確 実 に 成 功 へ と 導 く た め に は ， チ タ ン イ ン プ ラ ン ト の 表 面 改 良 ， 成 長 因 子 の 使 用 や 手 術 方 法 の 改 良 だ け で な く ， イ ン プ ラ ン ト 体 を 使 用 す る 前 の イ ン プ ラ ン ト 表 面 処 理 方 法 な ど を 考 慮 す る こ と に よ り ， 高 い 骨 形 成 能 を 有 し た 環 境 が 得 ら れ る の で は な い か と 考 え ら れ た 。 今 後 ， よ り 骨 形 成 能 に 最 適 な 溶 液 の 種 類 及 び 濃 度 な ど の 更 な る 詳 細 検 討 は 必 要 で あ り ， 検 証 項 目 と し て も 細 胞 挙 動 で あ る 遺 伝 子 発 現 か ら 組 織 状 態 ま で 明 ら か に す る 必 要 が あ る が ， 今 後 の イ ン プ ラ ン ト 治 療 の 発 展 を 考 え る 上 で 新 た な 表 面 改 良 法 の 研 究 に 寄 与 す る 一 要 因 に な っ た の で は な い か と 考 え ら れ た 。

17 結 論 チ タ ン イ ン プ ラ ン ト 表 面 に お い て ， 種 類 の 異 な る 水 溶 液 に 浸 漬 を 行 い ， タ ン パ ク 吸 着 能 と 骨 芽 細 胞 接 着 ， in vivo に よ る 骨 結 合 力 を 検 証 し た と こ ろ ， 浸 漬 溶 液 と し て カ ル シ ウ ム ， マ グ ネ シ ウ ム 水 溶 液 に 浸 漬 し た 表 面 で は ， 未 処 理 表 面 お よ び 超 純 水 ， ナ ト リ ウ ム ， カ リ ウ ム 水 溶 液 に 浸 漬 し た 後 の 表 面 と 比 較 し ， タ ン パ ク 吸 着 能 ， 細 胞 接 着 能 ， 骨 結 合 力 が 向 上 し ， 有 意 な 増 加 を 認 め た 。 カ ル シ ウ ム ， マ グ ネ シ ウ ム 水 溶 液 に よ る 浸 漬 処 理 は ， チ タ ン 表 面 の 骨 形 成 能 を 向 上 さ せ る 簡 便 な 方 法 の 一 つ と な る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 謝 辞 本 研 究 の 遂 行 に 際 し ，科 学 研 究 費 補 助 金（ 基 盤 研 究（ C），課 題 番 号 ： 24592971. 研 究 代 表 者 ： 堀 紀 雄 ） の 補 助 を 受 け た 。

18

参 考 文 献

1） Kimoto K, Ono Y, Tachibana A, Hirano Y, Otsuka T, Ohno A, Yamaya K, Obata T, Onozuka M. Chewing-induced regional brain activity in

edentulous patients who recei ved mandibular implant-supported

overdentures: a preliminary report . J Prosthodont Res. 2011;55:89-97.

2） 塚 野 寛 久 , 冲 本 公 繪 , 大 東 文 和 , 北 原 亨 , 寺 田 善 博 . イ ン プ ラ ン ト 補 綴 前 後 の 咀 嚼 能 力 と 口 唇 周 囲 軟 組 織 運 動 の 客 観 的 評 価 を 行 っ た 症 例 . 日 補 綴 会 誌 . 2012;4:302-311.

3）Meredith N。 Assessment of implant stability as a pr ognostic determinant . Int J Prosthodont 1998;11:491-501.

4) Wei J, Igarashi T, Okumori N, Igarashi T, Maetani T, Liu B, Yoshinari M. Influence of surface wettability on competitive protein adsorption and initial attachment of osteoblasts . Biomed Mater. 2009;4:045002.

19

5) Zinger O, Zhao G, Schwartz Z, Simpson J, Wieland M, Landolt D, Boyan B. Differential regulation of osteoblasts by substrate microstructural

features. Biomaterials. 2005;26:1897-1847.

6) Hori N, Iwasa F, Ueno T, Takeuchi K, Tsukimura N, Ya mada M, Hattori M, Yamamoto A, Ogawa T. Selective cell affinity of biomimetic

micro-nano-hybrid structured TiO2 overcomes the biological dilemma of osteoblasts. Dent Mater. 2010;26:275-287.

7) Buser D, Schenk RK, Steinemann S, Fiorellini JP, Fox CH, Stich H。 Influence of surface characteristics on bone integration of titanium implants . A histomorphometric study in miniature pigs. J Biomed Mater Res. 1991; 25:889-902.

8) Cooley DR, Van Dellen AF, Burgess JO, Windeler AS 。 The

advantages of coated titanium implants prepared by radiofrequency

20

9) De Andrade MC, Sader MS, Filgueiras MR, Ogasawara T . Microstructure of ceramic coating on titanium surface as a result of hydrothermal treatment . J Mater Sci Mater Med. 2000;11:751-755.

10) Wei J, Yoshinari M, Takemoto S, Hattori M, Kawada E, Liu B, Oda Y. Adhesion of mouse fibroblasts on hexamethyldisiloxane surfaces with wide range of wettability. J Biomed Mater Res B Appl Biomater . 2007;81:66-75.

11) Att W, Hori N, Iwasa F, Yamada M, Ueno T, Ogawa T . The effect of UV-photofunctionalization on the tim e-related bioactivity of titanium and chromium-cobalt alloys. Biomaterials. 2009;30:4268-4276.

12) Rupp F, Scheideler L, Olshanska N, de Wild M, Wieland M,

Geis-Gerstorfer J. Enhancing surface free energy and hydrophilicity

through chemical modification o f microstructured titanium implant surfaces 。 J Biomed Mater Res A. 2006;76:323-334.

13) Bang SM, Moon HJ, Kwon YD, Yoo JY, Pae A, Kwon IK . Osteoblastic and osteoclastic differentiation on SLA and hydrophilic modified

21

14) Zhao G, Schwartz Z, Wieland M, Rupp F, Geis -Gerstorfer J, Cochran

DL, Boyan BD. High surface energy enhances cell response to titanium

substrate microstructure. J Biomed Mater Res A. 2005 ; 74 : 49-58.

15) Buser D, Broggini N, Wieland M, Schenk RK, Denzer AJ, Cochran DL,

Hoffmann B, Lussi A, Steinemann SG . Enhanced bone apposition to a

chemically modified SLA titanium surface . J Dent Res. 2004;83:529-33.

16) Tsai JA, Lagumdzija A, Stark A, Kindmark H. Albumin-bound lipids induce free cytoplasmic calcium oscillations in human osteoblast -like cells. Cell Biochem Funct. 2007;25:245-249.

17) Park JM, Koak JY, Jang JH, Han CH, Kim SK, Heo SJ.

Osseointegration of anodized titanium implants coated with fibroblast growth factor-fibronectin (FGF-FN) fusion protein. Int J Oral Maxillofac Implants. 2006;21:859-866.

18) Degasne I, Baslé MF, Demais V, Huré G, Lesourd M, Grolleau

22

on attachment, spreading, and proliferation of human osteoblast -like cells (Saos-2) on titanium surfaces。 Calcif Tissue Int. 1999;6:499-507.

19) Yang Y, Dennison D, Ong JL. Protein adsorption and osteoblast

precursor cell attachment to hydroxyapatite of different crystallinities . Int J Oral Maxillofac Implants. 2005;20:187-192.

20） Hori N, Ueno T, Suzuki T, Yamada M, Att W, Okada S, Ohno A, Aita H, Kimoto K, Ogawa T. Ultraviolet light treatment for the restoration of age-related degradation of titanium bioactivity. Int J Oral Maxillofac Implants. 2010;25:49-62.

21) Korolev N, Lyubartsev AP, Rupprecht A, Nordenskiöld L.

Competitive binding of Mg2+, Ca2+, Na+, and K+ ions to DNA in oriented DNA fibers: experimental and Monte Carlo simulation results 。 Biophys J. 1999;77:2736-49.

22) Guo CY, Matinlinna JP, Tang AT.

Effects of surface charges on dental implants: past, present,and future. Int J Biomater. 2012;2012:381535.

23

23）Simonis P, Dufour T, Tenenbaum H.

Long-term implant survival and success: a 10 -16-year follow-up of

24 図 説 図 １ 接 触 角 算 出 方 法 図 ２ (A) in vivo 試 験 に お け る イ ン プ ラ ン ト 埋 入 位 置 （ 断 面 図 ） (B)力 学 試 験 写 真 (C) 力 学 試 験 に よ り 得 ら れ る 解 析 グ ラ フ 図 ３ 各 種 溶 液 浸 漬 後 の 細 胞 生 存 率 図 ４ 表 面 濡 れ 性 試 験 未 処 理 お よ び 各 種 溶 液 浸 漬 後 の 濡 れ 性 図 ５ 未 処 理 お よ び 各 種 溶 液 浸 漬 後 の タ ン パ ク 吸 着 率 ＊ ： p<0.05 図 ６ 各 種 溶 液 浸 漬 後 の 細 胞 接 着 動 態 の 観 察 Scale bar=50μ m 図 ７ in vivo に お け る 各 種 溶 液 浸 漬 後 に 埋 入 さ れ た イ ン プ ラ ン ト と 骨 と の 結 合 力 ＊ ： p<0.05

25