Studies on transmission of leishmaniasis and mechanisms of parasite persistence in the liver

博 士（ 獣医 学） サ ル ダ ー テ イ ワ ナ ン タ ゴ ン

学 位 論 文 題 名

Studies on transmission of leishmaniasis and mechanisms of parasite persistence in the liver

（リーシュマニア症の伝播および原虫の肝臓内存続機構に関する研究）

学 位 論 文 内 容 の 要 旨

         Leishmaniasis is a zoonotic protozoan disease caused by the genus Leishmania species. Parasites are transmitted by the bite of female phlebotomine sand flies. The increase in risk factors for leishmaniasis is worldwide. Some risk factors are due to natural environmental changes, which may cause changes in the distribution and feeding behaviour of sand fly vectors. Others are the man‑ruade changes such as migration and deforestation, or changes in the human host's susceptibility to infection such as immunosuppression.

         In chapter I, the identification of phlebotomine sand fly species and their blood meals in the endemic areas of cutaneous leishmaniasis in Pakistan was studied.

PCR‑restriction fragment length polymorphism and sequence analysis of the insect 18S ribosomal RNA gene was developed to distinguish the Phlebotomus and Sergentomyia species. The female sand flies identified were P. papatasi (7.4%), P.

alexandri‑like sandflies (3.4%), S. clydei/S. ghesquierei/S. magna (68.6%), S. dubia (17.1%) and S. dentata (3.4%). Amplification and sequencing of the vertebrate cytochrome b gene in blood‑fed sand flies revealed that P. papatasi fed on cattle and wild rat whereas P. alexandri‑like specimens fed on human, cattle, goat and dog.

Although Sergentomyia species are generally known to feed on‑cold‑blooded animals, S. clydei, S. dubia, and S. ghesquierei preferred humans, cattle, goat, sheep, buffalo, dog, donkey, wild rat and Indian gerbil. The epidemiological significance of the zoophilic feeding of various host species by phlebotomine sand flies in Pakistan is further required to study for better understanding the zoonotic transmission of sand fly‑borne pathogens and for appropriate management of the vectors.

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       In chapter II, the study is. aimed to improve the understanding of mechanisms  of hepatic L. donovani persistence in an immunocompromised condition using  alymphoplastic aly/aly mice. Hepati.c parasite burden, granuloma formation,  expression of cytokine/chemokine mRNA and induction of regulatory T cells (Tregs)  for up t0 7 months after intravenous inoculation with L. donovani promastigotes  were determined. While control aly/+ mice resolved the infection by 8 weeks post  infection (WPI), aly/aly mice showed long‑term hepatic parasite persistence in the  chronic phase of infection, which was associated with the delayed and impaired  granuloma maturation. Although hepatic CD4+Foxp3+ but not CD8+Foxp3+ T cells  were detected in both strains of mice, the number of CD4+Foxp3+ T cells and  expression of Foxp3 mRNA were significantly increased in aly/aly mice.

 Immunohistochemical analysis demonstrated the presence of Foxp3+ T cells in L.

donovani‑induced hepatic granulomas and perivascular neo‑lymphoid aggregates.

Laser microdissection and quantitative RT‑PCR of mature granulomas revealed that the increase in the Foxp3 mRNA level at 12 WPI was correlated to the increased mRNA level of IL‑10 more than TGF‑p, suggesting that the impairment of granuloma maturation was mediated by the immunosuppressive IL‑10. Furthermore, the treatment of infected aly/aly mice with anti‑CD25 0r anti‑FR4 mAb resulted in significant reductions in both hepatic Foxp3+ cells and parasite burden. This study offered a novel insight into the involvement of Tregs in hepatic L. donovani persistence in an immunodeficient condition. The manipulation of Tregs may provide a promising immunotherapeutic strategy for visceral leishmaniasis.

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学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

Studies on transmlSSionofleiShmanlaSiSandmeChaniSmS     OfparaSlteperSiStenCeintheliVer

  リ ー シ ュ マ ニ ア 症 は り ー シ ュ マ ニ ア 属 原 虫 に よ る 人 獣 共 通 寄 生 虫 症 で あ り 、 サ シ チ ヨ ウ バ ェ が 媒 介 す る 。 本 症 の 分 布 は 拡 大 し て お り 、 気 候 変 動 や 動 物 相 の 変 化 が サ シ チ ヨ ウ バ ェ の 分 布 や 吸 血 行 動 に 影 響 を 与 え て い る と 考 え ら れ て い る 。 宿 主 側 要 因 と し て は 栄 養 不 良 、 ヒ ト 免 疫 不 全 ウ イ ル ス 感 染 、 臓 器 移 植 者 へ の 免 疫 抑 制 剤 の 投 与 な ど に よ る 病 原体 に 対 す る 人の 感 受 性 の 変化 が あ る 。

  第1章 に お い て は 、 リ ー シ ュ マ ニ ア 症 の 伝 播 に 関 す る 研 究 と し て 、 パ キ ス タ ン 南 部 の 皮 膚 リ ー シ ュ マ ニ ア 症 の 新 し い 流 行 地 に お け る サ シ チ ョ ウ バ ェ の 分 布 と 吸 血 源 動 物 の 調 査 を 行 っ た 。 サ シ チ ョ ウ バ ェ の 分 類 に あ た っ て は 分 子 生 物 学 的 手 法 を 取 り 入 れ 、 個 体 別 にDNAを 抽 出 後 、18S rRNA遺 伝 子 をPCR法 で 増 幅 し 、 制 限 酵 素 断 片 多 型 解 析 と シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 雌 の サ シ チ ョ ウ バ ェ175匹 の う ち 、7,4

％ がPhlebotomus papatasi、3.4％ がP．alexandri近 縁 種 、68.6％ がSergentomyia ciydeiノ ざ．

ghesquiereiIS. magnaの い ず れ か 、17.1％ がS．dubia、 そ し て3.4％ が ＆dentataで あ っ た 。 さ ら に 、 肉 眼 的 に 吸 血 が 確 認 さ れ た28個 体 に つ い て 、 脊 椎 動 物 の ミ ト コ ン ド リ ア ・ チ ト ク ロ ー ムb遺 伝 子 をPCR法 で 増 幅 し シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、P． papatasiは 牛 と 野 ネ ズ ミ か ら 、P．alexandri近 縁 種 は 人 、 牛 、 山 羊 、 犬 か ら 吸 血 し て い る こ と が 判 明 し た 。 一 方 、Sergentomyia属 サ シ チ ョ ウ バ ェ は 一 般 に 爬 虫 類 な ど の 変 温 動 物 を 吸 血 す る と さ れ て お り 、S．dubiaとS．dentataは 爬 虫 類 を 吸 血 し て い た 。 し か し 、

＆clydei、S．dubia、S．ghesquiereiは 人 、 牛 、 山 羊 、 羊 、 水 牛 、 ロ バ 、 野 ネ ズ ミ 、 イ ン ド ス ナ ネ ズ ミ を 吸 血 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 今 回 の 調 査 で は 、 こ れ ら の サ シ チ ョ ウ バ ェ か ら り ー シ ュ マ ニ アDNAは 検 出 さ れ な か っ た が 、 本 調 査 地 の 皮 膚 リ ー シ ュ マ ニ ア 症 の 主 要 種 がLeishmania majorで あ り 、P．papatasiは そ の ベ ク タ ー と し て 知 ら れ て い る こ と か ら 、 パ キ ス タ ン の 新 流 行 地 に お い て は 人、 動 物 、 工 ， majorそ し てP．papatasi に よ る り ー シ ュ マ ニ ア 症 の 伝 播 サ イ ク ル が 成 立 し て い る も の と 考 え ら れ た 。 ま た 、 Phlebotomus属 とSergentomyia属 の ど ち ら の サ シ チ ョ ウ バ ェ も 人 を 含 め た 複 数 の 哺 乳 動 物 を 吸 血 し て い た こ と か ら 、 サ シ チ ョ ウ バ ェ 媒 介 性 疾 病 の さ ら な る 調 査 と ベ ク タ ー 対 策 の必 要 性 が 示 され た 。

  第2章 に お い て は 、 免 疫 不 全 宿 主 に お け る り ー シ ュ マ ニ ア 原 虫 の 臓 器 内 存 続 機 構 に

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賢 尋彦 智

関 す る 解 析 を 行 っ た 。 本 研 究 で は 、2次 リ ン パ 組 織 の 役 割 を 検 討 す る た め に 、 遺 伝 的 に り ン パ 節 を 欠 損 し て い る ロ ル ′ ／ ロ ヶ マ ウ ス に ムdonovaniを 感 染 さ せ た の ち 、慢 性 期 の 感 染7ケ 月 後 ま で 肝 臓 内 原 虫 数 、 肝 臓 内 肉 芽 腫 形 成 、Thlお よ びTh2関 連 サ イ ト カ イ ン と ケ モ カ イ ン のmRNA発 現 量 お よ びCD4゛Foxp3゛ 制 御 性T細 胞(Treg)の 動 態 に つ い て 経 時 的 に 解 析 し た 。 そ の 結 果 、 対 照 の ロ ル ´ ／ 十 マ ウ ス で は 肝 臓 内 原 虫 が 感 染8週 目 ま で に 排 除 さ れ た の に 対 し て 、 ロ ル ′ ／ ロ ケ マ ウ ス で は 感 染7ケ 月 後 で も 肝 臓 内 原 虫 の 存 続 が 確 認 さ れ た 。 肝 臓 内Tregの 出 現 数 とFoxp3遺 伝 子 の 発 現 量 は ロ ル ね ケ マ ウ ス で 有 意 に 増 加 し て い た 。 免 疫 組 織 学 的 解 析 か ら 、 肝 臓 内 肉 芽 腫 内 に は 原 虫 感 染 細 胞 、Foxp3゛T細 胞 、Foxp3‑T 細 胞 が 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た 、 肉 芽 腫 組 織 を レ ー ザ ー マ イ ク ロ ダ イ セ ク シ ョ ン 法 で 回 収 し 、 抑 制 性 サ イ ト カ イ ン のmRNA発 現 量 を 測 定 し た と こ ろ 、 」ivoxp3 遺 伝 子 のmRNA発 現 量 はTGF‑pよ り もIL‑l Om RNA発 現 量 と 相 関 し た 。 さ ら に 、 感 染 ロly/alyマ ウ ス にTregの 機 能 を 抑 制 す る 抗CD25抗 体 や 抗FR4抗 体 を 投 与 し た と こ ろ 、 肝 臓 内 原 虫 数 は 有 意 に 減 少 し た 。 こ の こ と か ら 、 免 疫 不 全 ロ ら ′ ／ ロ ケ マ ウ ス の内 臓 リ ー シ ュ マ ニ ア 症 に お い て は 、 制 御 性T細 胞 がIL‑10を 介 し て 肝 臓 内 原 虫 を 制 御 し て い る 可 能 性 が 示 さ れ た 。

  本 研 究 は 、 パ キ ス タ ン の 皮 膚 リ ー シ ュ マ ニ ア 症 の 新 流 行 地 に お け る べ ク タ ー に 関 す る 有 用 な 情 報 を 提 供 し た 。 ま た 、 免 疫 不 全 宿 主 に お け る り ー シ ュ マ ニ ア 原 虫 の 肝 臓 内 存 続 に お け る 制 御 性T細 胞 の 関 与 を 明 示 し 、 内 臓 リ ー シ ュ マ ニ ア 症 に 対 す る 新 規 治 療 法 開 発 に 向 け て の 有 用 な 情 報 を 提 供 し た 。

  よ っ て 、 審 査 委 員 一 同 は 、 上 記 博 士 論 文 提 出 者SARUDA TIWANANTHAGORN君 の 博 士 論 文 は 、 北 海 道 大 学 大 学 院 獣 医 学 研 究 科 規 程 第6条 の 規 定 に よ る 本 研 究 科 の 行 う 博 士 論 文 の 審 査 等 に 合 格 と 認 め た 。

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