18 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol,49No,1(2004)
Review
プロテインスプライシング反応の化学機構
水谷隆太 ・佐藤能雅 ・安楽泰宏
遺伝 情報をmRNAの
レベルではなく,蛋 白質の レベ ルで自己触媒的に再編集 し,活 性型の成 熟
した2つ の酵素を産みだす機構 が自然界に存在 する,2つ の酵素 に対す る構造遺伝子 が1つ の オ
ペ ロン内 に"組み継 がれだ'かたちで編成 され てお り,産 生 された前駆体ポ リペプチ ド鎖 がそ の
分子 内の化学反応 により,速 やか に,そ の分子内の両端 に位置す るポ リペ プチ ド鎖 領域(エク ス
テイ ン)に挟まれた中間の ポリペプチ ド鎖領域を活性な蛋 白質(インテイン)として切断遊離 し,
両端 のエ クス テインは連結 されて活性型 の蛋 白質 とな る,こ の機構は プロテイ ンス プラ イシ ン
グ とよばれ,新 た な蛋 白質の調製法 としても実用化 され た.こ のスプライシング反応の化学 機
構 のキーステ ップの解 明を目指 して,遺 伝子工学 的に前駆体 ポ リペ プチ ドを作製 し,そ のX線
結 晶構造解析 を行な った ところ,ス プライシング反応 部位 に生 じる5員 環チア ゾリジン中間体
を介す るN→Sア
シル 転位が初発反応 とな り,一 連 の切 断一連結過程 が進行 すること が判 明 し
た.本 稿では,こ の新 しい蛋白質化学の誕生に至 る研究構想 とその展 開の軌跡を紹介 する.
プロ テイ ンスプライシング
エ ン ドヌク レアーゼ
翻訳後修飾
遺伝 子 ホー ミング 反 応機構
は じめ に
プ ロ テ イ ンス プ ラ イ シ ン グ(蛋 白 質 組 み 継 ぎ)反 応 は
1990年 に 日本 の 研 究 室 で 発 見 さ れ た.そ
の 化 学 機 構 の
根 幹 を な す 初 発 反 応 を前 駆 体 ポ リペ プチ ドの結 晶構 造 解
析 に よ り解 明 し よ う とす る構 想 も 日本 で 生 ま れ,そ れ は
結 実 した.本 稿 は,プ
ロ テ イ ンス プ ラ イ シ ング反 応 研 究
の タペ ス トリー を,筆 者 ら の研 究 を縦 糸 と し,世 界 で の
そ れ を横 糸 と し て紡 こ う と して い る.こ れ らの 研 究 の 流
れ と評 価 は最 近 の 総 説 に 取 りま とめ られ て い る1∼5).
Ⅰ.プ ロ ロ ー グ
プ ロテ イ ンス プ ラ イ シ ング 反 応 の発 見 の端 緒 は 当 時 の
東 京 大 学 理 学 部 の 安 楽 研 究 室 にあ っ た.安 楽 は,ポ ス ド
ク時 代 をNIHで
過 ご し,大 腸 菌 ペ リプ ラ ズ マ の 生 理 機
能 を物 質輸 送 の 切 り口 か ら研 究 して い た6).1970年
代 の
後 半,大
隅 良 典 博 士 と と も に,酵 母 の 液 胞 のエ ン ドプ ラ
ズ マ の 生 理 機 能 の 解 明 を 目指 し て,液 胞ATPaseの
研
究 を 開 始 した7・8).この研 究 領 域 は 幅 広 く展 開 し,ATP
合 成 酵 素(FIFo-ATPase)と
対 置 さ れ る重 要 な 分 野 へ と
成 長 し た9).こ れ ら研 究 の 基 盤 が 細 胞 内 イ オ ン の 恒 常 性
維 持 機 構 と そ れ に か か わ る物 質 の 能 動 輸 送 系 の 生 化 学 的
解 明 に お か れ て い た の で あ る.1990年,安
楽 研 究 室 の
Hirataら
は,液 胞ATPaseの
触 媒 サ ブ ユ ニ ッ ト遺 伝 子
(VMA1)の
オ ペ ロ ン構 造 を 解 明 し,VMA1遺
伝 子 が2
つ の 酵 素 情 報 を組 継 い で い る こ とを発 見 した10).そ の 結
果,研
究 の 局 面 が 大 き く転 回 し,蛋 白 質 の翻 訳 後 修 飾 の
生 化 学 を 中 心 に据 え た研 究構 想 が 練 られ た.
細 胞 内 で の 前 駆 体 ポ リペ プ チ ドの ス プ ラ イ シ ング 反 応
は き わ め て 速 く(2∼3分),反
応 中 間 体 を捕 捉 す る こ と
は 困 難 で あ っ た が,Kawasakiら11)の
努 力 に よ りin vitro
の ス プ ラ イ シ ン グ反 応 系 が確 立 され,ス
プ ラ イ シ ン グ反
応 の 新 規 性 とそ の 実 態 を把 握 す る こ とが で き た.反 応 は
きわ め て 精 密 で あ り,副 産 物 の 生 成 は ま っ た く認 め られ
な か っ た の で あ る.安 楽 らは,こ の 反 応 が新 しい 蛋 白 質
化 学 を 開拓 す る で あ ろ う こ とを即 座 に 直 感 し て い た.
Ryuta Mizutani,Yoshinori Satow,東 京 大 学 大 学 院 薬 学 系 研 究 科E-mail:satow@mol.f.rtokyo.ac.jp Yasuhiro Anraku,帝 京 科 学 大 学 理 工 学 部
Discovery, analysis and chemical mechanism of protein splicing
19 蛋 白 質 核 酸 酵 素VoL49No.1(2004)
そ の 後,分
子 遺 伝 学 の 手 法 を取 り入 れ る こ とに よ り,
手 法 の 範 躊 で 解 明 で きるす べ て の こ とが ら を実 証 す る構
想 を た て,研 究 を実 行 した.す な わ ち,反 応(中 心)に 参
画 す る ア ミ ノ酸 残 基 の特 定12・13),反応 の 自 己 触 媒 性14),
反 応 を進 行 させ う る最 小 の エ ク ス テ イ ン部 分 の分 子 量 の
決 定 と,反 応 が 前 駆 体 ポ リペ プ チ ドの 分 子 内 あ る い は分
子 間 で 進 行 す る の か の 識 別11,14),反応 に必 須 な残 基 へ の
変 異 導 入 に よ る 残基 の 同 定 とそ の抑 圧 変 異 の 解 析15)な ど
で あ っ た.1997年
ま で の 期 間,わ ず か3名
の 院 生 が こ
れ らの 諸 問 題 の解 析 に そ の優 れ た才 能 を傾 注 し,成 果 を
論 文 と して 報 告 した,大
矢 禎 一 助 手(当 時)が 確 立 し た
vma変
異 の 表 現 型(カ ル シ ウム 感 受 性)が そ の歩 み を強 力
に 支 援 した16).ゆ っ く り と確 実 に解 析 の 環 を広 げ,個 別
に 問 題 を解 明 しつ つ,常
に世 界 の 先 頭 に 立 っ て い た.
生 化 学 は 問 題 を決 定 論 的 に解 決 す る こ とが で き る.蛋
白 質 の 機 能 解 明 の歴 史 が そ の こ と を 教 え て き た.1996
年 当 時,Perlerら
の グ ル ー プ は,好
熱 細 菌 お よ び 酵 母
に お け る プ ロ テ イ ンス プ ラ イ シ ング 反 応 の 分 子 機 構 を 生
化 学 的 解 析 手 段 に よ り研 究 して い た17).興 味 深 い 発 見 は
あ っ た が,結 論 へ 導 く決 定 的 な証 拠 に は ま だ 遠 い 状 況 で
あ った.筆
者 らが 得 て い た 分 子 遺 伝 学 の 知 見 は,こ
の ス
プ ラ イ シ ン グ機 構 が,蛋
白 質 の3次 元 構 造 に よっ て 担 わ
れ た,特 異 的 な化 学 反 応 に よっ て 始 動 され る こ と を示 し
て い た.
1995年 ご ろ まで に 整 備 さ れ た 実 験 結 果 と反 応 機 構 に
関 す る概 要 モ デ ル の 検 討 か ら,3次
元 構 造 の解 析 が ス プ
ラ イ シ ン グ反 応 機構 を解 く唯 一 の 方 策 で あ る と考 え られ
た.研
究 の 新 た な デ ザ イ ンが 考 案 され,基
本 と な る前 駆
体 ポ リペ プ チ ド,と くに エ ク ス テ イ ン領 域 の 役 割 を担 う
プ ロペ プ チ ドの 設 計 が さ ま ざ ま に試 み ら れ,そ れ らの 調
製 と精 製 蛋 白質 標 品 の 検 定 が 巧 み に立 案,実
施 さ れ た.
両 端 の プ ロ ペ プチ ド問 に イ ンテ イ ンを 含 ん だ 形 の 蛋 白 質
を 結 晶 化 す る 条 件 の ス ク リー ニ ン グ,結
晶 のX線
回 折
実 験 とデ ー タ解 析 が く り返 され,や が て 問 題 の 大 筋 は解
明 され た18).こ の 間 に,酵 母 ゲ ノ ム の 全 塩 基 配 列(染 色
体 数 は16本
で,13.5Mb)は1996年
に 解 読 さ れ て い た.
総 数 が お よ そ6,200の 遺 伝 子 の う ち で,脇1遺
伝 子 の
み が 遺 伝 情 報 を組 み継 い だ オペ ロ ン構 造 を 獲 得 して い た
の で あ る.
Ⅱ.研 究の第1ス テー ジ:生 化学 と分子遺伝学か らのア
プローチ
1.VMA1オ
ペ ロンの構 造
VMA1遺 伝 子 産 物 は 酵 母 液 胞ATPaseの
触 媒 サ ブ ユ
ニ ッ トA(分 子 量70K,図1)で あ る.Hirataら10)は, 精 製 し た 触 媒 サ ブ ユ ニ ッ トAをTPCK-ト リ プ シ ン で 消 化 し て6種 類 の ペ プ チ ド フ ラ グ メ ン ト を 分 離 し,そ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 決 定 し た.こ の 情 報 に 基 づ い てVMA1遺 伝 子 を 含 む ク ロ ー ン(RH151:塩 基 長 は4.8kb,塩 基 部 位 は −585∼ +3,497)を 単 離 し,そ の 解 析 か ら 以 下 の 知 見 を 得 た.①VMA1遺 伝 子 は 全 長1,071ア ミ ノ 酸 残 基 の ポ リ ペ プ チ ド(120K)を コ ー ド す る 単 一 のORFを も つ.② 開 始 コ ド ンATG(+1∼+3)の5'上 流 域 にTATA 類 似 配 列 お よ び 酵 母 の 転 写 開 始 部 位 を も ち,3'下 流 領 域 に 転 写 終 結 シ グ ナ ル が 位 置 し て い る.③VMA1遺 伝 子 は 単 一 のmRNA(3.5kb)に 転 写 さ れ て い る.こ れ ら の 事 実 か ら,VMA1遺 伝 子 が 単 一 オ ペ ロ ン で あ る こ と が 明 ら か に な っ た(図1).2.臨41遺
伝子は2つ の蛋白質情報をもつ
VMA1遺 伝 子 の 構 造 が 解 明 さ れ た の ち,ATPaseの
70K触 媒 サ ブ ユ ニ ッ トA(Vmalp)は,な ぜ120Kポ リ ペ プ チ ドの サ イ ズ に 相 応 す る 単 一 遺 伝 子 座 に よ っ て コ ー ドさ れ る の か と い う 難 問 に 焦 点 を 当 て た. 3つ の 幸 運 が あ っ た.そ の 第1は,Hirataら が 精 製 サ ブ ユ ニ ッ トの ペ プ チ ド断 片 情 報 に 基 づ い てVMA11遺 伝 子 を つ り上 げ て い た こ と で あ る.6つ の 断 片 の 全 部 が 予 想 さ れ る120Kポ リ ペ プ チ ドのN末 端 お よ びC末 端 部 分 に 存 在 し,ポ リ ペ プ チ ド中 央 部(454ア ミ ノ 酸 残 基; 50K)に は 帰 属 さ れ な か っ た10). 第2は,1988年 に,ニ ン ジ ン お よ び ア カ パ ン カ ビ の 液 胞ATPase70Kサ ブ ユ ニ ッ トの 塩 基 配 列 が 報 告 さ れ て い た こ と で あ る19,20).こ れ ら の 配 列 は,上 記 の 介 在 ポ リ ペ プ チ ド(454ア ミ ノ 酸 残 基)を 除 い た 酵 母70Kサ ブ ユ ニ ッ トA(N末 端1-283残 基 とC末 端784-1071残 基 を 連 結 し た 仮 想 産 物,図1参 照)の 配 列 と 高 い 同 一 性(62 %お よ び73%)を 示 し た.い わ ゆ る “後 の 先 ”の 好 運 で あ り,酵 母 の70K触 媒 サ ブ ユ ニ ッ トAが 異 種 蛋 白 質 を そ の 内 部 に 抱 え 込 ん で い る こ と が 示 唆 さ れ た.20 蛋 白質 核 酸 酵 素Vol.49No.1(2004) 第3は,こ の50K介 在 ポ リ ペ プ チ ドが,酵 母 の 性 接 合 ス イ ッ チ ン グ に 関 与 す る2本 鎖DNA切 断 酵 素 のH0 遺 伝 子21)と 唯 一,有 意 な 同 一 性(34%)を 示 す こ と を 見 い だ し た こ と で あ る10).こ の こ と に よ り,内 包 さ れ て い る 酵 素 は 未 知 の 機 能 を も つDNAエ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ の フ ァ ミ リ ー で あ る と 予 想 す る こ と が で き た.
3.VMA1遺
伝子産物は翻訳後に70K触 媒サ ブユニッ ト
Aを 産み出す
ス プ ラ イ シ ン グ反 応 の 生 化 学 的 特 質 が 安 楽研 究 室 か ら
的確 に報 告 さ れ て き た 背 景 に は,2つ
の 秘 密 兵 器 の 有 効
利 用 が あ っ た こ と を述 べ て お こ う.第1は,当
時 す で に,
ATPase70K触
媒 サ ブユ ニ ッ トAのN末
端30Kポ
リペ
プ チ ドお よ びC末 端40Kポ
リペ プ チ ドに対 す る モ ノ ク ロ
ー ナ ル抗 体 が 準 備 され て い た こ とで あ る
.こ れ は,現 在,
喧 伝 され つ つ あ る プ ロ テ オ ミ ク ス研 究 の先 駆 け と して,
液 胞 膜 全 蛋 白 質 の プ ロ テ オ ー ム解 析 と,同 定 さ れ た 蛋 白
質 分 子 に 対 す る抗 体 の 生 産 プ ロ ジ ェ ク ト(梅基直 之 ら:未
発 表)の 成 果 で あ っ た.第2は,ATPaseサ
ブ ユ ニ ッ ト
の 欠 失 お よび そ の 超 分 子 複 合 体 形 成 が 変 異 を き た した と
き,宿 主 菌 は カル シ ウ ム感 受 性 の 表 現 型 を呈 す る こ と を
確 定 し て い た こ と で あ る16).こ の2つ の 解 析 方 法 は,以 下 に 記 述 す る ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 機 構 の 生 化 学 的 ・分 子 生 物 学 的 研 究 を 展 開 す る う え で き わ め て 有 効 で あ っ た. Hirataら の 第1報10)が 出 版 さ れ た 数 カ 月 後,Kaneら が 酵 母VMA1遺 伝 子 産 物 の ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 に 関 す る 論 文 を 投 稿 し,受 理 さ れ た22).こ の 論 文 は,新 し い 知 見 と し てVMA1mRNAに よ るin vitro Vmalpの 生 合 成 の 結 果 を 報 じ,翻 訳 後 の ス プ ラ イ シ ン グ の 妥 当 性 を 主 張 し た.1992年,酵 母 の 性 接 合 の 研 究 を 行 な っ て い た Thornerの グ ル ー プ が 新 規 のDNAエ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ を 精 製 し,そ の ペ プ チ ド配 列 を 分 析 し た 結 果,そ の 酵 素 が,VMA1翻 訳 産 物 か ら の ス プ ラ イ シ ン グ に よ っ て 切 り 出 さ れ る50Kポ リ ペ プ チ ド で あ る こ と を 突 き と め, VDE(VMA1-derived DNA endonuclease)と 命 名 した23,24).こ のVDEはPI-SceIと も よ ば れ て い る.
4,ス プライシング反応に関与するアミノ酸残基
Ⅱ一2で 述 べ た 酵 母 液 胞 膜ATPase70K触 媒 サ ブ ユ ニ ッ トA(Vmalp)の 仮 想 産 物 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 検 証 す る こ と に よ り,Hirataら は,Cys284お よ びCys738の 両 残 基 が と も に 切 断 に 関 与 し,そ の い ず れ か 一 方 が 再 編 集 さ れ た 成 熟 サ ブ ユ ニ ッ トに 保 留 さ れ る と 想 定 し た12).Cys 284お よ びCys738をSerに 置 換 し た 部 位 特 異 的 変 異 導 入 に よ り,こ の 想 定 が 正 し か っ た こ と,お よ び 第1切 断 点 がCys284部 位 で あ る こ と が 判 明 し た.並 行 し た 実 験 よ り,Asn737も 切 断 再 結 合 反 応 に か か わ る こ と が 示 唆 さ れ た(図2).同 様 の 結 論 は,1年 後,Stevensの グ ル ー プ に よ り 追 認 さ れ,ま たVDEのN末 端 ア ミ ノ 酸 が Cys284で あ る こ と が 証 明 さ れ た25).こ の3年 後,ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 に よ り 生 成 す るVDEのC末 端 がAsn737 で あ る こ と が 確 定 し た17).1992年 以 後,プ ロ テ イ ン ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 を 行 な う 遺 伝 子 産 物 の リ ス トは 急 速 に 拡 大 し た.こ れ ら の 配 列 デ ー タ を 基 に,ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 を 行 な う 蛋 白 質 前 駆 体 に は,共 通 に 保 存 さ れ て い る ア ミ ノ 酸 残 基(群)が あ る こ と が 突 き と め ら れ た(図2)26∼28). Kawasakiら は,反 応 に 関 与 す る ア ミ ノ 酸 残 基 を 網 羅 的 に 検 出 す る 方 法 を 駆 使 し て,配 列 相 関 と 反 応 相 関 を 実 証 す る 研 究 を 展 開 し た13).こ の 研 究 の 第1段 階 は,GST-Vma1p融 合 プ ラ ス ミ ド を 構 築 し,そ のVDE部 位 の 全 領 域 に 変 異 導 入 型PCR法(error-pronePCR法)に よ り ラ ン ダ ム 変 異 を 導 入 す る こ と で あ っ た.こ う し て 得 ら れ た 多 数 の 変 異 プ ラ ス ミ ド を 大 腸 菌 内 で 発 現 さ せ,VDE 図1プ ロ テ イ ン ス プ ラ イ シ ン グ 2つ の 酵 素 に対 す るTつ の 構 造 遺 伝 子 がmRNAに 転 写 さ れ た の ち,プ ロペ プ チ ドに 翻 訳 さ れ る.3次 元 構 造 の 形 成 と とも にス プ ラ イ シ ン グ反 応 の 始 動 を 受 け,Nエ ク ス テ イ ン(赤)とCエ ク ス テ イ ン(黄)が ペ プ チ ド結合 で 組 み 継 が れ る.そ の結 果,エ クス テ イ ン と イ ンテ イ ンが 生 成 す る,VMA1遺 伝子 の 場 合,エ ク ス テ イ ンは 液 胞膜ATPase触 媒 サ ブ ユ ニ ッ トAで あ り、イ ン テ イ ン はVma1由 来DNAエ ン ドヌ ク レア ーゼ(VDE)で あ る.
21 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.49No.1(2004) の 生 産 量 を 指 標 と し て ス プ ラ イ シ ン グ 活 性 を 評 価 し,欠 失 ク ロ ー ン の 塩 基 配 列 を 決 定 し た.変 異 部 位 はVDEの 特 定 領 域 内 に1∼6個 の ア ミ ノ 酸 変 異 と し て 同 定 さ れ た.第2段 階 は 制 限 断 片 交 換 法(restriction fragment swapping法)を 用 い て,変 異 に 直 結 す る 単 一 ア ミ ノ 酸 残 基 を 確 定 す る 作 業 で あ っ た.こ の 膨 大 な 実 験 が 遂 行 さ れ,Gly283Val,Cys284Tyr,His362Leu,Val403Asp, Ser639Pro,Asn737Ser,Asn737Lysの 諸 変 異 が ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 の 欠 損 を も た ら す こ と が わ か っ た.こ の 結 果 と 配 列 保 存 性 を 勘 案 し て,筆 者 ら は,反 応 必 須 ア ミ ノ 酸 残 基 を2群 に 分 け て 特 定 し た.す な わ ち,VDE領 域 内 のcisエ レ メ ン ト と し てCys284,His362とAsn737
を,ま た,VDE領 域 外(Vma1pの 連 結 部 位)のtransエ レ メ ン ト と し てGly283お よ びCys738で あ る13).こ の 一 連 の 研 究 か ら ,His362Leu変 異 は ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 の 第1ス テ ッ プ を 阻 害 す る こ と,VDE分 子 内 で ス プ ラ イ シ ン グ 活 性 と エ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ 活 性 は 独 立 の ド メ イ ン に 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ た.な お,Val403と Ser639の 変 異 は,VDEの3次 元 構 造 の 形 成 を 阻 害 す る こ と に よ っ て,反 応 必 須 ア ミ ノ 酸 残 基 の 配 置 に 影 響 を 与 え う る こ と が,あ と に 述 べ る 結 晶 構 造 解 析 の 結 果 か ら 明 ら か と な っ て い る.
5.ス プライシングは自己触媒的な分子内反応である
先 に 述 べ た よ う に,Kawasakiら は 試 験 管 内 ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 解 析 シ ス テ ム を 苦 心 の う え 完 成 さ せ た.そ の プ ロ ト コ ー ル は,蛋 白 質 の ア ン フ ォ ー ル デ ィ ン グ と リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ の サ イ ク ル に よ っ て 前 駆 体 プ ロ ペ プ チ ド を ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 開 始 可 能 な3次 元 構 造 に 導 き,反 応 を 始 動 さ せ,産 物 を 可 溶 性 画 分 か ら 分 離 し て 定 量 す る 方 法 で あ る11).サ イ ク ル の 至 適 温 度 は10∼15℃,反 応 収 率 は1サ イ ク ル あ た り50%で あ る.図3に 示 す 種 々 の ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 前 駆 体 プ ロ ペ プ チ ド は,大 腸 菌 内 で 過 剰 発 現 さ せ た と き に 封 入 体(inclusion body)と し て 細 胞 破 砕 液 の 沈 殿 画 分 に 蓄 積 す る.こ の 画 分 に 含 ま れ る プ ロ ペ プ チ ド を ア ン フ ォ ー ル デ ィ ン グ 緩 衝 液(6Mグ ア ニ ジ ン 塩 酸,10mMジ チ オ ス レ イ ト ー ル,pH7.0)に 懸 濁 可 溶 化 し て 回 収 し,反 応 を 進 行 さ せ た.こ の 粗 標 品 を 10mMジ チ オ ス レ イ トー ル(pH7.0)に 透 析 す る こ と に よ り反 応 サ イ ク ル を 開 始 す る.当 初 か ら,筆 者 ら は こ の ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 が き わ め て 特 異 な 性 質 を もつ こ と を 感 知 し て い た.こ の 反 応 が,汎 用 さ れ て い る 種 々 の プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 剤(3,4-DCI,E64,ペ プ ス タ チ ン,1,10-フ ェ ナ ン ス ロ リ ン)に よ っ て ま っ た く 阻 害 さ れ な い か ら で あ る11).す な わ ち,こ の 反 応 に よ る ペ プ チ ド結 合 の 切 断 は, 既 知 の セ リ ン-,シ ス テ イ ン-,ア ス パ ラ ギ ン 酸-,メ タ ロ ープ ロ テ ア ー ゼ と 異 な る 機 構 に よ っ て 触 媒 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ て い た の で あ る. そ う で あ れ ば,こ の 事 実 は 前 駆 体 プ ロ ペ プ チ ド 自 身 に よ る 自 己 触 媒 的 な 反 応 で あ る こ と を 示 し,そ の 可 否 を 直 接 実 験 に よ り 証 明 す る 必 要 が あ っ た.こ の 目 的 を 達 成 す る た め,Hisタ グ を つ け た 基 質(xc-vDE-His,図3)を 調 製 し,Ni-NTAカ ラ ム を 用 い て 精 製 し た.こ の 単 一 標 品 の み を 含 む 反 応 か ら,予 想 ど お り ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 産 物 が 特 定 さ れ た.さ ら に,こ の 試 験 管 内 反 応 が 細 胞 内 で 起 こ る ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 と 同 一 で あ る こ と を 証 明 す る た め,MIIYVG-VDE-CGER-(C末 端 領 域)の プ ロ ペ プ チ ドを 基 質 と し て 作 出 し(図3参 照),組 み 継 が れ た 反 応 図2ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 部 位 の ア ミ ノ 酸 配 列 の 比 較 ス プ ラ イ シ ン グ 部位 を構 成 す るア ミ ノ酸 残 基 を 四 角 で 囲 ん で そ の 内 部 に 表 示 し た,Cys/Ser284,H736,N737,Cys/ Ser/Thr738(残 基 番 号 はVma1の も の) は 高度 に保 存 され て い る.イ ンテ イ ン部 分 に は構 成 ア ミ ノ酸 残 基 数 を括 弧 内 に示 す,22 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.49No.1(2004)
産 物[MIIYVG-CGER―(C末
端 領 域)]を
反 応 系 か ら単
離 し,そ のN末
端 ア ミ ノ酸 配 列 を 解 析 し た.予 想 ど お
り,N末
端 配 列 は,MIIYVGCERで
あ っ た.こ
の事
実 か ら,VNA1遺
伝 子 が 「2つ の 酵 素 に 対 す る遺 伝 情 報
を過 不 足 な く保 持 し,自 己 触 媒 的 な ス プ ラ イ シ ング反 応
を介 して 蛋 白質 レベ ル で の 遺 伝 情 報 の 再 編 集 を行 な っ て
い る」 こ とが 確 証 され たの で あ る.
しか し,こ の 段 階 で,ス
プ ラ イ シ ン グ反 応 の す べ て の
実 態 が 解 明 され た の で は な か っ た.明
らか に され る べ き
も う1つ の 問 題 が 残 され て い た.そ
れ は,こ の 反応 が 単
分 子 に よる 分 子 内 反 応 か 否 か で あ る.プ
ロ テ ア ー ゼ が 基
質 蛋 白 質 を分 解 す る場 合 を考 え て み よ う.こ れ は,両 者
の 相 互 作 用 を経 る2分 子 反 応 で あ る.ス
プ ラ イ シ ン グ反
応 に お け る切 断-再 結 合 反 応 の 化 学 機 構 が 不 明 で あ る と
き,こ の可 能性,す
な わ ち2分
子 間 反 応 に対 す る検 証 を
避 け て 通 る こ とは で きな い.
Kawasakiら
は,2つ
の 組 換 えVMA1前
駆 体 と して,
MIIYVG-VDE-CGER-(C末
端 領 域)の プ ロペ プ チ ド(前
出,Eと
す る)と(N末
端 領 域)-MIIYVG-VDE-CGERの
プ ロペ プ チ ド(F)を 作 出(図3参
照)し て 精 製 し,両 者 を
等 量 ず つ 加 え た 反 応 系 で試 験 管 内 ス プ ラ イ シ ン グ反 応 を
行 な っ た.こ
の 反 応 が 分 子 間 反 応 で あ れ ば,プ
ロペ プ チ
ドFのN末
端 領 域 と プ ロ ペ プ チ ドEのC末
端 領 域 が 切
断 一
再 結 合 して 成 熟 型 の70KⅤmalpが
生 じる こ と に な
る.検 出 され た 産 物 は50KVDEと,プ
ロペ プチ ドEと
Fそ れ ぞ れ の分 子 内 反 応 に 基 づ く41Kお
よ び31Kポ
リ
ペ プチ ドの み で あ っ た.反 応 が 分 子 内 反 応 で あ る こ と を
確 定 した の で あ る.こ の こ とに よ り,ス プ ラ イ シ ン グ反
応 の 化 学 機 構 の研 究 はVma1p前
駆 体 プ ロペ プチ ドの 結
晶構 造 解 析 へ と進 展 した の で あ っ た.
Ⅲ.研 究 の 第2ス テ ー ジ:X線 回折構造生物学か らの
アプローチ
プ ロテ イ ンス プ ラ イ シ ング 反応 は,安 定 な 反 応 中 間 体
の 解 析17)か ら,4つ
の ス テ ップ を経 て 進 む こ と が 示 唆 さ
れ て い た.そ
の4ス
テ ップ と は,①N-エ
ク ス テ イ ン(宿
主 蛋 白 質 のN末
端 側 断 片)が イ ン テ イ ン(内 包 され て い
る 蛋 白 質)のN末
端 側 鎖 へ 転 位 し,②
さ ら にC-エ
ク ス
テ イ ン(宿 主 蛋 白 質 のC末
端 側 断 片)の 側 鎖 へ と転 位 さ
れ て 連 結 さ れ,③C-エ
ク ス テ イ ンがN-エ
ク ス テ イ ン と
と も に イ ン テ イ ンか ら切 り離 さ れ,④N-エ
ク ス テ イ ン
とC-エ ク ス テ イ ンが ペ プ チ ド結 合 で 連 結 さ れ る,と
い
う も の で あ る.い
くつ か の 反 応 中 間体 産 物 が 捉 え られ,
さ ま ざ ま なモ デ ル が 提 唱 され た た もの の,そ
の 間 をつ な
ぐ化 学 機 構 は依 然 と して 明 らか で なか っ た.一
方,3次
元 構 造 が 担 う特 異 的 な 自己 触 媒 反 応 に よっ て ス プ ラ イ シ
ン グが 始 動 さ れ て い る こ とは,リ
フ ォー ル デ ィ ン グ実 験
か ら 明 ら か で あ っ た.そ
こ で,反 応 を 始 動 さ せ る 構 造,
す な わ ち,Vma1p前
駆 体 プ ロペ プ チ ドの 結 晶 構 造 を解
析 し,反 応 機 構 を 解 明 す る こ と を計 画 した18).
1,前 駆体をそのまま結晶化する
前 駆 体 構 造 を 明 らか に す る た め に は,前
駆 体 を 調 製
し,そ の ま ま 結 晶 中 に 安 定 に存 在 させ な け れ ば な ら な
い.当 初,活 性 残 基 で あ るCys284とCys738をAlaに
置 換 し た 組 換 え 蛋 白 質XA-VDE(図3)の
結 晶 構 造 の 解
析 を行 な っ た が,得
られ た 構 造 はCエ
クス テ イ ン領 域
図3組 換 え 体VDEのN末 端 とC 末 端 の ア ミ ノ 酸 配 列 VMA1前 駆 体 プ ロ ペ プ チ ドの 配 列 を VDEと 並 べ た,最 下 段 は 成 熟 型VDE の配 列 で ある.青 字 で示 した の は,ス プ ライ シ ン グ活 性 に影 響 を 与 え う る残 基 で あ る,X10各 組 換 え 体 で は 置 換 変 異 し た もの を 四 角 で 囲 ん だ.右 端 の"ス プ ラ イ シ ン グ カ ラ ム に は ス プ ラ イ シ ン グ 活 性 の 有無(+/−)を 示 した.23 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.49No.1(2004)
を 欠 い て い た29).こ れ はMALDI-TOF質
量 分 析 で も確
認 さ れ た.
そ こ で,NとCエ
ク ス テ イ ン の 両 方 を よ り的 確 に反
映 し,か つ 結 晶 化 で き る前 駆 体 プ ロ ペ プ チ ドを 得 る た
め,Cys284とCys738に
加 え て,His362とAsn737に
も変 異 を追 加 し,図3の
よ うな 一 連 の 組 換 え蛋 白質 を設
計 し,発 現,精
製 した.両
末 端 に エ ク ス テ イ ン配 列10
残 基 を付 加 した こ とに 由 来 してX10シ
リー ズVDEと
名
づ け た これ らの 蛋 白 質 で は,X10SASが
最 もス プ ラ イ シ
ング 反 応 を進 行 させ に く く,連 結 プ ロペ プ チ ドが 確 実 に
得 られ る組 換 え体 のX10CNCで
は 前 駆 体 が 得 が た い(す
な わ ち,ス
プ ラ イ シ ン グ活 性 を 有 す る 組 換 え体)と 考 え
ら れ た.こ れ らの 組 換 え体 の な か か ら,精 製 と結 晶化 を
経 て も前 駆 体 と して 得 られ る境 界 線 上 の 組 換 え体 を探 し
出 し,結 晶構 造 を解 析 す る こ と と し た.
T7プ
ロモ ー タ ー に よ る 高 発 現 大 腸 菌 株 を調 製 し,菌
体 破 砕 液 の 上 清 よ り硫 安 沈 殿 と カ ラ ム ク ロマ トグ ラ フ ィ
ー3段 階 を経 て
,お の お の の 精 製 標 品 を 得 た.得
られ る
蛋 白質 は不 安 定 な もの ほ ど面 白 い は ず で,発 現 か ら結 晶
化 まで を3日 間 で終 え られ る よ う に,さ
ま ざ ま な試 料 調
製 の た め の 工 夫 を こ ら した.得 られ た 精 製X10CNSは,
ス プ ラ イ シ ン グ反 応 を経 た50Kの
バ ン ドが 主 成 分 で あ
っ た が(図4),組
換 え 体 全 長 に 相 当 す る53Kの
蛋 白 質
も 含 ま れ て い た.4℃
で 反 応 を さ ら に 進 行 させ た あ と
に,限
外 濾 過 に よ っ て 得 た 低 分 子 量 画 分 に つ い て のN
末 端 ア ミノ酸 配 列 分 析 とMALDI-TOF質
量 分 析 か ら,
Nエ
ク ス テ イ ン とCエ
ク ス テ イ ンが 連 結 さ れ た ペ プ チ
ドを確 認 した.こ
う して,X10CNSが
ス プ ラ イ シ ン グ活
性 をた しか に保 持 す る こ とが 明 らか とな っ た,
X10SNSは,53Kの
全 長 の 蛋 白 質 と し て 精 製 で き る
もの の,20℃
で結 晶 化 して い る 数 日 の 問 に 反 応 が 進 行
した(図4).結
晶 は2日
間 で 成 長 す る が,3日
か ら7日
の 問 に 徐 々 に成 熟 型 に 移 行 して い る.結
晶 そ の も の の 内
部 で 反 応 を 進 行 さ せ るX10SNSは,反
応 が や は り分 子
内 で しか も単 独 で起 こる こ と,分 子 全 体 の3次 元 構 造 の
変 化 を伴 わ ない こ と を示 して い る.し
か し,X10SNS結
晶 はX線
の 回折 分 解 能 が 低 く,こ の 段 階 で は解 析 を 見
合 わせ た.
X10SSSは,質
量 分 析 に よ る 分 子 量53,010が
計 算 値
53,078と ほ ぼ等 しい こ と か ら,前 駆 体 の ま まで精 製 し,
結 晶 化 す る こ とが 可 能 で あ っ た(図4).X10SSSはX10
SNSと
結 晶 と して 同 型 で あ る こ とか ら,ス プ ラ イ シ ン
グ 活 性 を 有 す るX10SNSの3次
元 構 造 がX10SSS結
晶
に お い て も保 持 され て い る こ と に な る.そ
こで,前 駆 体
で あ りな が ら ス プ ラ イ シ ン グ活 性 の 構 造 を保 持 して い る
組 換 え 体 と し てX10SSSを
用 い,そ
のX線
結 晶 構 造 解
析 を行 な う こ と と した.
2.前 駆体X10SSSの
結 晶構 造
X10SSSの 結 晶 構 造(Protein Data Bankコ ー ド1JVA) は,2.1Å の 高 分 解 能 で 得 ら れ た.X10SSS蛋 白 質 は, 結 晶 の 非 対 称 単 位 に2分 子 含 ま れ て い る(図5に 全 体 構 造 を 示 す).2分 子 の ス プ ラ イ シ ン グ 部 位 は,そ れ ら 構 造 問 の 根 平 均2乗 差 異 は0.30Aで あ り,ま っ た く 同 一 と い っ て も よ い.His362AsnとAsn737Serの 変 異 は, 周 辺 の 構 造 を 変 え る こ と な く 側 鎖 の み が 置 換 さ れ て い る.周 囲 を 乱 す こ と な く こ れ ら側 鎖 官 能 基 を 置 換 で き た こ と が,以 下 で 述 べ る 反 応 機 構 の 議 論 を 可 能 と す る 前 提 と な っ て い る.ま ず,X10CNS,X10SNCとX10SNSが ス プ ラ イ シ ン グ 活 性 を 示 し,X10SNS結 晶 とX10SSS結 晶 が 同 型 で あ る こ と か ら,Cys284SerとCys738Serの 変 異 は 構 造 に 影 響 を も た ら さ な い.ま た,X10SSSは 特 異 的 エ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ 活 性 を 保 持 し て お り,そ の イ ン テ イ ン と し て のVDEエ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ 部 分 が 成 熟 型 酵 素 の 構 造30)と は 差 異 が な い と の 構 造 解 析 の 知 見 と 合 致 し て い る. 図4精 製X10蛋 白 質 のSDS-PAGE X10CNSに は50Kの 主 バ ン ドと と も に53Kの バ ン ドも 見 られ る.53Kは 前 駆 体 に相 当 し 、50Kは ス プラ イ シ ング反 応 が進 んだ 成 熟 型 で あ る,X10SSSは 前 駆 体 バ ン ドの み で あ る.X10SNS は,精 製 直 後 は 前 駆 体 の み で あ る が,結 晶 は成 熟 型 で あ る.X10 SNS結 晶 を20℃ で 析 出 さ せ る と,結 晶 中 で 反 応 が進 行 して3日 か ら7日 の 間 に徐 々 に 成 熟 型 に移 行 し てい る,い ず れ も クマ シー 染 色,
24 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.49No.1(2004)
ス プ ラ イ シ ン グ 部 位 に は,Nエ ク ス テ イ ン のIle279 か らGly283とCエ ク ス テ イ ン のSer738か らArg741に 相 当 す る 明 瞭 な 電 子 密 度 が 観 察 さ れ た(図6a).Nお よ びCエ ク ス テ イ ン 部 分 に つ い て,ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 と 対 応 さ せ う る も の と し て 観 測 し た 例 は 他 に な く,X10 SSSが 唯 一 の も の で あ る.Ile280,Val282,Pro324とTyr 714側 鎖 は 疎 水 的 な 環 境 で 近 接 し て い る.Val282とGly 283はHis362とSer738の 近 傍 に 位 置 し て お り,Val282 の カ ル ボ ニ ル0原 子 はAsn359側 鎖 のNδ2原 子 と 水 素 結 合 を 形 成 し て い る(図6b).し た が っ て,こ れ ら ア ミ ノ 酸 残 基 へ の 変 異 の 導 入 は ス プ ラ イ シ ン グ 活 性 の 低 下 を も た ら す こ と に な る. Ser284主 鎖 のN原 子 はAsn359側 鎖 の0δ1原 子 と 水 素 結 合 し,Gly283とSer284の 間 の ペ プ チ ド結 合 はtrans 配 置 で あ る(図6b).GyrAは ス プ ラ イ シ ン グ を 経 て 産 生 さ れ る 蛋 白 質 で あ り(図2),そ の 結 晶 構 造 のN末 端 に は 付 加 さ れ た1残 基 のAlaが 観 察 さ れ た こ と か ら, Ala(-1)-Ser1間 のcisペ プ チ ド結 合 が ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 を 促 進 す る と の 仮 説 が 提 示 さ れ て い る3ユ).こ の 仮 説 は,ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 が 実 際 に 進 行 す る 構 造 を 反 映 し たX10SSSに お い て,Gly283-Ser284はtransペ プ チ ド結 合 で あ る と の 筆 者 ら の 結 果 か ら は 受 け 入 れ が た い. Gly283の0原 子 とS738側 鎖0γ 原 子 が3.OAと 近 接 し た 距 離 に あ り,こ の よ う な 配 置 は,の ち に 述 べ る 四 面 体 中 間 体 の 形 成 を 促 進 す る こ と を 反 映 し て い る.周 囲 の ア ミ ノ 酸 残 基 の 原 子 の 配 置 か ら も,Vmalp前 駆 体 プ ロ ペ プ チ ド で は,cisペ プ チ ド結 合 に よ る 反 応 の 促 進 は 考 え が た い. C末 端 側 に 位 置 す るSer738の 主 鎖 部 分 は,Ser738の N原 子 とIle717の0原 子 問 の 水 素 結 合,お よ びSer738 の0原 子 とThr718の0γ1原 子 の 間 の 水 素 結 合 で 安 定 化 さ れ て い る.Cエ ク ス テ イ ン のGly739か らArg741 は,Nエ ク ス テ イ ン のTyr281か らGly283の 領 域 と 短 図5X10SSSの 全 体 構 造 非対 称 単 位 に存 在 す る2分 子 の うち,一 方を 色 分 け し,*印 で プ ロ テイ ン ス プラ イ シン グ 部 位 を 示 した.右 下 の エ クス テ イ ン領 域 (N末 端側 が 赤,C末 端 側 が 黄)を ス テ ィ ック モ デ ル で 識 別 して あ る.分 子 は,酵 素 活 性 ドメ イ ン(E)と ス プ ライ シン グ 反応 ドメ イ ンに大 別 さ れ,後 者 をDNA認 識 ドメ イ ン(D)と ス プ ラ イ シ ン グ ドメ イ ン(P)に 分 割 して 考 え る こ と が で き る.2本 鎖DNAが 結 合 す る領 域 は,VDEのDNA認 識 ドメイ ンDと 酵 素 活性 ドメ イ ンEで あ り,ス プ ラ イ シ ン グ部 位 のPド メ イ ンと は 遠 く離 れ て い る.DとEの ドメ イ ン に わ た って,2本 鎖DNAはVDEと 結 合 す る, 図6X10SSSの ス プ ラ イ シ ン グ 部 位 の 構 造 (a)ス プ ラ イ シ ン グ 部位 の 差 プ ー リ工 合 成 電子 密 度 図,Nエ ク ス テ イ ン はlle279 か らGly283が,Cエ ク ス テ イ ン はSer 738か らArg741が 明 瞭 な 電 子 密 度 と し て 観 察 さ れ た.(b)ス プ ラ イ シ ン グ 部 位 のNエ ク ス テ イ ン を 赤,イ ン テ イ ン VDEを 緑,Cエ ク ス テ イ ン を 黄 色,ス プ ライ シ ン グ され る ペ プ チ ド結 合 を青 と 三 角 印 で 示 し た.Nエ ク ス テ イ ン 断 片 とCエ ク ス テ イ ン 断 片 は,イ ン テ イ ン であ るVDEの 残 基 と点 線 で示 した 水 素 結 合(数 値 は原 子 間距 離)を 形 成 し,構 造 を安 定 化 して い る,Tyr281-Gly283と Gly739-Arg741は 逆 平 行 βシ ー ト構 造 をな して お り,ス プ ラ イ シ ン グ され る ペ プチ ド結合 が近 接 して保 持 さ れ て い る.
25 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.49No.1(2004) い 逆 平 行 β シ ー ト構 造 を 形 成 し て い る.こ の β シ ー ト形 成 に よ り,N末 端 側 とC末 端 側 の ス プ ラ イ シ ン グ 部 位 が 互 い に 近 接 し,反 応 に 適 切 な コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン に 保 持 さ れ る こ と に な る.
3,プ ロテインスプライシングの化学反応機構
X10SSSの
解 析 に ひ き続 い て,は
じめ は解 析 が 困難 と
考 え て い た,結 晶 の 内部 で ス プ ラ イ シ ン グ反 応 を ひ き起
こ すX10SNSに
つ い て,結
晶 化 を 短 時 間 で す ませ る こ
とが 可 能 とな っ た32).X10SNS結
晶 を結 晶 化 液 と は別 の
溶 液 に移 し,さ ま ざ ま な時 間 を お い た あ と に,100K程
度 の低 温 下 でX線
測 定 を 行 な い,電
子 密 度 を 詳 細 に 調
べ た.結 晶 化 開 始 後26 .5時 間 を 経 た 小 さ な 結 晶 を110 Kに 冷 却 し てX線 回 折 の 測 定 を 行 な っ た 結 果,分 解 能 2.9Å で 明 瞭 な 反 応 産 物 の 構 造 が 得 ら れ た33).X10SNS で は,本 来 のAsn737(C-とN-エ ク ス テ イ ン を イ ン テ イ ン か ら 切 り離 す 役 割 を 担 っ て い る)と し た こ と か ら,反 応 が 結 晶 内 で も 徐 々 に 進 行 し,両 端 に 置 か れ た2つ の エ ク ス テ イ ン の プ ロ ペ プ チ ドが 連 結 さ れ,し か も,連 結 さ れ た 産 物 が 反 応 部 位 に そ の ま ま 留 ま っ て い た.結 晶 構 造 (PDBコ ー ド1UM2)で は,生 じ たVDEエ ク ス テ イ ン と 連 結 さ れ た 産 物 プ ロ ペ プ チ ドが 明 瞭 に 観 察 さ れ,Val282, Ser284,Asn362,His736,Gly739な ど の 主 要 な 残 基 の 配 置 と コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン はX10SSSと ほ ぼ 同 一 で あ る. 図7プ ロ テ イ ン ス プ ラ イ シ ン グ の 化 学 反 応 の 機 構 上 段 に は全 体 の反 応 ス キ ー ム を示 した,反 応 の 第1段 階 は,Nエ ク ス テ イ ンの ア シル 基 が イ ン テ イ ンVDEのN末 端 シス テ イ ン側 鎖 に 転 位 す る反 応(N→Sア シル 転位)で あ る,次 に,Nエ クステ イ ン ア シル 基がCエ ク ス テイ ンの シ ス テ イ ン側 鎖 に 転位 す る(エ ステ ル 転位),Asn 737.Cy$738間 の ペ プチ ド結 合が 切 断(コ 八 ク 酸 イ ミ ド形 成)さ れ た の ち,Nお よ びCエ クス テ イ ン が ペ プ チ ド結 合 で継 が れ る(S→Nア シ ル 転位),最 初 の2段 階の 反 応機 構 を下 段 に示 す.N→Sア シル転 位 で は,ま ずCys284側 鎖 が 活 性 化 され た の ち,Gly283主 鎖 力 ル ポ ニ ル 炭 素 を求 核攻 撃 し,複 素5員 環 であ る チア ゾ リジ ン 骨格(赤 色)を も つ 四面 体 中 間 体 を 形 成 す る.His362の 助 けを 借 りて チ ア ゾ リジ ン 環 が 開 裂す る と,チ オ エ ス テル 中 間 体 とな る,こ の 結 果 でき たCys284ア ミ ノ基 がCys738側 鎖 を 活 性 化 し,Gly283カ ル ボ ニ ル 炭 素 が求 核 攻 撃 され る と,四 面 体 中 間体 と な る.こ の ときGly283酸 素 アニ オ ン は,正 電荷 を もつCys284ア ミ ノ基 に よ り安 定 化 さ れ る.四 面 体 中 間 体 が 開裂 す る と,Nエ ク ス テイ ンのCys738側 鎖 へ の 転位 が完 了 す る,26 蛋 白 質 核 酸 酵 素VoL49No.1(2004)
こ の よ う に し て 得 た 構 造 に 基 づ い た 化 学 反 応 の 機 構 を 図7に 示 す.初 発 反 応 で あ るN→Sア シ ル 転 位(N→S acyl shift)反 応 は,Cys284側 鎖 チ オ ー ル の 活 性 化 に よ り 始 動 さ れ る.X10SSSで 観 察 し たSer284側 鎖0γ 原 子 は,Gly283の0原 子 か ら2.6Aの 距 離 で き わ め て 近 接 し,Ser738側 鎖0γ 原 子 か ら は や や 離 れ た3.6Aの 位 置 に あ る.Cys738Ala変 異 体 も 転 位 反 応 活 性 を 示 す34)こ と か ら,Gly2830原 子 がCys284側 鎖Sγ 原 子 か ら の プ ロ ト ン の 脱 離 を 促 し て い る と 考 え ら れ る.生 成 し たCys284 側 鎖Sγ ア ニ オ ン は,Gly283の カ ル ボ ニ ルC原 子 を 求 核 攻 撃 す る こ と に な る.こ の 結 果 生 じ る 四 面 体 中 間 体 で は,C原 子 が ヘ ミ ア セ タ ー ル 構 造 を と り,Cys284側 鎖 のSγ 原 子 が283-284残 基 間 ペ プ チ ド結 合 の カ ル ボ ニ ル C原 子 に 結 合 し た,含 硫 含 窒 複 素5員 環 で あ る チ ア ゾ リ ジ ン(thiazohdine)骨 格 を 形 成 す る.こ の と き,Cys738 側 鎖Sγ 原 子 は,His362側 鎖Nδ1原 子 と と も に,Gly283 の0原 子 と 近 接 し て 相 互 作 用 し,中 間 体 を 安 定 化 す る. そ の 後,Gly283のC原 子 が チ ア ゾ リ ジ ン 四 面 体 構 造 か ら カ ル ボ ニ ル 平 面 構 造 に 戻 り,チ オ エ ス テ ル を 形 成 し てGly283-Cys284間 の ペ プ チ ド結 合 が 開 裂 す る.結 晶 構 造 と し て 報 告 さ れ て い る チ ア ゾ リ ジ ン の 骨 格35)をX10 SSSの 構 造 の 中 に あ て は め て も原 子 間 に は 密 な 接 触 は な く,ス プ ラ イ シ ン グ 部 位 近 傍 は チ ア ゾ リ ジ ン 四 面 体 中 間 体 の 形 成 に 最 適 な 構 造 を 有 し て い る こ と に な る.変 異 さ せ たAsn362側 鎖Nδ2原 子 は,中 間 体 のGly2830原 子 か ら3.4Aの 位 置 に あ っ て 相 互 作 用 し う る 距 離 に あ る が,His362と 異 な り,プ ロ ト ン の 受 渡 し 能 を 欠 く た め, His362Asn変 異 は ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 の 速 度 を 減 少 さ せ る こ と に な る. 次 の 段 階 の エ ス テ ル 転 位(transesterification)反 応 は, Gly283-Cys284ペ プ チ ド結 合 の 開 裂 で 生 じ たCys284の 主 鎖 ア ミ ノ 基 が,Cys738側 鎖Sγ 原 子 の プ ロ ト ン を 引 き 抜 く こ と で 始 ま る.Ser284とSer738の 側 鎖0γ 原 子 の 問 の 距 離 は3.6Aで あ り,Cys284側 鎖 に チ オ エ ス テ ル 結 合 し て い る ア シ ル 基 が エ ス テ ル 転 位 反 応 を 起 こ す う え で 必 要 か つ 適 切 な 位 置 に あ る.エ ス テ ル 転 位 の 結 果,イ ン テ イ ン か ら切 り 離 さ れ たNエ ク ス テ イ ン とCエ ク ス テ イ ン が チ オ エ ス テ ル 結 合 で 結 ば れ る.こ の 形 の 中 間 体 に 相 当 す る も の がPAGEで 確 認 さ れ て お り,分 岐 鎖 中 間 体(branched intermediate)と よ ば れ て い る26). 次 にAsn737側 鎖 が 自 己 環 化 し て コ ハ ク 酸 イ ミ ド を 形 成 し(succinimide formation),連 結 さ れ て い るNお よ びCエ ク ス テ イ ン が イ ン テ イ ン か ら 切 り 離 さ れ る.そ の 後,連 結 エ ク ス テ イ ン 間 の チ オ エ ス テ ル 結 合 が,S→ Nア シ ル 転 位 反 応 に よ っ て ペ プ チ ド 結 合 へ と 再 生 さ れ る.こ の 状 態 を 反 映 し た も の がX10SNSの 結 晶 構 造 で あ る33).こ れ ら2つ の 反 応 ス テ ッ プ に と っ て も,X10SSS 構 造 は 適 切 な 空 間 的 配 置 を 与 え て い る こ と を,X10SNS 構 造 と の 比 較 か ら示 し た.
4、 ス プ ライ シン グと エ ン ドヌ ク レア ー ゼ 活 性―DNAと
の複合 体
最 近,VDEに2本
鎖DNAが
結 合 し た 複 合 体 の 結 晶
構 造 が3.2Å 分 解 能 で 報 告 され た36).VDEは,エ
ン ドヌ
ク レ ア ー ゼ 酵 素 活 性 を 担 う ド メ イ ンEと,ス
プ ラ イ シ
ン グ を 担 う ドメ イ ンに 大 別 され,後
者 は,DNA認
識 に
関 与 す るDド
メ イ ン とス プ ラ イ ン シ ン グ 活 性 に 直 接 的
に か か わ るPド
メ イ ンに さ ら に分 割 さ れ る(図5).複
合
体 の 構 造 で は,2本
鎖DNAが
結 合 す る 領 域 は,DNA
認 識 ドメ イ ンDと
酵 素 活 性 ドメ イ ンEで
あ り,ス プ ラ
イ ン シ ング 部位 のPド
メ イ ン とは 遠 く離 れ て い る.2本
鎖DNAは,DとEの
ドメ イ ン に わ た っ て,VDEと
結
合 す る.筆 者 らの複 合 体 の 調 製37)と結 晶 構 造 の 高 分 解 能
解 析(宮 元 ら:未 発表)の 結 果 か ら も こ の こ と は 確 認 さ れ
て い る が,こ
の解 析 で は,Pド
メ イ ン の,Eド
メ イ ン に
隣 接 した 突 き出 た ル ー プ 部 分 とDNAと
の 問 に 水 素 結 合
が 形 成 され る こ と,ル ー プ部 分 はDNA結
合 に 際 し て構
造 の 大 き な 変 化 を伴 う こ とが 見 い だ さ れ て い る.VDE
のDNA認
識 とエ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ 活 性 を担 うDとE
の ドメ イ ンか らな る ポ リペ プ チ ド領 域 は,Pド
メ イ ンが
担 う ス プ ラ イ シ ン グ反 応 と は直 接 的 な 関 与 は 少 な く,E
ドメ イ ンに 寄 生 す る形 で,ス
プ ラ イ シ ン グ ドメ イ ンが 進
化 の 過 程 で 連 結 され た もの と推 定 さ れ る.複 合 体 の 構 造
解 析 は,DNA認
識 に,Dド
メ イ ンの み な らずPド
メ イ
ン も少 なか らぬ 役 割 を果 た して い る こ と を示 唆 して い る.
おわ り に一 新 た な プ ロ ロー グ
プ ロ ロ ー グ は,安 楽 研 究 室 で の 液 胞ATPaseの
研 究
で 始 ま っ た.そ
の 触 媒 サ ブユ ニ ッ トA遺
伝 子VNA1の
オペ ロ ン構 造 の 解 明 を経 て,蛋 白 質 の 翻 訳 後 修 飾 で あ る
プ ロ テ イ ンス プ ラ イ シ ン グ の 意義 とそ の 精 緻 な 反 応 機 構
につ い て の生 化 学 ・分 子 遺 伝 学 な ど を駆 使 した 解 明研 究
へ と発 展 した.VDEに
お け る ス プ ラ イ シ ン グ の 前 駆 体
と産 物 の3次
元構 造 の 解 析 を経 て,新
た な 蛋 白 質 化 学 と
27 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.49No,1(2004)