新農業展開ゲノムプロジェクト: DREB遺伝子等を活用した環 境ストレスに強い作物の開発(プロジェクト研究成果シリーズ
518)
誌名
誌名 新農業展開ゲノムプロジェクト 巻/号
巻/号 518号
掲載ページ
掲載ページ p. 1-44 発行年月
発行年月 2014年3月
農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センター
Tsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council Secretariat
農林水産技術会議事務局
研 究 成 果 （201 4 ・3）
518 新農業展開ゲノムプロジェクト
－DREB 遺伝子等を活用した環境 ストレスに強い作物の開発－
Genomics for Agricultural Innovation
２０１４年３月
Genomics for Agricultural Innovation
－ DREB 遺伝子等を活用した 環境ストレスに強い作物の開発－
新農業展開ゲノムプロジェクト
序 文
研究成果シリーズは、農林水産省農林水産技術会議が研究機関に委託して推進した研究の成果を、総合的 かつ体系的にとりまとめ、研究機関及び行政機関等に報告することにより、今後の研究及び行政の効率的な 推進に資することを目的として刊行するものである。
この第 518 集「新農業展開ゲノムプロジェクト─ DREB 遺伝子等を活用した環境ストレスに強い作物の 開発（DREB 領域）─」は、農林水産省農林水産技術会議の委託プロジェクト研究として独立行政法人国 際農林水産業研究センターを中心に、2007 年度は「アグリ・ゲノム研究の総合的な推進（世界の食料需給 の安定に向けた研究推進）」として実施し、2008 年度から 2012 年度までの 5 年間にわたり「新農業展開ゲ ノムプロジェクト（DREB 遺伝子等を活用した環境ストレスに強い作物の開発）」として実施した研究成果 をとりまとめたものである。
毎年世界各地で発生している干ばつはコムギやイネをはじめとする様々な作物の生産に甚大な被害を与え ている。オーストラリアでは 2006 ～ 2008 年にかけて 100 年に一度の大干ばつが起こり、2010 年にはロシ アやインド、翌 2011 年には中国、北アメリカ、オーストラリア等においても大規模な干ばつが発生している。
本研究においては、環境ストレス、特に乾燥ストレス耐性に関与する DREB 遺伝子等の機能を詳細に解 明するとともに、干ばつに強い乾燥耐性作物の作出を目指して、国際農業研究協議グループ（CGIAR）に 属する国際研究機関と共同して、コムギ及びイネにこれらの遺伝子を組み込んだ系統を開発した。
本研究により開発された遺伝子組換え作物は、干ばつ被害が深刻な世界各地で利用されることが期待され ることから、遺伝子組換え作物の開発等を行っている研究機関の関係者が今後の研究計画を、国際共同研究 の推進や国際協力等に係る行政機関の関係者の方々等が今後の施策を考える上で有用であると考えている。
最後に、本研究を担当し、推進された方々の労に対し、深く感謝の意を表する。
2014 年 3 月
農林水産省農林水産技術会議事務局長 雨宮 宏司
目 次
研究の要約 ･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････１
第 1 編 環境ストレス耐性作物の分子育種技術の開発
第 1 章 制御遺伝子を用いた環境ストレス耐性作物の分子育種技術の開発 ･･･････････････････････ 14 第 2 章 機能遺伝子を用いた環境ストレス耐性作物の分子育種技術の開発 ･･･････････････････････ 20
第 2 編 環境ストレス耐性遺伝子等の作物への導入と形質転換体の耐性評価
第 1 章 小麦品種への遺伝子導入および形質転換小麦系統の環境ストレス耐性評価 ･･･････････････ 26 第 2 章 水稲への遺伝子導入および形質転換水稲系統の環境ストレス耐性評価 ･･･････････････････ 29 第 3 章 陸稲への遺伝子導入および形質転換陸稲系統の環境ストレス耐性評価 ･･･････････････････ 33 第 4 章 ネリカへの遺伝子導入および形質転換ネリカ系統の環境ストレス耐性評価 ･･･････････････ 37
Ⅰ 研究年次・予算区分 研究年次：2007 年度
予算区分： 農林水産研究委託事業 アグリ・ゲノ ム研究の総合的な推進
研究年次：2008 年度～ 2012 年度
予算区分： 農林水産研究委託事業 新農業展開ゲ ノムプロジェクト
Ⅱ 主任研究者
推進リーダー：（独）国際農林水産業研究センター 生物資源・利用領域 領域長
神代 隆 （2007 ～ 2009 年度）
末永 一博（2010 ～ 2012 年度）
サ ブリーダー（1 環境ストレス耐性作物の分子育 種技術の開発）：
（独）国際農林水産業研究センター 生物資源・利用領域 特定研究主査 篠崎 和子（2007 ～ 2012 年度）
サ ブリーダー（2 環境ストレス耐性遺伝子等の作 物への導入と形質転換体の耐性評価）：
（独）国際農林水産業研究センター 生物資源・利用領域 領域長 神代 隆 （2007 ～ 2009 年度）
末永 一博（2010 ～ 2012 年度）
Ⅲ 研究担当機関
独立行政法人国際農林水産業研究センター
（JIRCAS）
（委託先）独立行政法人理化学研究所（理研）
（委託先） 国際とうもろこし・小麦改良センター
（CIMMYT）
（委託先）国際稲研究所（IRRI）
（委託先）国際熱帯農業センター（CIAT）
Ⅳ 研究目的
1 環境ストレス耐性作物の分子育種技術の開発 本研究課題では、実験室レベルで耐性向上を付与 することが示されているシロイヌナズナや稲等の制 御遺伝子（乾燥等の環境ストレスによる遺伝子発現 を制御する転写因子や環境ストレス応答のシグナル
伝達系で働くタンパク質キナーゼ等の遺伝子）や、
シロイヌナズナの機能遺伝子（乾燥ストレス時に働 く適合溶質の合成、活性酸素の除去、植物ホルモン アブシジン酸の合成、シャペロンなどの細胞の保護 などに関わる遺伝子等）、並びにその相同性遺伝子 等を利用して、単離した乾燥耐性に関わる新規の遺 伝子の機能を解析するとともに、それらの遺伝子と 乾燥等のストレス誘導性プロモーターや恒常的発現 用プロモーターとの最適な組み合わせを探索する。
課題 2 で得られた乾燥耐性を示す系統について、導 入遺伝子やその標的遺伝子の発現を解析する。
2 環境ストレス耐性遺伝子等の作物への導入と 形質転換体の耐性評価
課題 1 で作製された DREB 等の環境ストレス耐 性を付与する可能性がある遺伝子をストレスで誘導 されるプロモーターや恒常的発現プロモーターに連 結したコンストラクトを、小麦、水稲、陸稲及びネ リカの対象品種に導入し、1 ～ 2 コピーの導入遺伝 子が挿入された形質転換固定系統を選抜する。これ らの系統を温室、スクリーンハウス（網室）、及び 隔離圃場で栽培し、乾燥ストレス条件において耐性 を示す形質転換系統を選抜するとともに、乾燥耐性 の付与程度の最も高いコンストラクトを同定する。
Ⅴ 研究方法
1 環境ストレス耐性作物の分子育種技術の開発
（1）これまでに得られた知見から、乾燥、塩、及 び低温等の環境ストレスに対して耐性を付与できる ことが示された
DREB
やAREB
、OsNAC
等の制御遺 伝子やその相同性遺伝子に関して、稲のストレス誘 導性プロモーターとの組み合わせを中心に、形質転 換のための導入遺伝子として利用できるかシロイヌ ナズナや稲を用いて検討する。これら遺伝子の機能 を一過的発現系や形質転換体の系を用いて解析し、導入遺伝子としての有効性を評価し、形質転換体の 解析技術として提供する。また、共同研究機関から 形質転換植物を輸入して、遺伝子発現解析を行う。
（2） 乾燥ストレス時に働く適合溶質の合成、活性 酸素の除去、植物ホルモンアブシジン酸の合成、シャ
研 究 の 要 約
ペロンなどの細胞の保護などに関わる機能遺伝子を 高発現させることにより、シロイヌナズナでは乾燥、
塩、および低温などの広範囲な環境ストレスに対し て耐性を付与できることが示されている。これらシ ロイヌナズナの機能遺伝子や小麦の相同性遺伝子等 を用いて稲及び小麦に遺伝子導入し、温室だけでな く圃場での乾燥耐性の評価を行う。具体的には、遺 伝子を発現させるためのプロモーターに関しては、
小麦等に由来するどの組織でも強く発現する遺伝子 のプロモーターや乾燥ストレス誘導性のプロモー ターを探索して利用する。また、複数の機能遺伝子 を導入する方法も検討し、効率良く乾燥耐性を得ら れる方法を開発する。
2 環境ストレス耐性遺伝子等の作物への導入と 形質転換体の耐性評価
（1）形質転換体の作出、固定化
JIRCAS 及び理研から供給されたコンストラク トを小麦品種 Fielder、水稲品種 IR64、陸稲品種 Curinga、及びネリカの 2 品種へ導入する。選抜マー カーとして、小麦ではビアラフォス耐性遺伝子、稲 ではハイグロマイシン耐性遺伝子を利用し、遺伝子 導入法として未熟胚を用いたアグロバクテリウム法 を用いる。ただし、陸稲では完熟胚由来のカルスに アグロバクテリウムを感染させる。作出した形質転 換体について、PCR 法で目的遺伝子の導入を確認 し、また、サザン法等によって遺伝子導入のコピー
数を調査、さらに後代において固定を検定する。
（2）温室での乾燥耐性の評価
1（又は 2）コピーの遺伝子が導入され固定した 形質転換系統は、温室・網室等の水分ストレス条件 下において、全乾物重、子実収量、水利用効率（WUE）
等を調査、対照区と比較する。形態的特性や乾燥耐 性で極端に劣悪な系統は淘汰する。
（3）圃場での乾燥耐性評価
温室等で選抜した形質転換系統は、対照品種と共 に、乾季及び潅水システムを利用することで、生育 期分けつ期から開花期にかけて水分ストレスを与え る。各系統 2m2～ 4m2／区、2 ～ 4 反復のアルファ 方画法での配置とする。生育初期の圃場被覆率、草 冠温度、葉の緑の程度、葉巻程度、出穂期、地上部 乾物重、子実収量、及び収量構成要素等を調査する。
（4）有望系統の乾燥条件での根系の調査
圃場試験で有望とされた形質転換系統について は、導入遺伝子の根系発達への影響を明らかにする ため、ストレス条件下のポットや圃場で根系の発達 を調査する。出穂期に地上部と根を採取し、深さ 0
～ 120cm における層別の根の乾物重、および地上 部乾物重を測定する。
（5）子実収量に基づく有望系統の選抜
圃場での子実収量を、水分ストレス区と対照区で 比較し、ストレスのない対照区では対照品種と同等、
ストレス区ではより高い収量を示す系統を有望系統 として選定する。
研究計画表（研究室別年次計画）
研究課題 研究年度 担当研究機関・研究室
07 08 09 10 11 12 機関 研究室
1 環境ストレス耐性作物の分子育 種技術の開発
（1） 制御遺伝子を用いた環境スト レス耐性作物の分子育種技術の 開発
国際農林水産業研 究センター
生物資源・利用領 域
（2） 機能遺伝子を用いた環境スト レス耐性作物の分子育種技術の 開発
理化学研究所 植物科学研究セン
ター
Ⅵ 研究結果
1 環境ストレス耐性作物の分子育種技術の開発 環境ストレス耐性に関わる転写因子やストレス誘 導性プロモーターの機能解析により、
OsSCZF2
等 の有用な遺伝子や、Oshox24 等のストレス誘導性 の極めて高いプロモーターを同定した。これらの遺 伝子とプロモーターの組合せ（コンストラクト）を 稲に導入し、乾燥耐性への効果を温室において確認 した。また、小麦やイネ科モデル植物のブラキポディウ ムから、ストレス誘導性の遺伝子やプロモーター を単離した。複数の有用遺伝子を同時に発現させ る IRES システムにより、オリゴ糖合成酵素である
AtGolS2
を含む 2 つの遺伝子を共発現するコンスト ラクトを作製した。耐性に関与する遺伝子及びプロモーターを組み 合わせ、小麦、水稲、陸稲及びネリカの形質転換 のために、32 のコンストラクトを開発した。これ らを導入した系統を温室や圃場で評価した結果、
AtGolS2
、OsSCZF2
、OsNAC6
及 びAREB
等 が 乾 燥 耐性の向上に効果がよりあることが示された。2 環境ストレス耐性遺伝子等の作物への導入と 形質転換体の耐性評価
アグロバクテリウムによる小麦形質転換法におい ては、選抜培地等の改良により、従来の効率を 3 倍 以上に（2.54％）改善した。14 種のコンストラクト を品種フィルダーに導入した。子実収量に基づいて 乾燥耐性を評価するために、2009 年 8 月にメキシ コでは初めての小麦隔離圃場試験の認可を得た。82 の形質転換系統を、水分ストレス下での隔離圃場に おける子実収量に基づいて評価し、乾燥耐性につい て有望な約 20 系統を選定した。
23 種のコンストラクトを水稲品種 IR64 に導入し た約 3500 の形質転換植物（平均効率 17.9％）から 約 400 の固定系統を得た。2010 年 1 月に圃場評価 のため隔離栽培許可を得、圃場での評価を開始した。
13 回の網室及び 3 回の隔離圃場等における子実収 量、草冠温度や光合成関連形質等の調査を基に、乾 燥耐性について有望な 7 系統を選定した。
23 種のコンストラクトを陸稲の普及品種 Curinga に導入し、3616 の形質転換個体を獲得した（平均 効率 7.0％）。雨よけ施設を用いた乾燥耐性評価法を 確立する一方、2010 年乾期からは、天水の隔離圃 場での乾燥評価試験を開始、258 系統について乾燥 耐性を評価し、バイオマス量や子実収量に基づいて 2 環境ストレス耐性遺伝子等の作
物への導入と形質転換体の耐性評 価
（1） 小麦品種への遺伝子導入およ び形質転換小麦系統の環境スト レス耐性評価
国 際 と う も ろ こ し・小麦改良セン ター（CIMMYT）
（2） 水稲への遺伝子導入および形 質転換水稲系統の環境ストレス 耐性評価
国 際 稲 研 究 所
（IRRI）
（3） 陸稲への遺伝子導入および形 質転換陸稲系統の環境ストレス 耐性評価
国際熱帯農業セン ター（CIAT）
（4） ネリカへの遺伝子導入および 形質転換ネリカ系統の環境スト レス耐性評価
国際農林水産業研 究センター
熱帯・島嶼研究拠 点
注）文中の図、表、写真に付した番号は、課題番号とその中の一連番号を組合せて表示してある。
（例：1 ─（1）の課題の 1 番目の図の場合は、図 11-1 と表示）
16 の有望系統を選定した。
ネリカ 2 品種については、未熟胚を利用した効率 的な形質転換法を確立し、20 種のコンストラクト を導入して、約 4000 の形質転換植物（平均 13.5％）
を得た。465 の固定系統の内 57 系統を温室で評価 した。バイオマス収量が有意に増加した 8 系統を 含め 115 系統を CIAT の圃場で評価した結果、内 2 系統は温室での評価と共通して乾燥耐性が認められ た。
以上のように、4 作物 5 品種の形質転換系統につ いて、圃場での子実収量に基づく乾燥耐性の評価を 繰り返し、乾燥耐性について約 40 の有望系統を選 定した。
Ⅶ 今後の課題
乾燥耐性の向上により効果の大きいことが認めら れた遺伝子やコンストラクト、並びにストレス誘導 性が極めて高いプロモーターは、今後、他の作物や 品種における同様の開発に利用する。耐性に係わる 遺伝子やプロモーターを同定するために開発した効 率的な遺伝子発現解析システムは、他の遺伝子の解 析に応用可能である。また、各作物で改良・開発し た効率的な形質転換法は、他の遺伝子の導入に利用 することができる。
選定した乾燥耐性の有望系統については以下の点 を検討する。
1．導入遺伝子及び下流遺伝子等の発現を確認する。
2．既存の乾燥耐性品種等を対照品種とし、規模を 拡大した複数の環境下における試験を行って、乾 燥条件下での収量の安定性を確認する。
3．導入遺伝子断片の挿入や培養変異を除去するた め、原品種あるいは実用品種を 4，5 回戻し交雑 して遺伝的背景を清浄化する。
4．マーカーの利用により既知の乾燥耐性遺伝子等 を集積、その乾燥耐性を評価する。
5．データベース等でアレルギー性等の有無を確認 する。
6．耐塩性等、他のストレス耐性を評価する。
以上から、5 ～ 10 系統を高度乾燥耐性の育種素 材として選定する。
Ⅷ 研究発表
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Arabidopsis
GROWTH-REGULATING FACTOR 7 functions as a transcriptional repressor of ABA- and osmotic stress-responsive genes includingDREB2A.
Plant Cell. 24（8）： 3393-3405.5） Fujita, Y., Yoshida, T., Yamaguchi-Shinozaki, K. （2012）. Pivotal role of the AREB/ABF-SnRK2 pathway in ABRE-mediated transcription in response to osmotic stress in plants. Physiologia Plantarum.147（1）： 15-27.
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Ⅸ 研究担当者
1 環境ストレス耐性作物の分子育種技術の開発 独立行政法人国際農林水産業研究センター
篠崎和子＊、中島一雄＊、藤田泰成＊、圓山恭之進＊、 Asad Jan、伊藤裕介、金森紀仁、秦峰、戸高大輔、
溝井順哉
独立行政法人理化学研究所植物科学研究センター 篠崎一雄＊、高橋史憲＊、浦野薫、藤田美紀、持 田恵一
2 環境ストレス耐性遺伝子等の作物への導入と 形質転換体の耐性評価
国際とうもろこし・小麦改良センター （CIMMYT）
Carolina Saint Pierre＊, David Bonnett, Hans- Joachim Braun, Jonathan Crouch, Matthew Reynolds, Huixia Wu
国際稲研究所（IRRI）
Inez Slamet-Loedin＊, Amelia Henry＊, Alexandre Grondin, Amelie Gaudin, Philippe Herve, Rachid Serraj
国際熱帯農業センター（CIAT）
石谷 学＊、Beata Dedicova, Zaida Lentini, Cesar Martinez, Jagadish Rane, Michael Selvaraj
独立行政法人国際農林水産業研究センター 石崎琢磨＊、神代隆、小原実広
Ⅹ 取りまとめ責任者あとがき
干ばつは、毎年世界各地で発生し、様々な作物 に甚大な被害を与えている。オーストラリアでは、
2006 ～ 2008 年にかけて 100 年に一度の大干ばつが 起こり、小麦の生産に甚大な影響があった。2010 年のロシアでは 130 年に一度の干ばつがあり、小麦 の生産が約 4 割減となった。同年のインドの干ばつ
では、小麦、稲に被害が出ている。翌 2011 年は、中国、
北アメリカ、オーストラリア等で干ばつが起こり、
小麦を始めとする作物に大きな被害があった。小麦 の生産は、元々雨が少ない地域に多く、世界の栽培 地域の約半分の 1.1 億ヘクタールで常時水不足によ る低収量が問題になっている。一方、稲では、天水 灌漑や陸稲栽培地域主体に、世界の栽培面積の 3 割、
約 2 千万ヘクタールで干ばつによる被害が発生して いるといわれている。このような状況から、小麦や 稲では干ばつに強い乾燥耐性品種の育成が必要と なっている。
国際農林水産業研究センター（JIRCAS）では、
長年にわたり、植物が乾燥等の環境ストレスに対応 する機構の研究に取組んできた。乾燥等によって発 現が誘導される遺伝子群を見出し、その中から、ス トレスに対して働く多くの遺伝子の発現を制御する タンパク質（転写因子）の
DREB
等の遺伝子を同 定した。さらに、これらの転写因子遺伝子の働きを 強くすると、シロイヌナズナや稲等で乾燥、塩、低 温等の環境ストレスへの耐性が向上することを温室 等の実験で明らかにした。理研では、転写因子遺伝 子ではないが、環境耐性に関与する機能遺伝子を同 定してきた。これらの成果を基に、遺伝子の機能解析をさらに 進めると同時に、水稲、陸稲及び小麦に環境ストレ ス耐性に関与するこれらの遺伝子を組込んだ系統を 作出し、実際の圃場に近い条件で耐性の向上を検証 するための研究を開始した。将来的な普及も視野に 入れ、国際稲研究所（IRRI、フィリピン）、国際熱 帯農業研究センター（CIAT、コロンビア）、及び 国際トウモロコシ・小麦改良センター（CIMMYT、
メキシコ）が遺伝子導入及び乾燥耐性の圃場評価を 担当した。乾燥耐性のような複雑な形質の評価には、
多数の系統を効率的に作出し、繰返して評価するこ とが必要で、これら 3 つの国際農業研究機関の遺伝
子導入技術や乾燥耐性の評価技術・施設を用いて課 題を推進した。
JIRCAS 及び理研で作製した 30 種以上の遺伝子 とプロモーターの組合せのコンストラクトを用いて 約 1,200 の形質転換固定系統を作出し、圃場での評 価を繰返した結果、小麦、水稲、陸稲、さらに後に 追加したネリカ品種から、乾燥耐性について有望と 考えらえる系統を約 40 選抜することができた。乾 燥耐性の向上を目指して数百系統の大規模な評価を 実施し、その中から有望な系統が得られたことから、
本研究は当初の目的（耐性遺伝子導入による乾燥耐 性の向上の圃場での検証）を達成し、また、将来の 品種化につながる優れた成果を得られたと考えてい る。ただし、乾燥ストレス下での子実収量を指標と した乾燥耐性評価であり、これまでに認められた乾 燥耐性の有望系統は、さらに評価を繰返して検証し なくてはならない。また、将来の品種化に向けては、
遺伝的背景の浄化やアレルギー性の確認等、乾燥耐 性の検証以外にも実施すべき課題が残されており、
今後も取組んでいく必要がある。
本研究課題は、開始初年目の 2007 年度は、｢アグ リ・ゲノム研究の総合的な推進（世界の食料需給の 安定に向けた研究推進）｣ として実施、次年度から の 5 年間を「新農業展開ゲノムプロジェクト（DREB 遺伝子等を活用した環境ストレスに強い作物の開 発）」として実施した。この間、本研究の推進に当 たり多くの御支援を頂いた農林水産技術会議事務局 国際研究課を始めとする関係者各位に心から謝意を 表する。また、本研究を立ち上げ、推進リーダーと して初年度から 3 年間本研究課題を推進し、その後 の 3 年間は JIRCAS 特定研究主査として推進にご 助力頂いた現アフリカライスセンターの神代隆氏に 御礼申し上げる。
（推進リーダー 末永一博）
ア 研究目的
乾燥などの環境ストレス耐性の向上に機能するこ とが示されている
DREB
等の制御遺伝子をシロイヌ ナズナやイネで高発現させることにより、乾燥、塩、温度変化などの広範な環境ストレスに対して耐性を 付与できることが示されている。しかし、これまで の解析は培養室や温室レベルの評価であり、実際の 圃場条件での評価はなされていない。そこで、本研 究課題では、国際研究機関と協力体制を敷き、実験 室レベルで耐性向上が示されている制御遺伝子や新 規遺伝子等をイネ、コムギ品種に導入し、圃場条件 において乾燥耐性等を評価し、耐性遺伝子及びプロ モーターの最適の組合せを明らかにするとともに、
耐性レベルが向上した形質転換系統を選抜すること を目的とする。
イ 研究方法
（ア） 環境ストレス耐性関連制御遺伝子の最適化 と新規遺伝子の探索
これまでに得られた知見から乾燥、塩、及び低温 等の環境ストレスに対して耐性を付与できることが 示された
DREB
やAREB
やOsNAC
等の制御遺伝子 やその相同性遺伝子に関して、形質転換のための導 入遺伝子として利用できるかシロイヌナズナやイネ を用いて検討した。これら遺伝子の機能を一過的発 現系や形質転換体の系を用いて解析し、導入遺伝子 としての有効性を評価した。さらに、環境ストレス 耐性の獲得に重要であることが明らかにされている タンパク質キナーゼ（SRK2D
）や E3 ユビキチンキナーゼ（
DRIP1
）遺伝子に関しても、ストレス耐性の獲得機構における役割を明らかにする事を目指し て解析を進めた。
（イ） ストレス誘導性プロモーターの単離と改良 土植えイネを材料として行ったマイクロアレイ解 析結果をもとに同定した乾燥ストレス誘導性遺伝子 群について、有用性が高いと考えられる遺伝子のプ ロモーターを選抜し、適切と思われる領域を PCR
法により単離した。得られたプロモーターを
GUS
リポーター遺伝子と接続したコンストラクトを作製 し、イネに導入した。得られた形質転換イネを用い て、GUS 活性を指標にして得られたプロモーター の乾燥ストレス応答性や、葉、根や種子等での組織 特異性を調べた。また、新規イネストレス誘導性プ ロモーターについて、イネ葉肉細胞プロトプラスト を用いた一過的発現実験により、シロイヌナズナの DREB1A、DREB2A あるいは AREB1 に対する応 答性を調べた。（ウ） 耐性遺伝子とプロモーターのコンストラク ト作製と組み合わせの最適化
イネやコムギへの形質転換に利用する乾燥ストレ ス耐性制御遺伝子とプロモーターの組み合わせを基 本設計した。これまでにその有効性が明らかになっ ている
DREB
遺伝子、AREB
遺伝子、OsNAC
遺伝 子とイネストレス誘導性プロモーターの組み合わせ を中心に、イネなどに導入してその最適化を試みた。ストレス誘導性プロモーターとしては、新規に単離 してプロモーターとこれまでに用いてきた
LIP9
プ ロモーター等を用いて、導入遺伝子の発現量の比較 検討を行った。得られた耐性遺伝子とプロモーター のコンストラクトを共同研究機関に提供した。（エ） 形質転換体の解析技術の提供
これまでに得られた知見から、乾燥、塩、及び低 温等の環境ストレスに対して耐性を付与できること が示された
DREB
やAREB
、OsNAC
などの制御遺 伝子やその相同性遺伝子に関して、形質転換のため の導入遺伝子として利用できるかシロイヌナズナや イネを用いて検討した。これらの遺伝子の機能を一 過的発現系や形質転換体の系を用いて解析し、導入 遺伝子としての有効性を評価した。これらの評価法 を形質転換体の解析技術として共同研究機関に提供 した。また、新規オリゴマイクロアレイを作製し て、乾燥誘導性遺伝子の検出における有効性を確か めた。さらに、共同研究機関から形質転換植物を輸 入して、遺伝子発現解析を行った。第 1 編 環境ストレス耐性作物の分子育種技術の開発
第 1 章 制御遺伝子を用いた環境ストレス耐性作物の分子育種技術の
開発
ウ 研究結果
（ア） 環境ストレス耐性関連制御遺伝子の最適化 と新規遺伝子の探索
a
DREB1
相同性遺伝子群の発現と機能解析LIP9
のプロモーターをリポーター遺伝子と結合 して用い、10 個の OsDREB1 に関してイネのプロ トプラストで一過的な転写活性化実験を行った。OsDREB1G、1H、1J は強く活性化し、OsDREB1A、
1B、1C、1E は弱く活性化し、OsDREB1D、1F、1I ではほとんど活性化が見られなかった。イネ中では OsDREB1G と OsDREB1H と OsDREB1J が DRE 配列を介した強い転写活性を有すると考えられ、有 用遺伝子として有効性が高いと考えられた。
b
AREB
ファミリー遺伝子の機能解析シロイヌナズナの
AREB1
、AREB2
およびABF3
の多重変異体を用いて乾燥耐性試験を行った。その 結果、3 個の AREB は、いずれも相補的に協調し ながら ABA を介した乾燥ストレス応答において重 要な役割を果たしていることが示された（図 11-1）。また、イネの葉肉プロトプラストを用いた一過的発 現実験の結果から、イネ細胞においても AREB1 が 機能することが示された。さらに、イネの
AREB
相 同性遺伝子OsAREB
を同定し、過剰発現する形質 転換イネを作出して、その乾燥耐性が向上すること を示した。c
OsNAC6
相同性遺伝子OsNAC5
の機能解析OsNAC6
の相同性遺伝子OsNAC5
は乾燥、低温、塩ストレスに応答することを示した。恒常的に
OsNAC5
を過剰発現したイネを、高塩濃度の土壌で生育させたところ、コントロールに比べて高い生存 率を示した（図 11-2）。マイクロアレイ解析から、
OsNAC5
は、LEA タンパク質などの遺伝子発現を調節していることが明らかになった。
OsNAC5
遺伝 子は、有効な有用遺伝子として利用できると考えら れた。d
CCCH-Type Zinc Finger
遺伝子の機能解析OsSCZF2
遺伝子は乾燥・低温ストレスによって発現が誘導された。
GUS
遺伝子を用いて根や葉で の発現を確認した。GFP
遺伝子を用いて核に局在 することを示した。OsSCZF2
遺伝子を過剰発現す るイネは、高い乾燥ストレス耐性を示した。マイク ロアレイ解析の結果、SALT
、WSI726
のような乾燥 ストレス応答性遺伝子やPR-1
のような病害応答性 遺伝子の発現が誘導されていた。強いストレス耐性 がイネに付与された事から有用性遺伝子としての利 用が期待される。（イ） ストレス誘導性プロモーターの単離と改良 土植えしたイネの灌水を停止させることによって マイルドな乾燥処理を行い、発現が誘導される遺伝 子をマイクロアレイ解析によって同定した。その中 からバックグランが低く乾燥応答性が高い 4 種の遺 伝子を選びノーザン解析を行った結果、強い乾燥応 答性を示すことを明らかにした。さらにこれらの 遺伝子のプロモーター（約 1.5kb）を単離し、プロ モーター：
GUS
コンストラクトを作製してイネに 導入し、プロモーターの乾燥応答性を調べた。その図
11-1
AREB遺伝子欠損シロイヌナズナを用いた乾燥ストレス耐性試験*
播種後 4 週間生育させた後、給水を中止して乾燥ストレスを与えた。11 日後に再給水し、1 週間 後の生存個体数をもとに生存率を算出した。5 回の独立した耐性試験（各試験とも n ＝ 14）の結 果から得た各植物体の生存率について t 検定を行 い、野生型植物と各変異体の生存率の差が有 意であるかどうかを検討した。アスタリスクは、t 検定により p<0.01 であることを示す。写真は、
乾燥 処理前と再給水後 1 週間の植物体の様子を示す。図は文献 1 から転載。
