650 Fluorophore 690 Fluorophore DMSO ( 1 x 500 μl) 1 x 1.5 ml) Opal polymer HRP Ms+Rb ( 2 x 50mL) Blocking/Ab Diluent (1 x 100 ml) 4 x 250ml) * 数量は Op

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1

Manual

Multiplex IHC

For laboratory use only. A research method for research purposes only.

Opal

TM

4-7-color Manual IHC Kit

製品情報

保存条件: 遮光冷蔵保存（4℃） ※製品受領後、Opal 色素のみ DMSO 溶解前は-20℃保存安定性: 上記保存条件で３ヶ月間は安定

適用用途: Opal 4-7-color Manual IHC kit はパラフィン切片における蛍光多重染色試薬です。製品取扱上の注意: 製品は危険物・毒劇物の人体に有害な物質は含有しませんが、作業者の安全のために使い捨て手袋・安全ゴーグルの着用をお勧めします。試薬の使用後は手洗いの実施をお勧めします。品質管理: 製品製造上の品質管理基準を満たしています。 Opal 染色について Opal 染色は単一の組織切片において複数のタンパク質分子を抗体染色する蛍光染色手法です。本方法はホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPE)における 4-7 重蛍光免疫染色法として記述します。 Opal 染色では、同一動物種由来の 1 次抗体を複数用いた多重染色が可能です。

Opal 染色は蛍光 TSA 試薬と電子レンジ処理 (microwave treatment, MWT)により、１次抗体、２次抗体を除去すると共に、組織切片の内在性ペルオキシダーゼの除去による非特異シグナルと切片が持つ自家蛍光を低減します。MWT 処理後は抗体の交叉反応性に関わらず、さらに免疫組織化学染色を繰り返し、複数種の分子を染色することが可能です。Opal 染色とマルチスペクトルイメージング装置を組み合わせることで最大６種類のマーカー分子を同時に検出し、共局在解析も可能です。凍結切片、微細針吸引生検標本などの染色についてはパーキンエルマーまでお問い合わせください。 http://go.perkinelmer.com/contactusjp Opal 4-7-plex キット構成数量（スライド）* 製品番号構成内容

Opal 4-color Kit, 50 slides NEL810001KT _{50 mL)} Opal 520 Fluorophore Fluorophore 90 Fluorophore DMSO ( 1 x 500 μL) 1 x 1.5 mL) Opal polymer HRP Ms+Rb ( 1 x 50mL) Blocking/Ab Diluent (1 x 100 mL) 2 x 250ml)

Opal 7-Color Kit 50 slides NEL811001KT _{1X Plus Amplification Diluent (2 x 50 mL)} Opal 520 Fluorophore

40 Fluorophore 570 Fluorophore 620 Fluorophore

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2 650 Fluorophore 690 Fluorophore DMSO ( 1 x 500 μL) 1 x 1.5 mL) Opal polymer HRP Ms+Rb ( 2 x 50mL) Blocking/Ab Diluent (1 x 100 mL) 4 x 250ml)

*数量は Opal Working Solution (本ページ参照)を 1 スライドあたり~150 μL 使用した場合です。

キット付属品以外に必要なもの

マテリアル試薬

 電子レンジ1000W (出力調整可能なもの)  耐熱染色バット (Opal Slide Processing Jars

製品番号: STJAR4)  染色バット

 モイストチャンバー

 疎水性バリアペン (PAP ペン Vector Labs, 製品番号 H-4000 など)  オービタルシェイカー  パラフィン切片スライド作成備品一式  免疫染色用スライドグラス  アスピレーター  キムワイプ  ピンセット  TBST 緩衝液 (洗浄液) (TBS (pH7.5), 0.025%(w/v) Tween 20)  １次抗体



封入剤

(ProLong

®

_{Diamond, Life}

Technologies など)

 キシレン  エタノール  蒸留水  過酸化水素  メタノール溶液調整 TBST緩衝液 0.025 M TRIS-HCl, pH 7.5 0.15 M NaCl 0.05% Tween®20 0.3％過酸化水素／メタノール溶液 30%過酸化水素をメタノールで 100 倍に希釈してください。 AR6 Buffer Working Solution

ペルオキシダーゼフリー水で10 倍に希釈してください。 Primary Antibody Working Solution

1 次抗体を適切な抗体希釈液で希釈してください。 Secondary Antibody Working Solution

Ready-to-Use で使用できます。マウス、ラビット由来 1 次抗体に反応します。 Opal Fluorophore Working Solution

はじめてOpal Fluorophore を使用する場合、キット付属の DMSO 75 μL で溶解します。溶解後は4℃、暗所で保管してください。

各々のOpal Fluorophore を、キット付属の 1X Amplification Diluent により 100 倍希釈し、各蛍光色素の Opal Working Solution とします。1 スライドあたり、 100-300 μL の Opal Working Solution が必要です。

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DAPI working solution

DAPI solution 2 滴を 1ml の TBST で希釈してください。希釈済みのDAPI working solution は保存できません。

使用上の注意

 シグナルが強すぎるときには、1 次抗体、２次抗体または Opal Working Solution をさらに希釈して条件検討を実施してください。  多重染色をする前に、各１次抗体を単染色にて染色性の確認をしてください。  キット付属の２次抗体（Opal polymer HRP Ms+Rb）はマウスおよびラビット１次抗体に反応します。その他の１次抗体の場合には、適切なHRP 標識２次抗体をご使用ください。  電子レンジ処理は抗原賦活、内在性ペルオキシダーゼの失活、および抗体を除去する作用があることが報告されています。  FFPE 切片の脱パラフィンにはキシレンを使用し、各染色プロセスではスライドを乾燥させないようにご注意ください。  各インキュベーションステップではモイストチャンバーを使用し、乾燥に注意してください。 (湿らせたペーパータオルを入れた遮光容器などをご使用ください)  各ステップでの溶液の持ち込みが最小になるようにしてください。キムワイプなどで適宜ブロッティングにより溶液を吸着除去します。  切片が十分に覆われるだけの十分な試薬をご使用ください。 Opal 染色手順の概要

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4 染色手順 1. 切片が貼付されたスライドを 65℃で２時間～オーバーナイトでベーキングし、スライドグラスへの接着性を高めます。 2. 脱パラフィンスライド切片を以下の順で溶媒に浸漬し、脱パラフィンします。 1) キシレン 10 分 2) キシレン 10 分 3) キシレン 10 分 4) 100% エタノール 5 分 5) 95% エタノール 5 分 6) 70% エタノール 5 分 3. 内因性ペルオキシダーゼのブロッキング 1) 0.3％過酸化水素

／

メタノールで 20～30 分間反応させます。 2) 蒸留水で洗浄します。注: 当社実績では MilliQ 水を使用するとバックグラウンド上昇の原因になります。蒸留水の使用を強く推奨します。 4. 以下手順により電子レンジ処理します。

1) スライドグラスを耐熱性染色バット中の 100 ml の Antigen retrieval solution (Citric acid solution, pH6.0)に浸漬します。

2) 耐熱性染色バットにフタをし、電子レンジの出力を 100%で 45 秒間煮沸します。 3) 電子レンジの出力を 20%にし、さらに 15 分間煮沸します。フタは外しません。 4) レンジから染色バットを取り出し、ベンチ上で 20 分以上放置し空冷します。 Note: この段階で終夜放置することも可能です。 5) TBST で洗浄します。 5. 余分な TBST を切片周囲からキムワイプを用いて拭き取ります。 6. PAP ペンを用いて切片周囲を縁取ります。 7. 切片に Blocking/Ab Diluent を滴下し、室温のモイストチャンバー中で 10 分間インキュベートします。

注: PerkinElmer Antibody Diluent / Block を使用した場合の代表的なプロトコールです。時間は適宜調整してください。

8. Blocking/Ab Diluent を吸引除去し、希釈済みの 1 次抗体を滴下（100 ~ 300 μL /tissue）します。

注：抗体濃度、反応時間は１次抗体の至適条件に従います。 9. モイストチャンバー中でインキュベートします。

10. TBST で３分間、３回洗浄します。

11. ２次抗体 Opal polymer HRP Ms+Rb を滴下（100 ~ 300 μL /tissue）し、室温で 10 分間インキュベートします。

13. 希釈済み Opal Fluorophore Working Solution を切片に滴下(100 ~ 300 μL /tissue)し、室温で３～１０分間インキュベートします。

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16. 2 種目の 1 次抗体で上記 7-12 の手順を繰り返します。

17. ステップ 13 の Opal Fluorophore Working Solution とは異なる蛍光色素の Opal Fluorophore Working Solution を切片に滴下(100 ~ 300 μL /tissue)し、常温で 3～10 分間インキュベートします。

19. ステップ 4 の電子レンジ処理を行います。

20. 3 種目の 1 次抗体で上記 7-12 の手順を繰り返します。

21. ステップ 17 の Opal Fluorophore Working Solution とは異なる蛍光色素の Opal Fluorophore Working Solution を切片に滴下(100 ~ 300 μL /tissue)し、常温で 3～10 分間インキュベートします。 22. TBST で３分間、３回洗浄します。 Opal-7-color kit の場合には、ステップ 4 の電子レンジ処理および上記 7-12 の手順を繰り返し、4 種目～6 種目の染色を行います。 23. 希釈済みの DAPI 溶液を切片に滴下し、5 分間インキュベートします。 24. TBST で３分間 1 回、蒸留水で 1 回洗浄します。 25. 退色防止剤入りの適切な封入剤を用いて封入します。参考文献

Toth, Zsuzsanna E., and Eva Mezey. "Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification

using antibodies from the same species." Journal of Histochemistry & Cytochemistry 55.6 (2007): 545-554

Stack, E.C., Wang, C., Roman, K., and Hoyt, C.C. “Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.” Methods: (2014) doi:10.1016/j.ymeth.2014.08.016.

Opal 蛍光色素の励起、蛍光波長

Excitation Emission Cap color Spectral DAPI 358 nm 461 nm Blue

Opal520 494 nm 525 nm Green Opal540 523 nm 536 nm Yellow Opal570 550 nm 570 nm Red Opal620 588 nm 616 nm Amber Opal650 627 nm 650 nm Orange Opal690 676 nm 694 nm Clear