卵巣癌病態解明の試み--thymidine phosphorylase およびその関連酵素発現を中心に---香川大学学術情報リポジトリ

日本産科婦人科学会香川地方部会雑誌 vol. 3， No. 1， pp. 11ー 18， 2001(平13，9月 11

説

公 凶 山

卵巣癌病態解明の試み

-thymidine phosphorylase

およびその関連酵素発現を中心に一

島根医科大学医学部産科婦人科学教室

秦 幸 吉

宮 崎 康 二

E a 句 証 俳

要

従来，卵巣癌は病理形態学的な特徴によってそ れぞれの癌の分類がなされていた。しかしながら， 遺伝子変化を中心とした生化学的指標をもとにし た癌の広がり，癌細胞の悪性度，癌の薬剤や放射 線に対する感受性の診断など“癌の個性"にもと づく分類はなされていなかった。個々の卵巣癌で 生じている生物学的変化を客観的に評価するこ左 は新たなる卵巣癌病態解明につながると考えられ る。 今回，我々の教室で行っている生化学的解析結 果をもとにした卵巣癌病態解明，さらに新たなる 治療法開発への展開の可能性について述べること にする。 dUMP 1 1 I B i t -v

ρ

3

T

緒

Eコ 核酸(ヌクレオチド)合成経路には，de 110VO (新規合成) pathwayと salvage (再利用) pathway がある。 thymidinephosphorγlase (TP)は thymidine とthymine， みdeoxyribosel-phosphate (dR・トP)の 聞を変換するピリミジン代謝系の salvagepathway の酵素の 1つで(図1)，以前より TPの高発現が さまざまな癌の増殖・進展に関与するどされてい た は)0 1992年， Furukawa et a13) が， TPは血管新 生物質として報告されている血小板由来内皮細胞 増殖因子(platelet-derivedendothelial cell growth fac -tor: PD-ECGF) と同一蛋白であり，血管新生作用 を有すると報告して以来， TPの血管新生作用と腫 湯増殖および予後に関する研究が数多く認められ るようになってきた。 本稿では我々の教室でのデーターをもとに， TP Nucleotide synthesis dTMP... Thymidine...Thymin巴 ~dihydrothymine

TP

DPD

DNA synthesis TS: thymidylate synthase TP: thymidine phosphorylase DPD: dihydropyrimidine dehydrogenase dUMP: deoxyuridineIllonophosphate dTMP: deoxythymidine monophosphate 図 1 salvage pathwayを中心としたピリミジン代謝系

ゼ 聖母

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図2 固形癌における血管新生のシェーマ (文献4より引用) およびその関連酵素の卵巣癌における腫場生物学 的役割について解説し，卵巣癌病態解明を試みて みることにする。

1

.癌と血管新生

まず，初めに園形癌における血管新生の意義に ついて理解するために， 1971年にFolkmanが報告 した固形癌の増殖における血管新生関与に関する シェーマ4)を示す(図2)。それによると，癌はあ る一定の大きさまでは拡散 (diffusion)で新陳代謝 を行い大きくなることができる。しかしながら，そ れ以上大きくなるためには，拡散では不可能で、あ り潅流 (perfusion)つまり血流が必要となる。その ため，癌は癌細胞から血管新生物質(旬mor問angiog -enesis factor: TAF)を分泌し，既存の血管から血 管を新生し血流を獲得することにより盛んに新陳 代謝を行い，増殖・進展することができるように なる九

2

.

T

P

発現と血管新生およびアポ卜ーシスと

の関連

先に述べた固形癌における血管新生，そして血 管新生と表裏一体をなすとされているアポトーシ スに TPが如何に関わっているかについて検討を 行った5，6)。実際には，手術時摘出された原発巣の ホノレマリン固定標本を用い，抗 TPmono

c

1

onal抗 体，抗FactorVIII mono

c

1

onal抗体による免疫染色 を行った(図3，4)。血管新生は200倍当たりの微 図3 抗thymidinephosphorylase mono

c

1

onal抗体を 用いた免疫染色(明細胞癌， originalX 100) 図4 抗FactorVIII mono

c

1

onal抗体を用いた免疫 染色 (矢印:微小血管，紫液性腺癌， originalx 1 00) 図5 アポトーシス細胞(矢印) (疑液性腺癌， original沌00)

2001年9月 P < 0.01 80r 。 。 。 30 60 。 u

-ω

『 星畠

包

。

ω

診 加40 e 。 e 0. TP 1I.egative TP positive (11. = 15) (11. = 27) 図 6 thymidine phosphorylase (TP)の細胞内発現と 微小血管数 (文献5より引用) 小血管数 (MVC) により評価した。また， terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUT手biotin nick end labeling (TUNEL) methodにより apoptotic index (AI)を算出し，アポトーシスを検討した(図 5)

。

TP発現陽性は I期では 19% (3/19)で，IT-N 期では 44%(11/25)であり発現率に有意差 (P=0.022) が認められた。さらに TP発現と MVCは相関し (図 6)，AIは逆相闘を示した(図 7)。さらに， MVC が高く AIが低い群での TP発現陽性率は 64

%

秦他 13 ( % ) P = 0.015 同

ω

1.5 。 可 コ 。 -回H 。

ω

. も ，o.4a 1.0 8 _。

-

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a

a

~

0.5 e B 。 0.0 TP negative TP positive (且=30) (且=14) 図 7 thymidine phosphorylase (TP)の細胞内発現と apoptotic index 文献 6より引用) (7/11) で MVCが低く AIが高い群の 9% (1/11) に比べて有意に高値で、あった (P=0.024)。 したがって， TPの細胞内発現は血管新生を促進 しアポトーシスを抑制することにより，卵巣癌の 増殖・進展に関与しているのではないかと考えら れた。

3

.

T

P

およびその関連酵素発現と予後

次に図 8に示すように TPm貯-fA発現についてs2 microglobulin (s2 MG) を innercontrolとする RT-500 ng of totaI RNA

↓ ← … …

ynth凶 山 (Pharmacia-LKs) Complement

a

J

.

y

DNA (cDNA)

PCR mixture (finaI volome: 10 pI) Condition of PCR

. cDNA del'Ived from 5 ng of RNA . denaturation at 940_{C for 1 min} primerfol'!.P?~~e (10p~ol) . anneaIing at 580_{C fo・'l1min} . primer for s2・.MGgene(5 pmoI) xtension at 72 oC fol'1 min . deo勾rnuc¥eoitidetriphosphate (200 jlmoI) ・[α.32PldCTP(371EBq)(30cycles) . Taq polymerase (0.1 unit) 図 8 RT-PCRのプロトコーノレ (TP:thymidine phosphorylase， s2MG: s2microglobulin)

-

1

5

2

b

p

・

1

2

0

b

p

TP

炉

s

_{2M G}

炉

9

図 9 RT手CRの結果 TP : thymidine phosphorylas，巴 s2MG: s2micr可lobulin，1-5:卵 巣 癌 ¥ 6，7 : 良性卵巣腫湯， 8: MCF-7 (negative control)， 9:胎盤 (positivecontrol)) /

8

7

6

5

4

3

2

1

P=O.005 P=O.005 p= 0.0005 6 6

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8

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5 必 値 τ ミ d 車 。 情 的 m 州 w h_島岡 ω ω 割 前 w 同 島 ] 戸

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2 1 5 4 3 回 。 何 回 凶 ω_﹄ 島 岡 山 w ω 固 ω 同 月 間 F H

8

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i

p

2 1 poorJy Histological gl百de 組織学的分化度と thymidinephosphorylase (TP) mRNA発現 (LMP: low malignant potential，文献 7より引用) JJloderately well LMP

。

図 11 III・IV FIGO stageとthymidinephosphorylase (TP) mRNA発現(文献 7より引用) FIGO Stage 1.11

。

図 10 発が認められた症例は非再発例に比較して有意に 高いTP発現を示した(図 12)。さらに， TP発現の 高い群はTP発現の低い群比較して予後不良であっ た(図13)。しかしながら， TP発現に臨床的およ び病理組織学的因子を加えた多変量解析では， TP 発現は独立した予後因子とは成り得なかった(表 1)。 次にTPの関連酵素である dihydropyrimidinede司 PCRを行った7)。その結果，卵巣癌では良性腫療 に比較してTP発現が高く，また，卵巣癌個々の症 例でその発現が異なることが明らかとなった(図 的。そこで， TP発現と臨床的および病理組織学的 因子との相関について解析を行った。 TP発現と臨 床進行期および組織学的分化度との聞にはそれぞ れ有意な相闘が認められた(図 10，11)。また，初 回手術時に completeresectionが行われ，その後再

15 秦他 2001年9月 p= 0.049 6

。

。

。

。

。

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8

8

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48

5 4 3 2 1 図 。 判 的 国 m u_﹄ 臥 同 ω ω M H ω 同 A L F

B

reCUl'rence(+ ) reCUl'l'enCe (-)

。

再発の有無と thymidinephosphorylase (TP) mRNA発現(文献7より号￨用) TP gene expre田lon< 0.93 (n= 22) (%) 100 80

a

g

間 宮 下 旬 開 ω k v 宮 国 岡 田 園 田 UU4 20 図12 p= 0.021 TPgene聞presslon注0.93(n =25) 60 40

。

Months after surgery thymidine phosphorylas巴 (TP)mRl叫A発現と予後(文献7より引用) 140 120 100 80 60 40 20

。

図13 Cox I'egression analysisを用いた多変量解析 表1 P value A 守 口 U H り 95 %CI

1

.

1

-

130.4 Hazard ratio 4.19 FIGO stage 1-II (N :=22) vsIII -IV (N"， 25) Variables 0.284 0.6 -6.5

1

.

1

5 Status of residual disease negative (N = 34) vs positive (N :=13) 0.083 0.8-7.9 3.00 Grade 0.34 0.5 -13.8 0.91 others (N:=34) vs poorly (N ==13) TP gene expression < 0.93 (N:=22) vs注0.93(N:= 25) TP : thymidine phosphOlγlase

，

CI: confidence interval

Low TPIDPD(n

=

43)a 自:即時hJIu--・・1・・・…ーl...J.. JUl...・・・"・1・圃胃.・……..・・・・・・・l....・l 1JI1I..I1..・ .・....且 ， i...l.l….且し………比…H・a・...・H・...1..・……J Low

T

P

gene expression (n= 43)b

b

3 0 5

0

占

a vsd p = 0.0002 b vsc P = 0.02 HighTPIDPD(n= 42)d

O

5

Years 日 U 4 E E A

図

14 thymidine phosphorylase (TP) mRl叫A発現およびTPmRNA発現/dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) mRNA発現比と予後(文献8より引用) 表2 Cox regression analysisを用いた単変量解析及び多変量解析 Variables Univariateb MullivariateC P value Hazard mtio(95 % CI) P value Age (years) 三 三54(median; n = 43)vs> 54 (n= 42) 0.21 NA NA Histologic type serous (n= 39)vsothe四(n=46) 0.83 NA NA Histologic gmde poorly (n= 26)vsothers (n= 59) 0.03 1.4 (0.9 -2.3) 0.13 FIGO stage 1 -II(n= 34)vsIII -IV (n= 51) 0.0002 2.9 (1.3 -12.4) 0

∞

，

9 TP/DPD' Low(三median;n = 43)vshigh (n= 42) 0.0002 3.9 (1.7・16.4) O.α)02 Status or residural disease negative (n= 57)vs positive (n= 28) O.

∞

8 1.5 (0.9 -2.5) 0.12 TP， thymidine phosphorylase; DPD， dihydropyrimidine dehydrogenase; CI， confidence interval; b NA， not analyzed;" the ratio orTPtoDPD gene expr.町sion;v log-rank t田;tV Cox's proportional hazard mode hydrogenase (DPD)のmRNA発現についてTPと同 様にRT・PCRにより検討した自)0DPD発現はTP発 現と異なり，いずれの臨床病理因子とも相聞をし なかった。また，低DPD発現群は高DPD発現群 に比較して予後不良の傾向を認めたが有意差は認 めなかった。そこで予後に対するTP発現のnegative effect， DPD発現のpositivee恥ctを考慮しTP発現 とDPD発現の比 (TP/DPDratio)について検討を 進めた。その結果，高 TPIDPD群は低 TP/DPD群 に比較して有意に予後不良であり，その危険度は TP単独高発現群より増強していることが判明した (図14)0 また，多変量解析の結果 ，TP/DPD ratio は独立した予後因子であることが示された(表 2)。 よって， TPIDPD ratioは卵巣痛においてaggressive

2001年9月 tumor phenotypeを示唆し，予後不良例を治療開始 前に区別できるのではないかと考えられる。

4

.

T

P

お よ び そ の 関 連 酵 素 の 生 物 学 的 意 義 図 1の pyrimidine代謝系の salvagepathwayに示 す deoxythymidinemonophospate (dTMP)

，

thymidine は 血 管 新 生 を 阻 害 す る と さ れ て い る 9)。さらに dTMPの細胞内濃度増加は allostericchangeを引き 起こすことにより ribonocleotidereductaseの作用を 抑制し， dTMP以外の他の deoxyribonucieotidesの 合成を低下させる 10)。そのため， DAN合成が低下 しアポトーシスが充進して細胞死につながる。 TP により thymidineが thymineとdR・l-Pに変換される ことにより dTMP，thymidineの細胞内濃度が減少 し，血管新生が充進し， DNA合成が盛んに行われ， 細胞はアポトーシスから免れる 9)。また， dR・I・.p 自体も血管新生促進作用を有している11)0DPDの downregulationは TPの作用を superimposeするもの と思われる。 以上のような理由で， TP発現元進， DPD発現低 下は癌の増殖・進展に関与していると考えられる。

4

.

新 し い 卵 巣 癌 治 療 へ の 展 開 TPは ふfluorouracil (5-FU)の prodrugである 5' -deoxy-5-f1uorouridine (5'-DFUR)を 5・FUに変換す る酵素であり， TP活性が高い癌組織では 5'一DFUR は選択的に 5-FUに変換されて抗腫湯効果を発揮す るとされている 12)0 3次元微小血管新生モデルを 用いた的vitroの検討では， 5'-DFURは血管新生を 抑制することが明らかとなった13)。また， 5'-DFUR とTPを同時に投与すると血管新生抑制は助長され ることも判明した。さらに， TP活性の高い卵巣痴 愚者腹水を mediumと 5'-DFURを投与した場合に も血管新生が著明に抑制された13)。つまり， TP活 性が克進している場合には 5'-DFURから効率的に 変換された 5-FU自体に強い血管新生抑制作用があ ることが証明された13)。 DPDは 5-FUを不活性化する作用を有している。 我々の検討で、予後不良で、あった

TP/DPD

ratioの高 い腫蕩では 5'-DFURの抗腫療効果が期待でき，予 後改善の可能性が存在するかもしれない。さらに， 17 様々な癌細胞株のヌードマウスでの移植実験で，最 近卵巣痛治療に用いられてきている paclitaxelに TP 活性増強効果が証明られている 14)。したがって， paclitaxelと 5'-DFURの併用療法が今後考慮される べきであると恩われる。 一方， TP阻害剤 (TPI)の開発も試みられてい て，血管新生抑制・アポトーシス促進作用が報告 されている15)。

おわりに

卵巣癌病態解明について我々の教室でのデーター をもとに解説した。今後，更なる検討を基礎的・ 臨床的に加え，様々な問題点を解決して，個々の 卵巣痛で生じている生物学的変化を客観的に評価 しながら，個々の卵巣痛に適した治療法の開発を 目指して行きたいと考えている。

文 献

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