噸 一

畑 よ り 単 離 したPseudomonassp.KFlOの ポ リ ー3一 ヒ ド ロ キ シ 酪 酸 分 解 酵 素 と ポ リ ー3一 ヒ ド ロ キ シ オ ク タ ン酸 分 解 酵 素 の 精 製 と そ の 性 質

神 奈 川 大学 理 学 部 白木 麻 里 、 菅 谷 理 恵 、八 島 工 、 山 下 由佳 、斎 藤 光 実

【目 的]PHB(ポ リ ー3一 ヒ ド ロ キ シ 酪 酸)が 生 分 解 性 プ ラ ス チ ッ ク と し て 注 目 さ れ て い る 中 で 、 現 在 多 くのPHB分 解 菌 が 単 離 さ れ そ の 分 解 酵 素 が 研 究 さ れ て い る 。 ま たPHBの み な らず 他 の ポ リ ヒ ドロ キ シ ア ル カ ノ エ イ ト(PHA)に つ い て も 同 様 の 研 究 が な さ れ て い る 。PHO(ポ リ ー3一 ヒ ド ロ キ シ オ ク タ ン酸 〉 は Pseucbmonasoleovoransが 菌 体 内 に 蓄 積 す る 生 分 解 性 ポ リエ ス テ ル で あ る 。 我 々 は 神 奈 川 大 学 理 学 部 畑 よ

りPHBだ け で は な くPHOも 分 解 す る 微 生 物Pseudnmonassp.KFIOを 単 離 し て 細 胞 外 のPHB分 解 酵 素 とPHO 分 解 酵 素 を 精 製 し そ の 性 質 の 検 討 を行 っ た 。

【方 法lPseu(iomonassp.KF10の 単 離 一 神 奈 川 大 学 理 学 部 畑 よ り採 取 し た 土 壌 約5gを10mlの 水 道 水 に 懸 濁 し 、 そ の 上 清 を 炭 素 源 と し てPHOの み を 含 む 培 地 に て3‑10日 間30.Cに て 培 養 し た 。 培 養 液 の 上 清

を103‑1010に 希 釈 し て 炭 素 源 と し てPHOの み を 含 む 寒 天 培 地 に 加 え た 後2‑7日 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 ク リ ヤ ー ゾ ー ン を 形 成 し た コ ロ ニ ー を 取 り,再 び 液 体 培 地 に て1日 培 養 し 、 希 釈 し てPHOプ レ ー トに ま き 、 最 終 的 に は ク リ ヤ ー ゾ ー ン を 作 ら な い コ ロ ニ ー が な くな る ま で こ の 操 作 を 繰 り返 し て 、 菌 を単 離 し た 。 単 離 し た 菌 をPHBの み を 炭 素 源 と し て 含 む 寒 天 培 地 に て 培 養 した と こ ろ 、 同 じ よ う に ク リ ア ゾ ー ン を 形 成 し

た た め 、 単 離 し た 菌 はPHO斜 面 培 地 、PHB斜 面 培 地 と凍 結(‑20°C)に て 保 存 し た 。

細 胞 外PHB分 解 酵 素 の 精 製 一KFlOをPHBの み を 炭 素 源 と す る 培 地 に 疎 水 性 吸 着 体 ブ チ ル ト ヨ パ ー ル を 添 加 し て30・Cに て 培 養 し た 。2日 後 ブ チ ル ト ヨ パ ー ル を 回 収 し て カ ラ ム に 詰 め て20%エ タ ノ ー ル を 含 む バ ッ フ ァ ー で 洗 浄 し た 後 、40%エ タ ノ ー ル を 含 む バ ッ フ ァ ー で 溶 出 し た 。 透 析 、 濃 縮 の 後TEAEセ ル ロ

ー ス に チ ャ ー ジ し て0 ‑0.4MNaClの 濃 度 勾 配 に よ っ て 溶 出 し た 。 透 析 濃 縮 し て 精 製 酵 素 と し た 。

細 胞 外PHO分 解 酵 素 の 精 製 一KF10をPHOの み を 炭 素 源 とす る 培 地 で2日 間 に て 培 養 し た 後 培 養 液 の 上 清 を濃 縮 透 析 してTEAEセ ル ロ ー ス に チ ャ ー ジ し て0‑0.SMNaCIの 濃 度 勾 配 に よ っ て 溶 出 し た 。 透 析 濃 縮 し て 精 製 酵 素 と し た 。

阻 害 剤 の 影 響 ・‑DFP,PMSF,DTTの 影 響 に つ い て 調 べ た 。

【結 果 】 精 製 酵 素 はPHB分 解 酵 素 、PHO分 解 酵 素 と も に 電 気 泳 動 的 に 単 … で あ り、 分 子 量 は 電 気 泳 動 よ り そ れ ぞ れ 約46000、37000Daで あ っ た(Fig.la.b.)。 ま た 至 適pHは 両 酵 素 と も に ほ ぼ85で あ っ た (Fig.2)。 阻 害 剤 の 影 響 に つ い て はFig.3に 示 し た 。

臨 磁 朧 脇 瓢B分 解Fig.laFig・1b

酵 素 を0.02mMで ほ ぼ100%阻 害 し た が PHO分 解 酵 素 は1mMで も 活 性40%程 度 しか 阻 害 し な か っ た 。 一 方 セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ の 阻 害 剤 で あ るPMSF(Phenyl‑

urethanesulfonylfluoride)で はPHO分 解 酵 素 の ほ うがPHB分 解 酵 素 よ り 影 響 を 受 け た 。 ま たs‑s結 合 を 開 裂 す るDlrr

(ジ チ オ ス レ イ ト ー ル)を 作 用 させ る と両 方 の 酵 素 と も ほ ぼ 同 じ く ら い 影 響 を受 け た 。 こ れ ら の 結 果 よ り 両 酵 素 共 今 ま で 研 究 さ れ て い る ほ か のPHB分 解 酵 素 と 同 じ く、S‑S結 合 と セ リ ン残 基 が 分 解 活 性 に 関 与 して い る と 推 測 さ れ る 。

一

蜘

..",.

94000

67000 430000

20000

μ 」6 6→ 」6

噸

'r剛 」

14000ノ 、

b

PHBdepolymerasepHOdepolymerase

PurificationandPropertiesofExtracellularPoly‑3‑hydroxybutyrateDepolymeraseandPoly‑3‑hydroxyoctanoic

㏄iddepolyme1asefromP5eロd}moηa3sp.KF10isolatedfirs)mthefieldofKanagawaUniversity.

MariShiraki,RieSugaya,TakumiYashima,YukaYamashitaandTerumiSaito

DepartmentofBiology,FacultyofScience,KanagawaUniversity,2946Tsuchiya,Hiratsuka, Kanagawa,259‑12

TELO463‑594111FAXO463‑59‑2361

.1

抗 体 反 応 の 結 果 はTable1.に 示 し た 。 こ の 結 果 よ りKHOのPHB分 解 酵 素 は 以 前 当 研 究 室 で 単 離 され た Pseu(iomonassp.S2のPHB分 解 酵 素 の 抗 体 と 良 く反 応 す る こ とが わ か っ た 。

【考 察1Pseudomonassp.KFIUはPHB,FHOの 両 方 を 利 用 し て 成 長 で き る 菌 で あ り 、 細 胞 外 にPHB分 解 酵 素 とPHO分 解 酵 素 を 分 泌 し て い る 。 両 酵 素 の 至 適pHな ど は 良 く似 て い る が 阻 害 剤 の 影 響 に つ い て は 大 き く 異 な る 。 ま た 、 両 酵 素 が ど の よ う に 調 節 され て 分 泌 され て い る か は ま だ 不 明 で あ り 、 今 後 の 課 題 で あ る 。

Fl92PH・ptimum(P・ 酬 ・醒 ・…sp・KF10)

goo

ao80

v

ξ60

…

d40

20

Ace鷺a量O Phosphate T吋s‑HCl Glycine Ace量a薯e Phosphate Tris‑tiCl G1ソdne

o‑'O'

PHBdepolymerase

‑一・・PHOdepolymerase

4.05.OS.07.09.09.010.011.O

PH

(8 0 9 )

Fig.3a

PHBdepolymerase PHOdepolymerase

Dilsopropyliruorophosphate(mM)

(8︾︑一噛︾一一〇︽

too

80

80

40

20

0

Fig.3b

PF/BdePoymerase PHAdepolymerase

Ph剛m・ 艦hγ1・u置r。・ylfl・。・ld・(醐

1QO

翁aoV

a;=o︽

60

40

20

0

Fig.3c

PHBdepolymerase PHOdepotymerase

2d6810

Dithlothreitol(mM)

冒2

Table1. CrossreacEivity

Antibody

P.sp.AIP .sp.AIPerhydrolasePHBdepolymerasePHBd.sp.S2A ..fnecnlisPHBdepolymerase3HBoligomepolymeraseEnzmes

P.sp.A1 桝

3HBoligomerhydrolase

P.sp.S2 PHBdepolymerase

A.jaecnlia PHBdepolymerase

P,sp.KF10 PHBdepolymerase

十

什

ゆ

柵

t

十

ゆ

十十十 十

桝

Im

柵

N)

十十十

ND ND:notdetermined

一61‑一