ヌメリアイタケ (Albatrellus yasudae) CHCl

ヌ メ リ ア イ タ ケ

(Albatrellus yasudae) CHCl3

エ キ ス と ツ チ ス ギ タ ケ

(Pholiota terrestris) CHCl3

エ キ ス か ら の

A

凝 集 抑 制 活 性 物 質 の 探 索 と そ の 構 造 活 性 相 関

Search for A Aggregation Inhibitory Active Compounds

from Albatrellus yasudae and Pholiota terrestris and their Structure Activit y Relationship

平 成

29

年 度 入 学

秋 庭 愛

(Akiba, Megumi)

指 導 教 員

小 山 清 隆

目 次

序 論

第

1

章 研 究 背 景

第

1

節 認 知 症 と ア ル ツ ハ イ マ ー 型 認 知 症

... ..2

第

2

節 今 日 の ア ル ツ ハ イ マ ー 型 認 知 症 治 療 薬

... ..4

第

3

節 ア ミ ロ イ ド カ ス ケ ー ド 仮 説 と オ リ ゴ マ ー 仮 説

...10

第

4

節

A

に 作 用 す る 化 合 物

... .14

第

5

節

A

の 検 査 薬

... ..18

第

6

節 近 年 の

AD

治 療 薬 開 発

... ...19

第

2

章 研 究 対 象

第

1

節

A

凝 集 抑 制 活 性 ス ク リ ー ニ ン グ

... ...20

第

2

節 ヌ メ リ ア イ タ ケ

(Al batrell us yasudae) ... ...21

第

3

節 ツ チ ス ギ タ ケ

(Pholi ot a t errestris) ... ...24

本 論 第

1

章 ヌ メ リ ア イ タ ケ か ら の

A

凝 集 抑 制 活 性 化 合 物 の 探 索

第

1

節

A

凝 集 抑 制 活 性 を 指 標 と し た 分 離・精 製

... ...28

第

2

節 新 規 化 合 物 の 構 造 決 定

... ...31

第

3

節 既 知 化 合 物 の 構 造 解 析

... ...37

第

2

章 ツ チ ス ギ タ ケ か ら の

A

凝 集 抑 制 活 性 化 合 物 の 探 索

第

1

節

A

凝 集 抑 制 活 性 を 指 標 と し た 分 離・精 製

... ...48

第

2

節 既 知 化 合 物 の 構 造 解 析

... ...50

第

3

章 単 離 化 合 物 の

A

凝 集 抑 制 活 性 試 験

第

1

節

T h -T

法 を 用 い た

A

凝 集 抑 制 活 性 試 験

... ...58

第

2

節 単 離 化 合 物 の 構 造 活 性 相 関

... ...60

第

4

章 単 離 化 合 物 混 合 サ ン プ ル で の

A

凝 集 抑 制 活 性

第

1

節 活 性 濃 縮 に つ い て

... ...62

第

2

節 混 合 サ ン プ ル に よ る

Aβ

凝 集 抑 制 活 性 試 験 ― 評 価 方 法

...63

第

3

節 混 合 サ ン プ ル に よ る

Aβ

凝 集 抑 制 活 性 試 験 ― 結 果

... ...65

第

5

章

A

凝 集 抑 制 活 性 と

A

凝 集 物 解 離 活 性

第

1

節

A

凝 集 物 解 離 活 性

... ... ...68

第

2

節

Aβ

凝 集 物 解 離 活 性 試 験 ― 評 価 方 法

... ...69

第

3

節

Aβ

凝 集 物 解 離 活 性 試 験 ― 結 果

... ...70

総 括

... ... ...71

実 験 項

... ...74

参 考 文 献

... ...87

謝 辞

... ...94

1

序論

2

第 1 章

研 究 背 景

第

1

節

.

認 知 症 と ア ル ツ ハ イ マ ー 型 認 知 症

認 知 症 は

,

「 記 憶 障 害 」 「 見 当 識 障 害 」 「 失 認・失 行・失 語 」 「 実 行 機 能 障 害 」 を 主 な 症 状 と す る 進 行 性 の 病 で あ る

.^{1 )}

認 知 症 は 患 者 数 が 増 加 し て い る だ け で な く

( Fi gure 1) ,

家 族 が 認 知 症 を 発 症 す る と

,

そ の 介 護 の た め に 介 護 者 が 離 職 す る 場 合 も 少 な く な い

( Fi gure 2) .^{2 )}

こ れ か ら の 医 療 費 の 拡 大 や 介 護 者 の 離 職 に よ る 生 産 性 の 低 下 を 想 定 す る と

,

認 知 症 は 早 急 に 解 決 す べ き 病 の 一 つ で あ る

.

Fi gur e 1.

今 後 の 認 知 症 患 者 数 の 増 加 予 想

^{2 )}

3

Fi gur e 2.

介 護 を 理 由 に 離 職 す る 雇 用 者 数

^{2 )}

そ の 中 で ア ル ツ ハ イ マ ー 型 認 知 症

( AD)

は

,

認 知 症 発 症 原 因 の

7

割 近 く を 占 め

( Fi gur e 3) ,

そ の 発 生 率 は 増 加 し て い る

.

Fi gur e 3.

認 知 症 全 体 に お け る ア ル ツ ハ イ マ ー 型 認 知 症 が 占 め る 割 合

^{1 )}

4

第

2

節

.

今 日 の ア ル ツ ハ イ マ ー 型 認 知 症 治 療 薬

現 在

, AD

を 治 療 す る た め に

2

つ の 仮 説 に 基 づ い た い く つ か の 薬 が 用 い ら れ て い る

.

コ リ ン 仮 説 を 基 に し た ア セ チ ル コ リ ン エ ス テ ラ ー ゼ 阻 害 薬

(

ド ネ ペ ジ ル

,

リ バ ス チ グ ミ ン

,

ガ ラ ン タ ミ ン

)

と グ ル タ ミ ン 酸 仮 説 に 基 づ い た

NMDA

受 容 体 拮 抗 薬

(

メ マ ン チ ン

)

で あ る

.

そ の 他

,

症 状 の 緩 和 に 抑 肝 散

,

酸 棗 仁 湯 な ど の 漢 方 薬 が 用 い ら れ て い る

( Fi gure 4) .^{3 )}

Fi gur e 4.

今 日 の ア ル ツ ハ イ マ ー 型 認 知 症 治 療 薬

【 ア セ チ ル コ リ ン エ ス テ ラ ー ゼ 阻 害 薬 】

＜ 「 コ リ ン 仮 説 」 に 基 づ い た メ カ ニ ズ ム ＞

脳 内 の ア セ チ ル コ リ ン を 中 心 と し た 仮 説

.

通 常

,

シ ナ プ ス 間 で ア セ チ ル

コ リ ン が 受 け 渡 し さ れ る こ と で

,

情 報 の 伝 達 が 行 わ れ

,

記 憶 ・ 学 習 が な さ

れ て い る

.

そ し て

,

神 経 伝 達 物 質 の ア セ チ ル コ リ ン は 加 齢 と と も に シ ナ プ

ス か ら の 分 泌 量 が 減 少 す る

.

ア セ チ ル コ リ ン エ ス テ ラ ー ゼ 阻 害 剤 は ア セ チ

ル コ リ ン を 分 解 す る ア セ チ ル コ リ ン エ ス テ ラ ー ゼ の 働 き を 阻 害 し

,

分 解 さ

5

れ る ア セ チ ル コ リ ン の 量 を 減 少 さ せ

,

認 知 症 症 状 を 改 善 さ せ る

( Fi gur e 5) .

＜ 副 作 用 ＞

軟 便

,

下 痢

,

吐 き 気

,

嘔 吐

,

食 欲 不 振 な ど の 胃 腸 障 害 が 発 現 す る こ と が 多 い

.

リ バ ス チ グ ミ ン は 貼 り 薬 の た め 皮 膚 が 赤 く な る

,

か ゆ く な る 等 の 皮 膚 症 状

(

刺 激 性 接 触 皮 膚 炎

,

ア レ ル ギ ー 性 接 触 皮 膚 炎

)

が 現 れ る こ と が あ る

.

【

NMDA

受 容 体 拮 抗 薬 】

＜ 「 グ ル タ ミ ン 酸 仮 説 」 に 基 づ い た メ カ ニ ズ ム ＞

興 奮 性 の 神 経 伝 達 物 質 で あ る グ ル タ ミ ン 酸 を 中 心 と し た 仮 説

.

グ ル タ ミ ン 酸 は

,

通 常 は 情 報 伝 達 効 率 を 高 め て 記 憶 ・ 学 習 の 手 助 け を す る が

,

認 知 症 患 者 の 脳 で は

,

グ ル タ ミ ン 酸 神 経 系 の 過 剰 な 活 性 化 が 起 こ り

,

神 経 細 胞 を 傷 つ け て い る

. N MDA

受 容 体 拮 抗 薬 は

,

グ ル タ ミ ン 酸 に よ る 過 剰 な 神 経 系 の 活 性 化 を 抑 え る こ と で 神 経 細 胞 を 保 護 す る

( Fi gur e 5) .

＜ 副 作 用 ＞

め ま い

,

便 秘

,

頭 痛

,

腎 障 害 が 発 現 す る こ と が 多 い

.

Fi gur e 5.

コ リ ン 仮 説

(左)

と グ ル タ ミ ン 酸 仮 説

(

右

) ^{3 )}

6

【 抑 肝 散 】

＜ 構 成 生 薬 ＞

蒼 朮

,

当 帰

,

茯 苓

,

柴 胡

,

川 芎

,

甘 草

,

釣 藤 鈎

＜ メ カ ニ ズ ム ＞

セ ロ ト ニ ン 神 経 系 と グ ル タ ミ ン 酸 神 経 系 を 介 し て 生 じ る 興 奮 を 抑 制 す る

(Fi gure 6) .

神 経 の 興 奮 状 態 を 鎮 め る こ と で

,

怒 り や す さ や 焦 燥 感 を 改 善 し

,

穏 や か な 生 活 を 取 り 戻 す 手 助 け を す る

.

行 動 ・ 心 理 症 状 の 改 善 は

,

介 護 者 に も 大 き な 助 け と な る

.

＜ 副 作 用 ＞

甘 草 を 含 む 漢 方 薬 の た め

,

ア ル ド ス テ ロ ン が 増 加 し て い な い に も 関 わ ら ず

,

高 血 圧

,

下 肢 の む く み

,

血 中 カ リ ウ ム の 低 下 な ど が あ ら わ れ る 偽 ア ル ド ス テ ロ ン 症 の 症 状 が 見 ら れ る こ と が あ る

.

【 酸 棗 仁 湯 】

＜ 構 成 生 薬 ＞

酸 棗 仁

,

知 母

,

茯 苓

,

甘 草

,

川 芎

＜ メ カ ニ ズ ム ＞

ド パ ミ ン 神 経 系 と

G ABA

神 経 系 に 対 し て 作 用 す る

.

攻 撃 性 に 関 与 す る ド パ ミ ン 神 経 系 を 抑 え

,

攻 撃 性 を 鎮 め る

.

さ ら に 興 奮 を 抑 え る

GABA

神 経 系 を 活 性 化 し

,

興 奮 や 不 安 な ど を 抑 え る

( Fi gur e 7) .

睡 眠 薬 と 異 な り

,

直 接 睡 眠 を 誘 発 せ ず

,

不 眠 の 原 因 を 解 消 し

,

自 然 な か た ち で 睡 眠 に 導 く

.

＜ 副 作 用 ＞

甘 草 を 含 む 漢 方 薬 の た め

,

「 偽 ア ル ド ス テ ロ ン 症 」 が 現 れ る こ と が あ る

.

7

Fi gur e 6.

グ ル タ ミ ン 酸 神 経 系 と セ ロ ト ニ ン 神 経 系 へ の 抑 肝 散 の 作 用

8

Fi gur e 7.

ド パ ミ ン 神 経 系 と

GABA

神 経 系 へ の 酸 棗 仁 湯 の 作 用

9

こ れ ら の 薬 剤 は 認 知 症 行 動 ・ 心 理 症 状

( BPSD *¹)

に よ っ て 使 い 分 け を す る こ と が で き る

( Tabl e 1) .

Tabl e 1. BPSD

に よ る 薬 剤 の 使 い 分 け

^{4 )}

し か し

,

こ れ ら の 薬 は 症 状 の 改 善 あ る い は 症 状 進 行 の 遅 延 に と ど ま り

, AD

を 完 全 に 治 す に は 至 っ て い な い

. A D

の 根 治 を 目 指 す た め に は

,

神 経 細 胞 障 害 を 引 き 起 こ す 原 因 を 断 つ 必 要 が あ る

.

*¹ B P S D ( B e h a v i o r a l a n d P s y c h o l o g i c a l S y m p t o m s o f D e m e n t i a )

と は

,

暴 言 や 暴 力

,

興 奮

,

抑 う つ

,

不 眠

,

昼 夜 逆 転

,

幻 覚

,

妄 想

,

せ ん 妄

,

徘 徊

,

も の 取 ら れ 妄 想

,

弄 便

,

失 禁 な ど を 指 す

.

患者の状態 薬剤

無気力で活気がない

幻視・日々の症状変化・パーキンソン症状 アドヒアランスが悪い

日常生活における機能の低下 抑うつ症状がある

不安で落ち着きがなく, 攻撃性などの情緒不安定がある ガランタミン 興奮しやすく, にぎやか

夜間の異常行動

ドネペジル

リバスチグミン

メマンチン・抑肝散

10

第

3

節

.

ア ミ ロ イ ド カ ス ケ ー ド 仮 説 と オ リ ゴ マ ー 仮 説

＜ ア ミ ロ イ ド カ ス ケ ー ド 仮 説 ＞

1992

年 に 提 唱 さ れ た ア ミ ロ イ ド カ ス ケ ー ド 仮 説 は

, Aβ

ペ プ チ ド に 着 目 し て い る

.^{5 )}

神 経 細 胞 膜 に 存 在 す る ア ミ ロ イ ド ベ ー タ

( Aβ)

前 駆 体 タ ン パ ク 質

( APP)

が

, β -

セ ク レ タ ー ゼ

( BACE -1)

お よ び

γ -

セ ク レ タ ー ゼ に よ っ て 切 断 さ れ

, Aβ

モ ノ マ ー が 生 成 さ れ る

.

そ の 後

Aβ

は 凝 集 し

,

ニ ュ ー ロ ン に 沈 着

,

最 終 的 に

AD

に 至 る

( Fi gure 9) .

＜ オ リ ゴ マ ー 仮 説 ＞

2006

年 頃 か ら ア ミ ロ イ ド カ ス ケ ー ド 仮 説 と 併 せ て オ リ ゴ マ ー 仮 説 が 提 唱 さ れ る よ う に な り

,^{6 , 7 )} 2010

年 に は ，A



の 中 で も 可 溶 性 オ リ ゴ マ ー が 最 も 毒 性 が 強 い も の

^{8 - 1 0 )}

と す る 「

Aβ

オ リ ゴ マ ー 仮 説 」 が 広 く 支 持 さ れ る よ う に な っ て き た

( Fi gur e 9).^{1 1 )} Aβ

オ リ ゴ マ ー

( oli go mer )

と は ，

Aβ

ペ プ チ ド 単 量 体

(

モ ノ マ ー

: mo nomer)

が

2

分 子

(di mmer:

二 量 体

)

か ら 数 十 分 子 結 合 し た 重 合 体 の こ と で あ る

. Aβ*56 (

大 き さ が

56 kDa

の

Aβ)*²

や

Aβ

が

30

個 集 ま っ た 球 状 構 造 体 ア ミ ロ ス フ ェ ロ イ ド

( amyl o spher oidos: ASPD) *³

な ど 様 々 な 形 態 の

Aβ

オ リ ゴ マ ー が 様 々 な 経 路 で 神 経 細 胞 に 毒 性 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ て い る

.

*² Aβ*5 6 : N M D A

受 容 体 に 作 用 し

,

細 胞 内 に 過 剰 の

C a^{2 +}

を 流 入 さ せ

,

カ ル シ ウ ム カ ル モ

ジ ュ リ ン 依 存 性 タ ン パ ク 質 キ ナ ー ゼ

( C a M K I I a )

を 活 性 化 せ る

.

こ の

C a M K I I a

の 活 性 化 に よ っ て 部 位 特 異 的 リ ン 酸 化 と タ ウ の 脱 落 が 引 き 起 こ さ れ る

^{1 2 )} *³ A S P D:

興 奮 性 神 経 細 胞 に 蓄 積 し て お り

,

細 胞 外 に 放 出 さ れ る と

N A K3

神 経 細 胞 の 神 経 細 胞 死 を 引 き 起 こ す

.

ま た

A S P D

を 蓄 積 し て い た 興 奮 性 神 経 細 胞 も 異 な る メ カ ニ ズ ム で 細 胞 死 を 起 こ す

.^{1 3 )}

11

Fi gur e 9.

「 ア ミ ロ イ ド カ ス ケ ー ド 仮 説

(ピ ン ク 点 線)

」 と

「 可 溶 性

Aβ

オ リ ゴ マ ー 仮 説

(

黄 色 実 線

)

」 の 概 略 図

^{1 4 )}

12

し か し

,

こ の オ リ ゴ マ ー 仮 説 の 中 で も 「

pat hol ogical cascade

」

(Aβ

の 異 常 が 先 行 し ， そ れ に 続 い て

t au

に よ る 神 経 細 胞 障 害 が 出 現 ， 脳 構 造 の 異 常 ・ 記 憶 障 害 ・ 臨 床 的 な 機 能 異 常 が

”

順 次

”

出 現 す る と い う 直 線 的 な 仮 説

)^{7 )} (Fi gure 10)

か ら「

i nt egrati ve model

」

(t au

病 理 と ア ミ ロ イ ド 病 理 は 独 立 し て

”

並 列 的 に

”

生 ず る 病 変 で あ り ，

AD

で は 後 者 が 前 者 を 促 進 ・ 拡 散 さ せ る と い う 並 列 的 仮 説

)^{1 5 )} ( Fi gur e 11)

に パ ラ ダ イ ム シ フ ト が な さ れ て い る

.^{1 6 )}

こ の パ ラ ダ イ ム シ フ ト の 理 由 は

pat hol ogi cal cascade

で は「

A D

で は そ の 発 症 に 関 連 す る 遺 伝 子 変 異 は す べ て

Aβ

の 代 謝 に 関 連 し て お り ， す な わ ち そ の 発 症 に は

Aβ

が 必 須 で あ る 」 と い う 事 象 は 説 明 で き て も

,

以 下 の 事 象 ①

― ③

^{1 7 )}

で 矛 盾 が 生 じ た た め で あ る

.

① 認 知 症 の 発 症 時 期 に は 既 に

Aβ

は 飽

和 し て お り ， そ れ を 取 り 除 く 治 療 に よ っ て も 認 知 症 の 進 行 は 抑 制 で き な い こ と

,

② 神 経 細 胞 障 害 に は

t au

が 直 接 的 に 関 係 す る が ，

AD

で は

t au

遺 伝 子 に は 異 常 は な く ， 一 次 性 の タ ウ オ パ チ ー

(

神 経 変 性 疾 患 の 総 称

)

と は 異 な る

tau

分 子 が 蓄 積 す る こ と

,

③ 脳 幹 や 内 側 側 頭 葉 な ど の 限 局 し た 部 位 で は 正 常 加 齢 に よ る

t au

病 理 が 若 年 で も 出 現 し て い る が 認 知 症 に は な ら ず ，

t au

病 理 が

AD

の よ う に 新 皮 質 に 広 く 拡 散 す る と 強 い 認 知 症 を 発 症 す る こ と

.

①

― ③ を 解 消 し た 「

i nt egrati ve model

」 で は 以 下 の よ う に な っ て い る

. 1)

皮 質

下 の タ ウ オ パ チ ー は

,

多 く の 人 に 出 現 す る

AD

の 病 態 生 理 学 的 変 化 の 最 初

の プ ロ セ ス で あ る が ，そ れ 単 独 で は

A D

に は 至 ら な い

. AD

で は ，

2) Aβ pat ho - physi ology

が こ の 皮 質 下 の タ ウ オ パ チ ー と は 独 立 に 遅 れ て 出 現 す る

.

そ し

て

3) Aβ*56

な ど の メ カ ニ ズ ム に よ っ て ，

Aβ

病 態 が ， 先 行 す る 皮 質 下 の タ

ウ オ パ チ ー を 質 的 に 変 化 さ せ ， ま た ， 変 化 を 加 速 さ せ て 神 経 原 線 維 変 化

( NFT)

の 新 皮 質 へ の 拡 散 を 引 き 起 こ す

.

13

Fi gur e 10.

旧

Aβ

オ リ ゴ マ ー 仮 説

A D

に は

Aβ

オ リ ゴ マ ー が 重 要 で ，

Aβ

オ リ ゴ マ ー が 神 経 原 線 維 変 化 と 神 経 細 胞 変 性 を 惹 起 す る

.

そ れ ぞ れ の イ ベ ン ト は

”直 列 的”な 因 果 関 係 で 連 続 す る ．

Fi gur e 11.

新

Aβ

オ リ ゴ マ ー 仮 説

A D

に お け る

t a u

病 理 と

Aβ

病 理 は 独 立 に

”並 列 的”

に 出 現 す る

. t a u

病 理 は

Aβ

病 理 よ り も 先

行 し て 生 じ る が

,

正 常 な 脳 で は 内 側 側 頭 葉 の み の た め

,

重 度 の 認 知 症 の 原 因 に は な ら な い

.

し か し

, A D

で は

Aβ

病 理 が 出 現 す る こ と で

,

先 行 す る

t a u

病 理 が 広 く 新 皮 質 に 拡 散 し て し

ま い ， そ の 結 果 ， 広 範 な 神 経 細 胞 障 害 を 生 ず る ．

14

第

4

節

. Aβ

に 作 用 す る 化 合 物

^{1 8 )}

Aβ

に 作 用 す る 化 合 物 は 天 然 物 由 来 の エ キ ス や

,

合 成 品 な ど 多 々 報 告 さ れ て い る

.^{1 9 )}

ミ リ セ チ ン

2 0 - 2 3 )

や ロ ス マ リ ン 酸

2 2 , 2 4 )

と い っ た 緑 茶 等 の 天 然 フ ェ ノ ー ル 化 合 物

( Fi gur e 13, 14),

ウ コ ン の ク ル ク ミ ン

2 4 , 2 5 ) ,

ブ ド ウ の 種 抽 出 物 メ ガ ナ チ ュ ラ ル に 含 有 さ れ る タ ン ニ ン 類

^{2 6 )} ,

合 成 化 合 物 の

NG A,^{2 6 )}

放 線 菌 か ら 単 離 さ れ る 化 合 物

(

リ フ ァ マ イ シ ン

)

か ら 半 合 成 さ れ る 抗 生 物 質 リ フ ァ ン ピ シ ン

2 7 , 2 8 )

な ど で あ る

(Ta bl e 2, Fi gur e 12).

特 に ミ リ セ チ ン は 高 い

A

凝 集 抑 制 活 性 が 知 ら れ て お り

,

当 研 究 室 で も ポ ジ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル と し て 使 用 し て い る

.

Tabl e 2. Aβ

に 対 す る 化 合 物 の は た ら き

(

一 部

)

Fi gur e 12. Aβ

に 作 用 す る 化 合 物 の 構 造

ミリセチン ○

^{20, 21)}

○

²²⁾

○

²²⁾

○

²³⁾

×

²⁵⁾

○

²²⁾

○

²²⁾

ロスマリン酸 ○

²⁴⁾

○

²²⁾

○

²²⁾

○

²⁵⁾

○

²²⁾

○

²²⁾

NGA9-119

○

²⁶⁾

○

²⁶⁾

○

²⁶⁾

MegaNatural-AZ

○

²⁶⁾

○

²⁶⁾

○

²⁶⁾

リファンピシン ○

²⁸⁾

○

²⁷⁾

クルクミン ○

²⁴⁾

○

²⁵⁾

×

²⁵⁾

Aβ

42

凝集抑制

オリゴマー 形成抑制

プロトフィブリル 形成抑制

fAβ 不安定化

脳内Aβ 沈着抑制

シナプス 毒性軽減

細胞毒性

軽減

15

ミ リ セ チ ン に つ い て は

,

高 速 原 子 間 力 顕 微 鏡 を 用 い た 可 逆 的 な

Aβ

繊 維

(fAβ)の 伸 長 抑 制 作 用 も 報 告 さ れ て い る. Fi gur e 14

に 示 す よ う に

,

ミ リ セ チ

ン

(

最 終 濃 度

10 M)

に よ る

Aβ4 2

凝 集 抑 制 は ミ リ セ チ ン を 取 り 除 く こ と に よ り 凝 集 を 再 開 す る こ と か ら

,

ミ リ セ チ ン に よ る

Aβ4 2

凝 集 抑 制 は 可 逆 的 で あ る こ と が 明 ら か に な っ て い る

.^{2 1 )}

Fi gur e 13.

高 速 原 子 間 力 顕 微 鏡 を 用 い た ミ リ セ チ ン の 可 逆 的 な

f Aβ

伸 長 抑 制 の 観 察

^{2 1 )}

低 分 子

Aβ4 2 (

主 に モ ノ マ ー

),

超 音 波 に よ り 切 断 し た

f A β4 2,

ミ リ セ チ ン を 混 合 し て イ ン キ ュ ベ ー ト す る と

, f A β4 2

の 線 維 伸 長 反 応 は 抑 制 さ れ る

( A :

左 上

6 0 0 s ,

中 央 上

1 2 0 0 s ,

右 上

1 8 0 0 s ,

左 下

2 4 0 0 s ,

中 央 下

3 0 0 0 s ,

右 下

3 6 0 0 s ) .

ミ リ セ チ ン を 取 り 除 く と

,

明 ら か な 線 維 伸 長 が 観 察 さ れ る

( B :

左 上

1 0 0 s ,

中 央 上

2 0 0 s ,

右 上

3 0 0 s ,

左 下

4 0 0 s ,

中 央 下

5 0 0 s ,

右 下

6 0 0 s ) .

ス ケ ー ル バ ー ＝

3 0 0 n m .

ま た

, 「 フ ェ ノ ー ル 化 合 物 は 凝 集 の 中 間 段 階 で あ る Aβ

オ リ ゴ マ ー や プ ロ ト フ ァ イ ブ リ ル 形 成 を 抑 制 し

,

細 胞 毒 性 を 軽 減 さ せ る こ と 」が 明 ら か に さ れ て い る

. Aβ4 2

は

P ICUP

法

*⁴

に て 高 さ 約

1 . 3 9 n m

の オ リ ゴ マ ー を 形 成 す る が

,

ミ リ セ チ ン

,

又 は ロ ス マ リ ン 酸 を 添 加 す る と こ の オ リ ゴ マ ー 形 成 が 抑 制 さ れ る

(Figure 14) .^{2 2 )}

Fi gur e 14.

フ ェ ノ ー ル 化 合 物 の

Aβ

オ リ ゴ マ ー 形 成 抑 制 効 果

( )

*⁴ P I C U P

法 は ペ ル オ キ ソ 二 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム と ル テ ニ ウ ム 触 媒 を 使 用 し た 光 化 学 反 応

を 用 い て

Aβ

オ リ ゴ マ ー を 作 製 す る 方 法

.

ス ケ ー ル バ ー 1 0 0 n m

16

近 年

, Li bo

ら

^{2 9 )}

は ベ キ サ ロ テ ン の 誘 導 体 で あ る

OAB -14

を

Aβ

の 分 解 ・ 除 去 を 亢 進 し

,

タ ウ の 過 リ ン 酸 化 を 軽 減

,

神 経 消 失 減 少 や シ ナ プ ス 形 態 の 改 善 に 作 用 す る 化 合 物 と し て 報 告 し て い る

( Fi gur e 15).

ま た

,

同 報 に て

OAB -14

は 経 口 摂 取 で の 安 全 性 が 動 物 実 験 で 証 明 さ れ て い る

( 4.0 g/ kg, 2 weeks).

ベ キ サ ロ テ ン は 皮 膚 ガ ン の 治 療 薬 と し て 知 ら れ る 抗 が ん 剤 だ が

,

マ ウ ス 実 験 で 脳 内 に 凝 集 し た

Aβ

を 数 時 間 の う ち に 減 少 さ せ

,

マ ウ ス の 認 知 力 が 急 速 に 回 復 さ せ た と い う 報 告 が あ り

,

そ の 機 序 は ベ キ サ ロ テ ン が 凝 集

A

の 分 解 ・ 除 去 を 助 け る ア ポ リ ポ タ ン パ ク

E ( A p o E )

の 生 成 を 促 進 す る 効 果 が あ る た め と 示 さ れ て い る

.^{3 0 )}

そ の 誘 導 体 で あ る

O A B - 1 4

は 化 学 合 成 が 容 易 な 化 合 物 で

,

ミ ク ロ グ リ ア を

M 1

型

(障 害 性)

か ら

M 2

型

(保 護 性)

へ の 転 換 を 促 進 し

,

ミ ク ロ グ リ ア の 過 剰 反 応

,

す な わ ち ミ ク ロ グ リ ア の 炎 症 因 子 放 出 を 防 ぎ

, Aβ

の 分 解 ・ 除 去 を 亢 進

, AD

の 原 因 で あ る 神 経 障 害 を 抑 制 し て い る

.^{3 1 )}

ミ ク ロ グ リ ア に お い て

Aβ

は ア ン チ ザ イ ム

( A Z )

の 発 現 量 を 増 加 さ せ る

.

増 加 し た

A Z

に よ っ て 分 解 さ れ る オ ル ニ チ ン デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ

( O D C )

が 増 加 す る こ と で ミ ク ロ グ リ ア の

M 2

型 か ら

M 1

型 へ の 転 換 バ ラ ン ス が 崩 壊 し

, M 1

型 の 活 性 を 増 強 す る

.

Fi gur e 15. Bexar ot ene, OAB -14

の 構 造

(左)

と

ODC

と

A Z

の バ ラ ン ス

(右)

17

ま た

, Tani guchi

ら

^{3 2 )}

は

,

数 あ る 植 物 エ キ ス の 中 か ら

,

紅 景 天 エ キ ス に

Aβ4 2

オ リ ゴ マ ー 誘 発 神 経 毒 性 抑 制 効 果 が あ る こ と を 見 出 し

,

そ の 成 分 探 索 の 結 果

,

チ

ロ ソ ー ル に 有 意 な 毒 性 低 減 効 果 を 見 出 し た

( Fi gur e 16). Aβ

の 沈 着

,

蓄 積 量 は 正 常 マ ウ ス と 有 意 差 は な い が

, Aβ

オ リ ゴ マ ー 誘 発 神 経 毒 性 に つ い て は 有 意 に 阻 害 し て お り

,

海 馬 に お け る シ ナ プ ス 障 害 が 正 常 マ ウ ス と 同 程 度 ま で 回 復 し た

.

チ ロ ソ ー ル は オ リ ー ブ な ど の 植 物 に も 含 ま れ て い る 天 然 由 来 の 抗 酸 化 物 質 で あ り

,

安 全 性 が 高 く

,

経 口 投 与 が 可 能

,

作 用 機 序 の 異 な る 他 の 薬 剤 と 併 用 が 可 能

,

製 剤 化 が 容 易 な ど の 実 用 性

,

低 分 子 量

(

分 子 量 ＝

138)

で 脳 内 移 行 が 可 能 な ど の 優 れ た 特 性 を 持 つ

.

そ し て

, Li u

ら

^{3 3 )}

は

Aβ

の 脳 組 織 へ の 集 積 と 同 様 に

AD

の 特 徴 の ひ と つ

と し て あ げ ら れ る 睡 眠 障 害 に 着 目 し

, Aβ2 5 - 3 5

が ノ ン レ ム 睡 眠 を 減 少 さ せ

,

覚 醒 状 態 を 増 加 さ せ る こ と を 見 出 し て い る

.

こ れ は

AD

マ ウ ス に お い て

t au, p‑ tau, or exi n A , or exin neur ons ( express adenosi ne A1 recept or ( A1R))

の 発 現

が 増 加 し て い た こ と と

Aβ2 5 - 3 5

で 処 理 し た 細 胞 で も 同 じ 現 象 が み ら れ た こ

と で 示 唆 さ れ た

.

こ の よ う に

, Aβ

は

A D

発 症 前 だ け で な く 発 症 後 の 睡 眠 障

害 の よ う な 病 態 に も 関 与 し て い る こ と が 考 え ら れ

, Aβ

の 凝 集 制 御 は

AD

に

対 し 大 き な 役 割 を 持 つ こ と が わ か る

.

18

第

5

節

. A

の 検 査 薬

^{3 4 )}

ア ミ ロ イ ド カ ス ケ ー ド 仮 説 に 基 づ い た 診 断 法 の 開 発 も 近 年 進 ん で お り

, 2018

年 に は 国 立 長 寿 医 療 研 究 セ ン タ ー

,

島 津 製 作 所 な ど に よ る チ ー ム が

,

血 中 の

Aβ

ペ プ チ ド 量 に よ り

A D

病 変 を 早 期 に 検 出 す る 検 査 薬 を 発 表 し た

( Fi gur e 17) .

こ の 手 法 に よ り 得 ら れ る 結 果 は 高 額 検 査 の

PET (

陽 電 子 放 射 断 層 撮 影 装 置

)

や 患 者 に 大 き な 負 荷 を か け る 脳 脊 髄 液 を 採 取 す る 手 法 と 約

90%

一 致 し て お り

,

実 用 化 さ れ れ ば 患 者 に か か る 費 用 や 身 体 的 負 担 を 大 き く 減 ら す こ と が で き る

.

【 メ カ ニ ズ ム 】

^{3 5 )}

こ こ で 検 出 さ れ る

A β

は

, Aβ4 2, Aβ4 0

と

, 2014

年 ま で の 研 究 で 新 た に 見 つ か っ た

, Aβ4 2

よ り も

N

末 端 側 に

3

ア ミ ノ 酸 長 く

, C

末 端 側 に

2

ア ミ ノ 酸 短 い ペ プ チ ド

APP6 6 9 - 7 1 1

の ３ 種 類 と な っ て い る

( Fi gu re 1 8).

ア ル ツ ハ イ マ ー 病 で 見 ら れ る 老 人 斑 は

,

主 に

Aβ4 2

が 重 合 し た も の で あ る

.^{3 4 )}

Fi gur e 18 . APP

の 構 造 と

Aβ

や

Aβ

関 連 ペ プ チ ド の ア ミ ノ 酸 配 列

血 液 中 に お け る

,

こ れ ら の 個 々 の ペ プ チ ド の 質 量 分 析 上 の ピ ー ク が

,

脳 内

Aβ

蓄 積 量 と 強 く 相 関 す る と い う 結 果 は 得 ら れ て い な い も の の

, Aβ4 2

と

APP6 6 9 - 7 1 1

の 相 対 比 に は 強 い 相 関 が あ る

.

脳 内

Aβ

蓄 積 が 陰 性 の 人 で は

,

APP6 6 9 - 7 1 1

よ り も

Aβ4 2

の シ グ ナ ル が 強 く 検 出 さ れ る が

,

陽 性 の 人 で は

Aβ4 2

Fi gur e 17

19

が 弱 く 検 出 さ れ る

(Fi gu re 19).

こ の 「

APP6 6 9 - 7 1 1

と

Aβ4 2

の 比 率

(APP6 6 9 -

7 1 1/Aβ4 2)

」 が

,

脳 内

Aβ

蓄 積 量 を 推 定 す る た め に 使 え る 新 た な バ イ オ マ ー カ

ー 候 補 と な っ た

.^{3 6 )}

Fi gur e 19 .

MALDI-TOF MS

で 得 ら れ た

Aβ

と

Aβ

関 連 ペ プ チ ド の 質 量 ス ペ ク ト ル

第

6

節

.

近 年 の

AD

治 療 薬 開 発

2019

年

7

月 に エ ー ザ イ 株 式 会 社 が 抗 ア ミ ロ イ ド

β

プ ロ ト フ ィ ブ リ ル 抗 体

( BAN2401) ,

抗

BACE-1

薬 の 治 験 薬 を 発 表 し た

.^{3 7 )}

抗

BAC E -1

薬 に つ い て

は

2019

年

9

月 に 開 発 の 中 止 が 決 定 さ れ た が

,

抗 ア ミ ロ イ ド

β

プ ロ ト フ ィ ブ

リ ル 抗 体 は 開 発 が 継 続 さ れ て お り

,

新 薬 と し て 世 に 出 る 可 能 性 を 残 し て い

る

.^{3 8 )}

20

第 2 章

研 究 対 象

第

1

節

. Aβ

凝 集 抑 制 活 性 ス ク リ ー ニ ン グ

研 究 試 料 は 植 物 に 比 べ て

,

成 分 探 索 が 積 極 的 に 行 わ れ て い な い キ ノ コ 子 実 体 を 対 象 と し

,

当 研 究 室 で 保 有 し て い る キ ノ コ 子 実 体 エ キ ス

( 128

種

)

を 用 い て

Aβ

凝 集 抑 制 活 性 ス ク リ ー ニ ン グ を 行 っ た

(Tabl e 3) .^{3 9 )}

そ の 中 で 高 い 凝 集 抑 制 活 性 を 示 し

,

か つ 成 分 探 索 の 報 告 が あ ま り な さ れ て い な い ヌ メ リ ア イ タ ケ

(A lbat rell us yasudae) CHCl3

エ キ ス と ツ チ ス ギ タ ケ

(Pholiota terrestris) CHCl3

エ キ ス に つ い て

,

各 々

Aβ

凝 集 抑 制 活 性 を 指 標 に 成 分 探 索 を 行 っ た

.

Tabl e 3. Aβ

凝 集 抑 制 活 性 ス ク リ ー ニ ン グ

^{3 9 )}

21

第

2

節

.

ヌ メ リ ア イ タ ケ

( Albatrel l us yasudae)

ヌ メ リ ア イ タ ケ

(A. yasudae)

は

,

担 子 菌 門

( Basi dio mycot a ) -

ハ ラ タ ケ 綱

(

真 正 担 子 菌 綱

) ( A gari comycetes ) -

ベ ニ タ ケ 目

( Russulales ) -

ニ ン ギ ョ ウ タ ケ モ ド キ 科

( Al batr el laceae)

の キ ノ コ で

,

子 実 体 は

,

光 沢 の あ る 濃 い 藍 色 で

,

食 用 で あ る

( Fi gur e 20) .^{4 0 )}

ヌ メ リ ア イ タ ケ と 同 じ 科 の 他 の キ ノ コ か ら さ ま ざ ま な 有 用 な 化 合 物 が 単 離 さ れ て い る

( Tabl e 4, Fi gur e 2 2) .

例 え ば

,

フ ァ ル ネ シ ル フ ェ ノ ー ル 類 は 抗 酸 化 活 性

,

抗 菌 活 性

,

メ ラ ニ ン 合 成 促 進 活 性

,

バ ニ ロ イ ド 受 容 体

(

温 度 感 受 性 の 非 選 択 的 陽 イ オ ン チ ャ ネ ル

)

発 現 活 性

,

腫 瘍 細 胞 成 長 抑 制 活 性

,

一 酸 化 窒 素 化 合 物 産 生 抑 制 活 性 な ど 様 々 な 活 性 が 見 出 さ れ て い る

.4 1 - 4 9 )

し か し

,

ヌ メ リ ア イ タ ケ の 成 分 探 索 報 告 は 一 報 の み で 生 物 活 性 に つ い て の 報 告 は な い

( Fi gur e 2 1) .^{4 1 )}

Fig u re 20 .

ヌ メ リ ア イ タ ケ

Fig u re 2 1 .

ヌ メ リ ア イ タ ケ か ら の 単 離 物

22

Tabl e 4.

ニ ン ギ ョ ウ タ ケ モ ド キ 科 の キ ノ コ か ら 単 離 さ れ た 化 合 物

(一 部)

ヌメリアイタケ アオロウジ センニンタケ コウモリタケ ニンギョウタケ

grifolin ○ ⁴¹⁾ ○ ⁴²⁾ ○ ⁴⁵⁾ ○ ⁴⁸⁾

grifolin analogue ○ ⁴²⁾

neogrifolin ○ ⁴¹⁾ ○ ⁴²⁾ ○ ⁴⁷⁾

neogrifolin deriv. ○ ⁴²⁾

grifolic acid ○ ⁴¹⁾ ○ ⁴⁶⁾ ○ ⁴⁷⁾

grifolene ○ ⁴¹⁾

albatrellin ○ ⁴²⁾ (violet pigment)

grifolinone A,B ○ ⁴³⁾

grifolinone C ○ ⁴⁷⁾

grifolinol ○ ⁴⁶⁾

Selenium ○ ⁴⁴⁾

aurovertin B,E ○ ⁴⁷⁾

albaconol ○ ⁴⁷⁾

neoalbaconol ○ ⁴⁹⁾

emeheterone ○ ⁴⁷⁾

pyrazinol deriv. ○ ⁴⁷⁾

confluentin ○ ⁴⁷⁾

nerolidol ○ ⁴⁷⁾

nicotinamide ○ ⁴⁷⁾

23

Fi gur e 22.

ニ ン ギ ョ ウ タ ケ モ ド キ 科 キ ノ コ か ら の 単 離 化 合 物

24

第

3

節

.

ツ チ ス ギ タ ケ

(Phol iot a terrest ri s)

ツ チ ス ギ タ ケ

(P. t errestris)

は

,

担 子 菌 門

( Basi di omycota ) -ハ ラ タ ケ 綱(

真 正 担 子 菌 綱

) ( Agari comycetes ) -

ハ ラ タ ケ 目

( Russul ales ) -

モ エ ギ タ ケ 科

(Str ophari aceae )

の キ ノ コ で

,

色 の 変 異 が 多 く

(

淡 － 暗

,

黄 － 赤 － 灰 褐 色 と 幅 広 い

) ,

消 化 器 系 に 有 毒 で あ る

( Fi gu re 23) .^{4 0 )}

ツ チ ス ギ タ ケ も ヌ メ リ ア イ タ ケ と 同 様 に 同 じ 科 の 他 の キ ノ コ か ら さ ま ざ ま な 有 用 な 化 合 物 が 単 離 さ れ て い る が

(Tabl e 5, Fi gur e 2 5) ,5 0 - 5 6 )

ツ チ ス ギ タ ケ の 成 分 探 索 報 告 は 少 な く

( Fi gur e 2 4)5 7 , 5 8 )

活 性 に つ い て は

,

当 研 究 室 の 加 藤 修 士 が 行 っ た

,

血 管 新 生 阻 害 活 性 の み

^{5 8 )}

で 単 離 化 合 物 の 活 性 評 価 は な さ れ て い な い

.

Fi gur e 23 .

ツ チ ス ギ タ ケ

Fi gur e 24.

ツ チ ス ギ タ ケ か ら の 単 離 化 合 物

25

Tabl e 5.

モ エ ギ タ ケ 科 の キ ノ コ か ら 単 離 さ れ た 化 合 物

ヌメリスギタケ Pholiota adiposa

キナメツムタケ Pholiota spumosa

チャナメツムタケ Pholiota lubrica

ヌメリスギタケモドキ

Pholiota aurivella Pholiota sp.

methyl gallate ○ ⁵⁰⁾

putrescine-1,4-dicinnamide ○ 51), 52), 53)

(E )-2,3-dehydroputrescine-1,4-dicinnamamide ○ ^{52), 53)}

fasciculol E ○ ⁵³⁾

N -((R )1-cinnamoylpyrrolidin-2-yl)cinnamamide ○ ⁵⁴⁾

benzeneacetic acid ○ ⁵⁴⁾

2-methyl-3-hydroxypyran-4-one ○ ⁵⁴⁾

dihydroconiferylalcohol ○ ⁵⁴⁾

3-hydroxy-(22E ,24R )-ergosta-5,8,22-trien-7-one ○ ⁵⁴⁾

(8E ,10R ,12Z )-10-hydroxy-8,12-octadecadienoic acid ○ ⁵⁴⁾

8-((1R ,5S )-2-oxo-5-pentylcyclopent-3-en-1-yl) octanoic acid ○ ⁵⁴⁾

(22E ,24S )-5,8-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,9,(11)22-trien-3-ol ○ ⁵⁴⁾

5,6-epoxy-3-hydroxyergost-22-ene-7-one ○ ⁵⁴⁾

bisnoryangonine ○ ⁵⁵⁾

N¹,N⁸-dicinnamoylspermidine ○ ⁵³⁾

(R )-(+)-2-hydroxyputrescine 1,4-dicinnamamide ○ ⁵³⁾

pholiotic acid ○ ⁵³⁾

pholiotin A ○ ⁵⁶⁾

pholiotin B ○ ⁵⁶⁾

pholiotin C ○ ⁵⁶⁾

pholiotin D ○ ⁵⁶⁾

pholiotin E ○ ⁵⁶⁾

11-hydroxy-1(10)-valencen-2-one ○ ⁵⁶⁾

8,11-dihydroxy-1(10)-eremophilen-2-one ○ ⁵⁶⁾

durgamone ○ ⁵⁶⁾

Fi gur e 25-1.

モ エ ギ タ ケ 科 の キ ノ コ か ら の 単 離 化 合 物

26

Fi gur e 25-2.

モ エ ギ タ ケ 科 の キ ノ コ か ら の 単 離 化 合 物

27

本論

28

第 1 章

ヌ メ リ ア イ タ ケ か ら の

A

凝 集 抑 制 活 性 化 合 物 の 探 索

第

1

節

. A

凝 集 抑 制 活 性 を 指 標 と し た 分 離 ・ 精 製

乾 燥 さ せ た ヌ メ リ ア イ タ ケ

2 1 6 . 3 g

を

C H C l3

で 一 昼 夜

,

室 温 で

3

回 抽 出 し

,

ヌ メ リ ア イ タ ケ

C H C l3

抽 出 エ キ ス

( 2 8 . 4 g )

を 得 た

.

得 ら れ た ヌ メ リ ア イ タ ケ

C H C l3

エ キ ス

( 2 8 . 4 g )

は

A β

凝 集 抑 制 活 性 を 示 し た た め

,

シ リ カ ゲ ル カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 用 い て 粗 分 け し

,

得 ら れ た

5

つ の 画 分 に つ い て

A β

凝 集 抑 制 活 性 評 価 を 行 っ た

.

活 性 の 認 め ら れ た

F r . C , D

お よ び

E

に つ い て 各 種 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 用 い て 分 離 精 製 を 行 い

, F r . C

か ら

2 - h y d r o x y - 1 - m e t h o x y n e o g r i f o l i n (1) , b i s - 2 - h y d r o x y - 1 - m e t h o x y n e o g r i f o l i n (3) , g r i f o l i c a c i d (5) , n e o g r i f o l i n (6) , 2 - h y d r o x y n e o g r i f o l i n (8)

お よ び

d a u r i c h r o m e n i c a c i d (9) , F r . D

か ら

9’ - k e t o - g r i f o l i c a c i d (2) , F r . E

か ら

c e r e b r o s i d e d e r i v a t i v e

と し て

( (R) - 2 - h y d r o x y -N- ( ( 2S, 3R, 4E, 8E) - 3 - h y d r o x y - 9 - m e t h y l - 1 - ( ( ( 2R, 3R, 4S, 5S, 6R) - 3 , 4 , 5 - t r i h y d r o x y - 6 - ( h y d r o x y m e t h y l ) t e t r a h y d r o - 2H- p y r a n - 2 - y l ) o x y ) o c t a d e c a - 4 , 8 - d i e n - 2 - y l ) h e p t a d e c a n a m i d e ) (1 0)

を そ れ ぞ れ 単 離 し た

.

ま た

,

活 性 は み ら れ な か っ た が

,

構 造 活 性 相 関 検 討 の た め

, F r . B

を 分 離 し

, g r i f o l i n (4)

お よ び

c o n f l u e n t i n (7)

を 得 た

( F i g u r e 2 6 ) .

得 ら れ た 化 合 物 に つ い て 構 造 解 析 を 行 っ た と こ ろ

,

化 合 物

1, 2

お よ び

3

は 新 規 化 合 物 と 決 定 し

,

化 合 物

4

～

1 0

は 既 知 化 合 物 と 同 定 し た

( F i g u r e 2 7 ) .

以 下

,

こ れ ら の 構 造 解 析 に つ い て 述 べ る

.

29

Figure 26.

ヌ メ リ ア イ タ ケ

CHCl3

エ キ ス 分 離 フ ロ ー チ ャ ー ト

30

F i g u r e 2 7 .

ヌ メ リ ア イ タ ケ か ら 単 離 し た 化 合 物

31

第

2

節

.

新 規 化 合 物 の 構 造 決 定

化 合 物

1

は 無 色 油 状 物 質 と し て 得 ら れ

,

分 子 式 は

H R E I M S

に よ り

C2 3H3 4O3 (m / z 3 5 8 . 2 5 0 9 [ M ]⁺, c a l c d . 3 5 8 . 2 5 0 8 )

を 与 え た

. I R

ス ペ ク ト ル か ら は

, 3 4 0 4 c m^{- 1}

に ヒ ド ロ キ シ 基

, 2 9 6 6 , 2 9 1 9 , 2 8 5 3 c m^{- 1}

に

C H , 1 6 0 6 , 1 4 9 7 , 1 4 4 6 c m^{- 1}

に 二 重 結 合 由 来 の 吸 収 が 確 認 さ れ た

. 1

の

¹H , ^{1 3}C, D E P T ,

お よ び

H M Q C

か ら

, 6

つ の メ チ ル

, 5

つ の メ チ レ ン

, 4

つ の メ チ ン

, 8

つ の 第 四 級 炭 素 の 存 在 が 示 唆 さ れ た

. ¹H - N M R

ス ペ ク ト ル で は

  6 . 5 5

に

4

位 の 芳 香 族 プ ロ ト ン

, 12’

―

15’

位 と

7

位 の

5

つ の メ チ ル

(  1 . 5 7 , 1 . 5 9 , 1 . 6 7 , 1 . 7 6 , 2 . 1 6 ),

  3 . 7 7

に

8

位 由 来 の メ ト キ シ メ チ ル

,   5 . 0 5

に

H - 2 ' ,   5 . 0 7

に

H - 6 ’

お

よ び

H - 1 0 ’

位 の オ レ フ ィ ン プ ロ ト ン の ピ ー ク が 得 ら れ た

. H M B C ( F i g u r e 2 8 )

に お い て

,

メ ト キ シ メ チ ル

( H - 8 )

か ら

C - 1 , H - 4

か ら

C - 2 , C - 3 , C - 5 , C - 6

及 び

C - 7

に 相 関 が 認 め ら れ て い る こ と か ら

, 5

置 換 ベ ン ゼ ン の 構 造 が 明 ら

か に な っ た

.

ま た

, H - 1 ’か ら C - 1 , C - 5 ,

お よ び

C - 6

に 相 関 が 認 め ら れ た こ と

か ら

,

ベ ン ゼ ン 環 へ の フ ァ ル ネ シ ル 基 の 結 合 部 位 が 明 ら か と な っ た

.

よ っ

て

,

化 合 物

1

の 構 造 は

, 2 - h y d r o x y - 1 - m e t h o x y n e o g r i f o l i n

と 決 定 し た

.

32

F i g u r e 2 8 . T h e S t r u c t u r e a n d K e y H M B C C o r r e l a t i o n s o f 2 - H y d r o x y - 1 - m e t h o x y n e o g r i f o l i n (1)

T a b l e 6 : ¹H - a n d ^{1 3}C - N M R S p e c t r a l D a t a o f 2 - H y d r o x y - 1 - m e t h o x y n e o g r i f o l i n (1)

33

化 合 物

2

は 淡 黄 色 非 晶 質 と し て 得 ら れ

,

分 子 式 は

H R E I M S

に よ り

C2 3H3 0O5 (m / z 3 8 6 . 2 0 9 7 [ M ]⁺ c a l c d . 3 8 6 . 2 0 9 3 )

を 与 え た

. IR

ス ペ ク ト ル で は

, 3 1 8 2 c m^{- 1}

に ヒ ド ロ キ シ 基 と

1 6 6 6 , 1 6 1 9 c m^{- 1}

に カ ル ボ ニ ル

, 2 9 7 0 , 2 9 3 0 , 2 8 5 6 c m^{- 1}

に

C H , 1 6 1 9 , 1 6 0 5 , 1 4 5 5 c m^{- 1}

に 二 重 結 合 由 来 の 吸 収 が 確 認 さ れ た

. 2

の

¹H

お よ び

^{1 3}C - N M R , D E P T ,

お よ び

H M Q C

に よ り

5

つ の メ チ ル

, 4

つ の メ チ レ ン

, 4

つ の メ チ ン

,

お よ び

1 0

個 の 第 四 級 炭 素 の 存 在 が 示 唆 さ れ た

. ¹H

お よ び

^{1 3}C - N M R

の シ グ ナ ル パ タ ー ン は

g r i f o l i c a c i d

と 似 て い た が

, H2

の シ グ ナ ル が １ つ 少 な く な る 代 わ り に

, C 2 0 2 . 2

の

4

級 炭 素 の シ グ ナ ル が 観 測 さ れ た

. H M B C ( F i g u r e 2 9 )

に お い て

C 2 0 2 . 2 ( C - 9 ’ )

に 対 し

 2 . 9 3 ( H - 8’ )

と

 6 . 1 3 ( H - 10’ )

か ら 相 関 が み ら れ た こ と か ら

,

カ ル ボ ニ ル 基 が

9 ’

位

( C - 9 ’ )

に 位 置 し て い る こ と が 明 ら か に な っ た

.

ベ ン ゼ ン 環 部 位 に つ い て は

,

フ ァ ル ネ シ ル 基 の

1’位 (H 3 . 2 7 )

か ら ヒ ド ロ キ シ 基 を も つ

4

位 と

6

位 の 第 四 級 炭 素

( C 1 6 1 . 1,  C 1 6 4 . 8)

に 相 関 が あ り

,

か つ

8

位 メ チ ル 基

( H - 8 )

か ら

 C

1 4 1 . 9,  C 1 0 5 . 1,  C 1 1 1 . 4

に 相 関 が 認 め ら れ た こ と か ら

,

化 合 物

2

の 構 造 は

9’ -ket o -gri f oli c acid

と 決 定 し た

.

34

F i g u r e 2 9 . T h e S t r u c t u r e a n d K e y H M B C C o r r e l a t i o n s o f 9’ -ket o -Gr if ol ic Aci d (2)

T a b l e 7 . ¹H - a n d ^{1 3}C - N M R S p e c t r a l D a t a o f 9’ -ket o -Gr if ol ic Aci d (2)

35

化 合 物

3

は

,

黄 色 油 状 物 質 と し て 得 ら れ

,

分 子 式 は

H R F A B M S

よ り

C4 6H6 6O6 (m / z 7 1 4 . 4 8 5 0 [ M ]⁺, c a l c d . 7 1 4 . 4 8 5 9 )

を 与 え た

. 3

の

¹H

お よ び

^{1 3}C N M R ,

各 種 ス ペ ク ト ル デ ー タ は

4

位 の プ ロ ト ン が 消 失 し た こ と を 除 き

,

化 合 物

1

と ほ ぼ 一 致 し て い た

.

マ ス ス ペ ク ト ル

7 1 4 . 4 8 5 0

を 考 慮 す る と 化 合 物

3

は 化 合 物

1

の 二 量 体 で あ る と 推 定 し た

.

二 量 体 の 結 合 部 位 は

¹H - N M R

に お け る

4

位 の プ ロ ト ン の 消 失 と

, H M B C

相 関

( F i g u r e 3 0 )

に お け る

7

位

(H

1 . 8 4 ) , 3

位

O H (H 4 . 7 9 )

か ら の 第 四 級 炭 素

C - 4 (C 1 1 7 . 4 )

へ の 相 関 に 基 づ

い て 決 定 し

,

化 合 物

3

は

b i s - 2 - h y d r o x y - 1 - m e t h o x y n e o g r i f o l i n

と 決 定 し た

.

36

F i g u r e 3 0 . T h e S t r u c t u r e a n d K e y H M B C C o r r e l a t i o n s o f B i s - 2 - h y d r o x y - 1 - m e t h o x y n e o g r i f o l i n (3)

T a b l e 8 . ¹H - a n d ^{1 3}C - N M R S p e c t r a l D a t a o f B i s - 2 - h y d r o x y - 1 - m e t h o x y n e o g r i f o l i n (3)

37

第

3

節

.

既 知 化 合 物 の 構 造 解 析

化 合 物

4

は 無 色 非 晶 質 と し て 得 ら れ

,

分 子 式 は

H R E I M S

に よ り

C2 2H3 2O2

(m / z 3 2 8 . 2 4 0 5 [ M ]⁺, c a l c d . 3 2 8 . 2 4 0 0 )

を 与 え た

. 4

の

¹H , ^{1 3}C , D E P T ,

お よ び

H M Q C

か ら

, 5

つ の メ チ ル

, 5

つ の メ チ レ ン

, 5

つ の メ チ ン

, 7

つ の 第 四 級 炭 素 の 存 在 が 示 唆 さ れ た

.

得 ら れ た デ ー タ は

g r i f o l i n

の も の と 類 似 し て お り

,

標 品 と の 直 接 比 較

,

及 び 各 種 ス ペ ク ト ル デ ー タ の 値 を 文 献 値

^{5 9 )}

と 比 較 し た と こ ろ 一 致 し た の で

,

化 合 物

4

は

, g r i f o l i n

と 同 定 し た

.

F i g u r e 3 1 . T h e S t r u c t u r e o f G r i f o l i n (4)

T a b l e 9 . ¹H - a n d ^{1 3}C - N M R S p e c t r a l D a t a o f G r i f o l i n (4)

38

化 合 物

5

は 無 色 非 晶 質 と し て 得 ら れ

,

分 子 式 は

H R E IM S

に よ り

C2 3H3 2O4

(m / z 3 7 2 . 2 3 0 2 [ M ]⁺, c a l c d . 3 7 2 . 2 2 9 8 )

を 与 え た

. 5

の

¹H , ^{1 3}C - N M R , D E P T ,

お よ び

H M Q C

か ら

, 5

つ の メ チ ル

, 5

つ の メ チ レ ン

, 4

つ の メ チ ン

, 8

つ の 第 四 級 炭 素 と

1

つ の カ ル ボ ニ ル 基 の 存 在 が 示 唆 さ れ た

.

得 ら れ た デ ー タ は

g r i f o l i c a c i d

の も の と 類 似 し て お り

,

標 品 と の 直 接 比 較

,

及 び 各 種 ス ペ ク ト ル デ ー タ の 値 を 文 献 値

^{6 0 )}

と 比 較 し た と こ ろ 一 致 し た の で

,

化 合 物

5

は

, g r i f o l i c a c i d

と 同 定 し た

.

F i g u r e 3 2 . T h e S t r u c t u r e o f G r i f o l i c A c i d (5)

T a b l e 1 0 . ¹H - a n d ^{1 3}C - N M R S p e c t r a l D a t a o f G r i f o l i c A c i d (5)

39

化 合 物

6

は 褐 色 非 晶 質 と し て 得 ら れ

,

分 子 式 は

H R E IM S

に よ り

C2 2H3 2O2

(m / z 3 2 8 . 2 4 0 1 [ M ]⁺, c a l c d . 3 2 8 . 2 4 0 0 )

を 与 え た

. 6

の

¹H , ^{1 3}C - N M R , D E P T ,

お よ び

H M Q C

か ら

, 5

つ の メ チ ル

, 5

つ の メ チ レ ン

, 5

つ の メ チ ン

, 7

つ の 第 四 級 炭 素 の 存 在 が 示 唆 さ れ た

.

得 ら れ た デ ー タ は

n e o g r i f o l i n

の も の と 類 似 し て お り

,

標 品 と の 直 接 比 較

,

及 び 各 種 ス ペ ク ト ル デ ー タ の 値 を 文 献 値

^{6 1 )}

と 比 較 し た と こ ろ 一 致 し た の で

,

化 合 物

6

は

, n e o g r i f o l i n

と 同 定 し た

.

F i g u r e 3 3 . T h e S t r u c t u r e o f Neog r i f o l i n (6)

T a b l e 1 1 . ¹H - a n d ^{1 3}C - N M R S p e c t r a l D a t a o f Neog r i f o l i n (6)

40

化 合 物

7

は 無 色 非 晶 質 と し て 得 ら れ

,

分 子 式 は

H R E IM S

に よ り

C2 2H3 0O2

(m / z 3 2 6 . 2 2 4 4 [ M ]⁺, c a l c d . 3 2 6 . 2 2 4 4 )

を 与 え た

. 7

の

¹H , ^{1 3}C - N M R , D E P T ,

お よ び

H M Q C

か ら

, 5

つ の メ チ ル

, 4

つ の メ チ レ ン

, 6

つ の メ チ ン

, 7

つ の 第 四 級 炭 素 の 存 在 が 示 唆 さ れ た

.

各 種 ス ペ ク ト ル デ ー タ は

g r i f o l i n

の も の に 類 似 す る が

, ¹H - N M R

に お い て

g r i f o l i n

で 特 徴 的 で あ っ た

1’

位 の

  3 . 3 9

の

2 H

ダ ブ レ ッ ト ピ ー ク が 消 失 し

,   6 . 6 1 ( d , J = 1 0 . 1 H z )

と

  5 . 5 0 ( d , J = 1 0 . 1 H z )

に

1

組 の オ レ フ ィ ン プ ロ ト ン の シ グ ナ ル が 出 現 し た

.

ま た

, ^{1 3}C - N M R

に お い て

grifolin

で は

3’

位 の 炭 素 が

 C 1 3 9 . 0

に 観 測 さ れ て い た が

, 7

で は

 C 7 8 . 2

に シ フ ト し て い た

. H M B C ( F i g u r e 3 4 )

に お い て

, H - 1 5 ’

か ら

C - 2 ’ , C - 3’ ,

お よ び

C - 4 ’ , H - 2’

か ら

C - 5 , H - 1’か ら C - 3 ’ , C - 4 , C - 5 ,

お よ び

C - 6

に そ れ ぞ れ 相 関 が 認 め ら れ た

.

最 終 的 に

H R E I M S

の 示 し た 分 子 式

C2 2H3 0O2

を 考 慮 し

,

化 合 物

7

を

c o n f l u e n t i n

と 推 定 し

,

各 種 ス ペ ク ト ル デ ー タ の 値 を 文 献

値

^{6 2 )}

と 比 較 し た と こ ろ 一 致 し た の で

,

化 合 物

7

は

, c o n f l u e n t i n

と 同 定 し た

.

41

F i g u r e 3 4 . T h e S t r u c t u r e a n d K e y H M B C C o r r e l a t i o n s o f C o n f l u e n t i n (7)

T a b l e 1 2 . ¹H - a n d ^{1 3}C - N M R S p e c t r a l D a t a o f C o n f l u e n t i n (7)

42

化 合 物

8

は 淡 黄 色 非 晶 質 と し て 得 ら れ

,

分 子 式 は

H R E I M S

に よ り

C2 2H3 2O3 (m / z 3 4 4 . 2 3 4 9 [ M ]⁺, c a l c d . 3 4 4 . 2 3 5 6 )

を 与 え た

. I R

ス ペ ク ト ル か ら は

, 3 4 7 9 c m^{- 1}

に ヒ ド ロ キ シ 基

, 2 9 1 8 c m^{- 1}

に

C H

の 吸 収 が 確 認 さ れ た

. 8

の

¹H ,

1 3C - N M R , D E P T ,

お よ び

H M Q C

か ら

, 5

つ の メ チ ル

, 5

つ の メ チ レ ン

, 4

つ の メ チ ン

, 8

つ の 第 四 級 炭 素 の 存 在 が 示 唆 さ れ た

. H M Q C

に て 炭 素 と 相 関 を 持 た な い

1 H

分 の シ グ ナ ル が

 H 5 . 1 3

と

 H 5 . 4 2

に

2

本 確 認 さ れ た が

, H M B C ( F i g u r e 3 5 )

に お い て

 H 5 . 1 3

か ら

C - 2 ( C 1 4 1 . 5),  H 5 . 4 2

か ら

C - 4 ( C

1 2 7 . 8)

に 相 関 が 認 め ら れ た た め

,

こ れ ら の シ グ ナ ル は ヒ ド ロ キ シ 基 の も の と 推 定 し た

. C - 3

は

H M B C

に て

C - 2 , C - 4

に 結 合 し て い る ヒ ド ロ キ シ 基 か ら 相 関 が 確 認 で き

,  C 1 3 0 . 0

と い う 値 と

H R E IM S

の 示 し た

C2 2H3 2O3

を 考 慮 す る と

, C - 3

も ヒ ド ロ キ シ 基 が 結 合 し て い る と 推 定 し た

.

他 の 得 ら れ た

¹H

お よ び

^{1 3}C - N M R

の デ ー タ は

n e o g r i f o l i n

の も の と 類 似 し て お り

,

各 種 ス ペ ク ト ル デ ー タ の 値 を

n e o g r i f o l i n

の

2

位 が ヒ ド ロ キ シ 基 と な っ た 化 合 物 の 文 献 値

6 3 )

と 比 較 し た と こ ろ 一 致 し た の で

,

化 合 物

8

は

, 2 - h y d r o x y n e o g r i f o l i n

と 同

定 し た

.

43

F i g u r e 3 5 . T h e S t r u c t u r e a n d K e y H M B C C o r r e l a t i o n s o f 2 - H y d r o x y n e o g r i f o l i n (8)

T a b l e 1 3 . ¹H - a n d ^{1 3}C - N M R S p e c t r a l D a t a o f 2 - H y d r o x y n e o g r i f o l i n (8)

44

化 合 物

9

は 淡 褐 色 非 晶 質 と し て 得 ら れ

,

分 子 式 は

H R E I M S

に よ り

C2 3H3 0O4 (m / z 3 7 0 . 2 1 4 5 [ M ]⁺, c a l c d . 3 7 0 . 2 1 4 2 )

を 与 え た

. I R

ス ペ ク ト ル か ら は

, 2 9 2 6 c m^{- 1}

に

C H , 1 6 2 0 c m^{- 1}

に カ ル ボ ニ ル 由 来 の 吸 収 が 確 認 さ れ た

. 9

の

1H , ^{1 3}C - N M R , D E P T ,

お よ び

H M Q C

か ら

, 5

つ の メ チ ル

, 4

つ の メ チ レ ン

, 5

つ の メ チ ン

, 8

つ の 第 四 級 炭 素 と

1

つ の カ ル ボ ニ ル 基 の 存 在 が 示 唆 さ れ た

.

各 種 ス ペ ク ト ル デ ー タ は

c o n f l u e n t i n

に カ ル ボ ニ ル 基 が 付 加 し た

d a u r i c h r o m e n i c a c i d

の も の に 類 似 し て お り

,

各 種 ス ペ ク ト ル デ ー タ の 値 を

文 献 値

^{6 4 )}

と 比 較 し た と こ ろ 一 致 し た の で

,

化 合 物

9

の 構 造 は

d a u r i c h r o m e n i c a c i d

と 同 定 し た

.

45

F i g u r e 3 6 . T h e S t r u c t u r e o f D a u r i c h r o m e n i c A c i d (9)

T a b l e 1 4 . ¹H - a n d ^{1 3}C - N M R S p e c t r a l D a t a o f D a u r i c h r o m e n i c A c i d (9)

46

化 合 物

1 0

は 淡 褐 色 非 晶 質 と し て 得 ら れ

,

分 子 式 は

H R E S IM S

に よ り

C4 2H7 9N O9N a (m / z 7 6 4 . 5 6 7 4 [ M + N a ]⁺, c a l c d . 7 6 4 . 5 6 4 8 )

を 与 え た

. I R

ス ペ ク ト ル か ら は

, 3 3 5 4 c m^{- 1}

に ヒ ド ロ キ シ 基

, 2 9 2 2 , 2 8 5 2 , 1 4 6 6 c m^{- 1}

に

C H , 1 6 5 0 , 1 5 3 7 c m^{- 1}

に ア ミ ド の 吸 収 が 確 認 さ れ た

. 1 0

の

¹H , ^{1 3}C - N M R , D E P T ,

お よ び

H M Q C

か ら は

, 3

つ の メ チ ル

, 7

つ 以 上 の メ チ レ ン

, 1 0

個 の メ チ ン

, 1

つ の カ ル ボ ニ ル 基 の 存 在 が 示 唆 さ れ た が

, ¹H - N M R

に お い て

C H2

領 域

(  1 . 2 9)

の 密 集 し た ピ ー ク は 解 析 が 困 難 で あ っ た

.  C 1 0 4 . 7

に ア ノ マ ー 炭 素

,  C 6 2 . 6 - 1 0 4 . 7

と

  3 . 3 2 - 4 . 2 7

に 糖 由 来 の ピ ー ク が 確 認 さ れ た

. H M B C

相 関

( F i g u r e 3 7 )

に お い て

, H - 2

と

C - 1 , H - 3

と

C - 1

お よ び

H - 1”

と

C - 1

の 相 関 が 認 め ら れ

,

さ ら に

H - 2

と

C - 1’の 相 関 が 確 認 さ れ た こ と か ら,

ア ミ ド を 中 心 に 糖

,

脂 肪 鎖 が 結 合 す る

c e r e b r o s i d e

類 で あ る と 推 定 し た

.

各 種 ス ペ ク ト ル デ ー タ の 値 を 文 献 値

^{6 5 )}

と 比 較 し た と こ ろ 一 致 し た の で

,

化 合 物

1 0

は

( (R) - 2 - h y d r o x y - N- ( ( 2S, 3R, 4E, 8E) - 3 - h y d r o x y - 9 - m e t h y l - 1 - ( ( ( 2R, 3R, 4S, 5S, 6R) - 3 , 4 , 5 - t r i h y d r o x y - 6 - ( h y d r o x y m e t h y l ) t e t r a h y d r o - 2H- p y r a n - 2 - y l ) o x y ) o c t a d e c a - 4 , 8 - d i e n - 2 - y l ) h e p t a - d e c a n e a m i d e )

と 同 定 し た

.

F i g u r e 3 7 . T h e S t r u c t u r e a n d K e y H M B C C o r r e l a t i o n s o f C e r e b r o s i d e D e r i v a t i v e (1 0)

47

T a b l e 1 5 . ¹H - a n d ^{1 3}C - N M R S p e c t r a l D a t a o f C e r e b r o s i d e D e r i v a t i v e (1 0)