高等学校教育現場において利用可能な
日本産ワレカラ類の形態的・分子的分類指標の開発
谷 良夫 阪 口正 樹 笠原恵
1 研 究 目 的 ワ レ カ ラ 類 は ， 大 阪 湾 を は じ め 日 本 各 地 の 漁 港 や ヨ ッ ト ハ ー バ ー の 浮 き 桟 橋 や ロ ー プ に 生 育 す る 海 藻 や コ ケ ム シ ， ヒ ド ロ 虫 か ら 容 易 に 採 集 で き る 。 ま た ， 流 れ 藻 に も 見 つ か る 。大 阪 湾 で は 20 種類近くのワレカラ が生息している（阪 口 2009，2012）。ワレ カ ラ は ヨ コ エ ビ な ど と と も に 端 脚 目 に 属 す る 。 ワ レ カ ラ の 形 態 的 特 徴 は 、 ヨ コ エ ビ の よ う に 体 が 扁 平 で は な く ， 円 筒 状 で 腹 部 が 退 化 し て い る こ と で あ る 。 日 本 に は 105 種 類 生 息 し ， そ の 中 で Caprella 属 は 71 種を 占める（Takeuchi 1999）。Caprella 属 は ， 主 に 温 帯 お よ び 亜 寒 帯 海 域 で 生 息 し て お り ， 大 阪 湾 の 各 所 に 生 息 し ， 海 藻 や ロ ー プ な ど か ら 簡 単 に 採 集 で き る 。 ま た ミ ト コ ン ド リ ア DNA（mtDNA）の 解析 も 行わ れて い る （ 谷 ・ 阪 口 2013）。 高 等 学 校「 理 科 」「 生 物 基 礎 」お よ び「 生 物 」で は 遺 伝 子 に 対 す る 理 解 を 深 め る た め に DNA モデルを作成する実習が一般的 に行われている（嶋田 ほか 2013）。野 外生 態 調 査 と 遺 伝 子 解 析 と DNA モ デル の 作 成を 融合 させ た多 角 的な 遺伝 実習 の教 材 とし て の ワ レ カ ラ 類 の 可 能 性 を 検 討 し た 。 2 研 究 方 法 大 阪 湾 各 地 の 海 域 に お い て ， 海 藻 （ 草 ） か ら ワ レ カ ラ を 採 集 し た （ 表 2）。採集した ワ レ カ ラ を 70％エタ ノールで固定した。検 索表（表 1）をもとに 実体顕微鏡の下で同 定 し た 。 付 属 肢 を 外 し ，DNA 抽出材料とした。国 際 塩 基 配 列 デ ー タ ベ ー ス （INSD International Nucleotide Sequence Database） よ り ト ゲ ワ レ カ ラ Caprella scaura Templeton の mtDNA データ（アクセッション番 号 NC_014687）をダ ウンロードし，Primer3（v. 0.4.0）により mtDNA の cytochrome c oxidase subunit I (COI) 領 域 に 対 し プ ラ イ マ ー セ ッ ト （CSCO173F：5’-ATT AAA CGA TGG CTA CTT TCG ACA AAC CAC-3’，CSCO902R：5’-AAA TAT AAA CTT CTG GGT GCC CGA AAA ATC-3’）を設 計し， 北海道システムサイエ ンス社に DNA 合成 を 委 託 し た 。 ま た ト ゲ ワ レ カ ラ の 16S ribosomal RNA（16S）領 域に対するプライマー セ ッ ト（16S424F：5’-GGC TGC GGT ATA CTA ACT GTG CTA AGG T -3'，16S424R： 5’-AAT TAA GGG TTG AAC AAA CCC TCC TTT A -3'，谷・阪 口 2013） お よ び DNA バ ー コ ー デ ィ ン グ に 用 い ら れ る COI 領 域 に 対 す る 汎 用 プ ラ イ マ ー （ LCO1490/ HCO2198，Folmer et al. 1994）についても 北海道システムサイエ ンス社に DNA 合成
を 委 託 し た 。 採 集 し た ト ゲ ワ レ カ ラ か ら Qiagen 社製の DNeasy Blood & Tissue キッ
ト を 使 っ て DNA を抽出し，種特異的プライ マーを作成し PCR 法 により DNA 増幅を
行 っ た 。
PCR 産物は 2％ア ガロースゲルを用いて 電気泳動し， DNA 増 幅バンドを確認した。 切 り 出 し た バ ン ド を Roche High Pure PCR Product Purification Kit を用いて精製し， 北 海 道 シ ス テ ム サ イ エ ン ス 社 に 委 託 し て 上 流 と 下 流 か ら 塩 基 配 列 を 解 読 し た 。 解 読 デ ー タ は MOLECULAR VOLUTIONARY GENETICS ANALYSIS 6（MEGA6，Tamura et al. 2013）でアラ インメン トし ，上流 と下流か ら解 読した データが 完全 に一致 する 部 分 を 解 析 に 用 い た 。The National Center for Biotechnology Information（NCBI） の The Basic Local Alignment Search Tool（BLAST） を用いて 相同性の高いデータ を 検 索 し ，MEGA６ を用いて系統樹の作成 を行った。 DNA モ デル はパ ー ラー ビー ズ（株 式 会 社 カ ワ ダ） を 家 庭 用 ア イ ロ ン （TA-FV410，東 芝 ） で 加 熱 し て 作 成 し た 。 加 熱 後 冷 却 す る 際 に 手 で ね じ っ て ら せ ん 状 に 成 形 し た 。 3 結 果 大 阪 湾 各 地 の 海 域 に お い て ，海 藻（ 草 ）か ら 採 集 し た ワ レ カ ラ 類 の 中 か ら 8 種 20 個 体 を 選 び ，PCR 法によ る DNA 増幅を行った 結果，プライマーセッ ト 16S424F/16S424R お よ び LCO1490/HCO2198 を用いた DNA 増幅では良好な結果が 得られた。しかしプ
ラ イ マ ー セ ッ ト CSCO173F/CSCO902R を 用いた場合は Caprella scaura，Caprella decipiens Mayer および Caprella penantis Leach の 3 種について は良好な結果が得ら
れ た が ， 他 の 5 種については良好な DNA 増幅結果は得られなか った。 十 分 な DNA 増幅結果が得られた PCR 産物 について塩基配列の解 読を試みた結果， プ ラ イ マ ー セ ッ ト 16S424F/16S424R によ る PCR 産物につ いて は良好な解読結果が得 ら れ た 。 し か し プ ラ イ マ ー セ ッ ト LCO1490/HCO2198 によ る PCR 産物につい ては， ノ イ ズ が 多 く ， 良 好 な 解 読 結 果 は 得 ら れ な か っ た 。 良 好 な 解 読 結 果 が 得 ら れ た 16S 領域につい て，MEGA6 を用いて ，解析を行った。 Maximum Composite Likelihood model を用いて 1000 回繰り返 し計算した結果，そ れ ぞ れ の 塩 基 配 列 デ ー タ 間 の 遺 伝 距 離 の 平 均 値 （Average Evolutionary Divergence over all Sequence Pairs）は，0.1869（標 準誤差 0.0175）であ った。なお解析した塩
基 長 は 289bp であっ た。今回作成した検索 表（表１）に従って， 今回分類・解析した ワ レ カ ラ 類 8 種は 0.1250 から 0.2421 のグループ間遺伝距離を示 した（表 3）。また作 成 し た 分 子 系 統 樹 で は 8 種はそれぞれグループを形 成 し た （ 分 岐 率 97%以 上 ， 図 １ ）。 解 析 し た 塩 基 配 列（305bp）で 8 種それぞれが異なる領域（84 番 目から 93 番目，図 2）について DNA モ デルを設計し，制作し た（図 3， 図 4）。2016 年 2 月 11 日（ 木） に き し わ だ 自 然 資 料 館 （ 大 阪 府 岸 和 田 市 堺 町 6 番 5 号） におい て兵庫県立尼崎小田高 等 学 校 自 然 科 学 部 生 物 班 の 小 阪 田 悠 生 ， 北 浦 大 樹 ， 大 塚 輝 人 ， 今 村 拓 未 ら 4 名が行っ た ミ ニ 実 習 で は 来 館 者 が 同 様 の ワ レ カ ラ DNA モデルを作成した。小学生からお年寄り
ま で 熱 心 に 作 成 し ， 好 評 を 博 し た 。 4 考 察 大 阪 湾 各 地 の 海 域 に お い て ， 海 藻 （ 草 ） か ら 採 集 し た ワ レ カ ラ 類 の 中 か ら 8 種につ い て 遺 伝 子 解 析 を 行 う 場 合 ， 今 回 用 い た 3 つ の プ ラ イ マ ー セ ッ ト の 中 で は 16S424F/16S424R が 解析に適していた。 ワ レ カ ラ 類 の 標 本 か ら DNA を抽出する際には，体表に付着す る 各種生物の DNA が 混 入 し て し ま う 。ノ イ ズ を 防 ぐ た め に は LCO1490/ HCO2198 のような汎用プライマー で は な く ， 特 異 的 な プ ラ イ マ ー を 設 計 す る 必 要 が あ る と 思 わ れ る 。 し か し 種 特 異 的 に な り す ぎ る と ， プ ラ イ マ ー セ ッ ト CSCO173F/CSCO902R のよう に，増幅可能な種が 限 定 さ れ て し ま う の で 今 回 の よ う な 種 を ま た い だ 遺 伝 子 解 析 に は 不 向 き で あ る 。 プ ラ イ マ ー セ ッ ト 16S424F/16S424R（谷・阪口 2013）は広く Caprella 属 に 対 し て 利 用 で き る 便 利 な プ ラ イ マ ー セ ッ ト で あ る こ と が 再 確 認 さ れ た 。 作 成 し た 検 索 表（ 表 1）によって形態的に 分 類された 8 種がそれぞれ遺伝的なグルー プ を 形 成 し た こ と か ら （ 図 1），今回作成し た検索表の確からしさ が裏付けられた。 高 等 学 校「 理 科 」「 生 物 基 礎 」お よ び「 生 物 」で は 遺 伝 子 に 対 す る 理 解 を 深 め る た め に DNA モデルを作成する実習が一般的に行 われている（嶋田ほか 2013）。DNA モデ ル を 作 成 す る こ と に よ り ， 遺 伝 情 報 が 塩 基 配 列 で 記 録 さ れ て お り ， 遺 伝 子 （DNA）は 遺 伝 情 報 を 載 せ て い る メ デ ィ ア で あ る こ と が 理 解 で き る と 思 わ れ る 。 生 徒 が 自 ら 野 外 実 習 で 各 種 ワ レ カ ラ 類 を 採 集 し ，生 物 の 多 様 性 を 実 感 し た 後 に ，ワ レ カ ラ 各 種 の DNA を 解 析 し ，さ ら に DNA モデルを作成するこ とにより，その生 物の 多様性を裏付けてい る 遺 伝 子 の 多 様 性 を よ り は っ き り と 理 解 す る こ と が で き る と 思 わ れ る 。日 本（ 大 阪 湾 ） に お け る Caprella 属 各 種 が ，生 態 系 と 遺 伝 子 の 関 係 を 理 解 す る ，有 効 な 教 材 と な る 可 能 性 が 示 さ れ た 。 5 参 考 文 献
Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R, Vrigenhoek R. 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3: 294-299. 阪 口 正 樹. 2009． 大 阪 湾 初 記 録 の ウ ミ モ ワ レ カ ラ (端 脚 目 ， ワ レ カ ラ 科 ). 南 紀 生 物 , 51(2):163-164. 阪 口 正 樹. 2012．大阪 湾産のワレカラ(甲殻 綱・端脚目). 兵庫生物，14(3):201-212. 嶋 田 正 和・久 保 田 洋・坂 井 建 雄・塩 川 光 一 郎・鈴 木 孝 仁・鈴 木 誠・園 池 公 毅・田 村 実 ・ 仲 田 崇 史 ・ 湯 本 貴 和 ・ 板 山 裕 ・ 大 森 茂 樹 ・ 久 保 田 一 暁 ・ 中 井 一 郎 ・ 中 道 貞 子 ・ 中 村 厚 彦・中 村 哲 也・鍋 田 修 身・早 崎 博 之・林 誉 樹・矢 嶋 正 博. 2013．文部科学省検 定 済 教 科 書 高等学校 理科用 生物 数研出版（生物/303）学 校–2013．424pp．数 研
出 版 ， 東 京 ．
Takeuchi I ． 1999 ． Checklist and bibliography of the Caprellidea(Crustacea: Amphipoda) from Japanese waters. Otsuchi Marine Science 24:5-17.
Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., and Kumar S. 2013. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729.
谷 良 夫・阪 口 正 樹. 2013．mtDNA の遺伝子解析によるワレカラ（ 甲殻綱，端脚目）の 同 定. 兵庫生物，14(4):271-278.
表 1 ワレカラ属 8 種の検索表 1 頭部に突起あり 2 1 頭部に突起なし 7 2 頭部背側に鋭い突 起あり 3 2 頭部前方に突起あ り 4 3 第 5 胸節背側に突起なく，胸肢前節の把 握棘は中位にある カ マ テ ワ レ カ ラ Caprella simia 3 第 5 胸節背側に突起あり，胸肢前節の把 握棘は近位にある トゲ ワレカラ Caprella scaura 4 頭部前方の突起は しっかりと突出してい る マ ル エ ラ ワ レ カ ラ Caprella penantis 4 頭部前方の突起は わずかである 5 5 第 2 胸節の胸脚間に突起あり クビナガ ワレカラ Caprella equilibra 5 第 2 胸節の胸脚間に突起なし 6 6 エラは細長く体に 平行につく ツガル ワレカラ Caprella tsugarensis 6 エラは丸い セムシ ワレカラ Caprella brevirostris 7 頭部前部が少し角 張っている 2 7 頭部前部が丸い 8 8 胸脚前節に把握棘 あり モノ ワレカラ Caprella monoceros 8 胸脚前節に把握棘 なし マギレ ワレカラ Caprella decipiens
表 2 解析個体 標 本 番 号 採 集 年 月 日 採 集 場 所 採 集 者 名 種 名 1 20154087 2015.7.3 兵 庫 県 神 戸 市 垂 水 区 平 磯 Ａ 地 点 阪 口 正 樹 C. brevirostris 2 20154088 2015.7.3 兵 庫 県 神 戸 市 垂 水 区 平 磯 Ｄ 地 点 阪 口 正 樹 C. brevirostris 3 20154103 2015.7.26 兵 庫 県 洲 本 市 由 良 町 由 良 阪 口 正 樹 C. decipiens 4 20154104 2015.7.26 兵 庫 県 洲 本 市 由 良 町 由 良 阪 口 正 樹 C. decipiens 5 20154077 2015.3.25 兵 庫 県 神 戸 市 須 磨 区 海 釣 り 公 園 阪 口 正 樹 C. equilibra 6 20154078 2015.3.25 兵 庫 県 神 戸 市 須 磨 区 海 釣 り 公 園 阪 口 正 樹 C. equilibra 7 20154079 2015.3.25 兵 庫 県 神 戸 市 須 磨 区 海 釣 り 公 園 阪 口 正 樹 C. equilibra 8 20154101 2014.7.25 兵 庫 県 洲 本 市 由 良 町 由 良 阪 口 正 樹 C. monoceros 9 20154102 2014.7.25 兵 庫 県 洲 本 市 由 良 町 由 良 阪 口 正 樹 C. monoceros 10 20154073 2015.3.25 兵 庫 県 神 戸 市 須 磨 区 海 釣 り 公 園 阪 口 正 樹 C. penantis 11 20154074 2015.3.25 兵 庫 県 神 戸 市 須 磨 区 海 釣 り 公 園 阪 口 正 樹 C. penantis 12 20154075 2015.3.25 兵 庫 県 神 戸 市 須 磨 区 海 釣 り 公 園 阪 口 正 樹 C. penantis 13 20154116 2015.2.27 大 阪 府 岸 和 田 市 港 緑 町 阪 口 正 樹 C. penantis 14 20154118 2015.6.25 兵 庫 県 洲 本 市 由 良 町 由 良 阪 口 正 樹 C. penantis 15 20154003 2014.2.23 大 阪 府 泉 南 郡 岬 町 淡 輪 漁 港 阪 口 正 樹 C. scaura 16 20154006 2014.2.7 大 阪 府 泉 南 郡 田 尻 町 り ん く う ポ ー ト 阪 口 正 樹 C. scaura 17 20144014 2014.7.3 兵 庫 県 神 戸 市 垂 水 区 福 田 川 尻 阪 口 正 樹 C. simia 18 20144015 2014.7.3 兵 庫 県 神 戸 市 垂 水 区 福 田 川 尻 阪 口 正 樹 C. simia 19 20154083 2015.7.2 兵 庫 県 神 戸 市 垂 水 区 平 磯 Ｃ 地 点 阪 口 正 樹 C. tsugarensis 20 20154093 2015.7.3 兵 庫 県 神 戸 市 垂 水 区 平 磯 Ａ 地 点 阪 口 正 樹 C. tsugarensis 表 3 16S ribosomal RNA 領 域 に お け る ワ レ カ ラ 属 8 種 の グ ル ー プ 間 遺 伝 距 離 （Divergence over Sequence Pairs between Groups）
1 2 3 4 5 6 7 8 1 C. simia 0.0305 0.0279 0.0341 0.0249 0.0226 0.0294 0.0275 2 C. scaura 0.2107 0.0261 0.0319 0.0271 0.0302 0.0266 0.0284 3 C. penantis 0.1753 0.1709 0.0280 0.0251 0.0301 0.0296 0.0266 4 C. equilibra 0.2353 0.2328 0.1895 0.0295 0.0311 0.0334 0.0316 5 C. tsugarensis 0.1546 0.1823 0.1541 0.2063 0.0231 0.0266 0.0231 6 C. brevirostris 0.1250 0.2174 0.1980 0.2156 0.1340 0.0276 0.0268 7 C. monoceros 0.1822 0.1776 0.1966 0.2421 0.1766 0.1867 0.0252 8 C. decipiens 0.1786 0.2067 0.1685 0.2197 0.1428 0.1788 0.1663 表 の 右 斜 め 下 部 分 の 数 値 は グ ル ー プ 間 遺 伝 距 離, 表 の 右 斜 め 上 部 分 の ア ン ダ ー ラ イ ン の 数 値 は 標 準 誤 差 を 示 す 。Maximum Composite Likelihood model を用いて、1000
回 繰 り 返 し 計 算 し た 。 解 析 し た 塩 基 長 は 289bp であった。
図 1 16S ribosomal RNA 領域におけるワ レカラ属 8 種 20 個体の分子系統樹
Maximum Likelihood method により，1000 回繰り返し計算した 。解析した塩基長は 289bp で あ っ た 。 外 群 と し て Parhyale hawaiiensis Dana （ ア ク セ ッ シ ョ ン 番 号 AY639937）を用 いた 。分岐率 95%以上数値のみ示した。 標 本 番 号 学 名 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 20144014 Caprella simia T A C A C T A A A A 20154003 Caprella scaura T T T T C T A G A G 20154073 Caprella penantis T A A A C T A A A A 20154077 Caprella equilibra T G A G T T G G C T 20154083 Caprella tsugarensis T G C A C T A G A A 20154087 Caprella brevirostris T A G A C T A A A A 20154102 Caprella monoceros T A C A C T A A A T 20154103 Caprella decipiens T A C A T T G G A T 図 2 16S ribosomal RNA 領域におけるワ レカラ属 8 種の塩基配列 解 析 し た 塩 基 配 列（305bp）で 8 種それぞれが異なる領域（85 番目から 93 番目）を 含 む 塩 基 配 列 を 示 す 。A はアデニン，T はチミン，C はシトシン，G はグアニンを示す。
図 3 ワレカラ属 8 種の DNA モデル（16S ribosomal RNA 領域）図案
A はアデニン，T はチ ミン，C はシトシン ，G はグアニン，P はリン酸，D はデオキシ リ ボ ー ス を 示 す 。
図 4 20154077 Caprella equilibra ク ビ ナ ガ ワ レ カ ラ の DNA モデル
84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 P D P D P D P D P D P D P D P D P D P D 20144014 Caprella simia T A C A C T A A A A カマテワレカラ A T G T G A T T T T D P D P D P D P D P D P D P D P D P D P P D P D P D P D P D P D P D P D P D P D 20154003 Caprella scaura T T T T C T A G A G トゲワレカラ A A A A G A T C T C D P D P D P D P D P D P D P D P D P D P P D P D P D P D P D P D P D P D P D P D 20154073 Caprella penantis T A A A C T A A A A マルエラワレカラ A T T T G A T T T T D P D P D P D P D P D P D P D P D P D P P D P D P D P D P D P D P D P D P D P D 20154077 Caprella equilibra T G A G T T G G C T クビナガワレカラ A C T C A A C C G A D P D P D P D P D P D P D P D P D P D P P D P D P D P D P D P D P D P D P D P D 20154083 Caprella tsugarensis T G C A C T A G A A ツガルワレカラ A C G T G A T C T T D P D P D P D P D P D P D P D P D P D P P D P D P D P D P D P D P D P D P D P D 20154087 Caprella brevirostris T A G A C T A A A A セムシワレカラ A T C T G A T T T T D P D P D P D P D P D P D P D P D P D P P D P D P D P D P D P D P D P D P D P D 20154102 Caprella monoceros T A C A C T A A A T モノワレカラ A T G T G A T T T A D P D P D P D P D P D P D P D P D P D P P D P D P D P D P D P D P D P D P D P D 20154103 Caprella decipiens T A C A T T G G A T マギレワレカラ A T G T A A C C T A D P D P D P D P D P D P D P D P D P D P
