Tm mapping 法が迅速診断に有用であった脳膿瘍の小児例 1

(1)

第93回日本感染症学会総会・学術講演会座長推薦演題

Tm mapping 法が迅速診断に有用であった脳膿瘍の小児例

1）埼玉県立小児医療センター感染免疫・アレルギー科，^2）富山大学臨床分子病態検査学講座，

3）埼玉県立小児医療センター脳神経外科

上島洋二

^１）^２）

栗原淳

^３）

古市美穂子

^１）

佐藤智

^１）

仁井見英樹

^２）

川野豊

^１）

大石勉

^１）

菅沼栄介

^１）

（令和元年9月6日受付）

（令和2年1月29日受理）

Key words : brain abscess, melting temperature mapping method,Streptococcus intermedius

序文

2018

年に「多項目遺伝子関連検査の実施指針」が示され，臨床応用が進められてきている．早期に原因菌が特定されれば，抗菌薬の適正使用につながることが期待される．

melting temperature mapping method

（以下，Tm mapping 法）は，16S rRNA 遺伝子（16

S rDNA）を用いた新たな迅速原因菌同定法であり，

培養液を用いずに検体採取から最短

3

時間で原因菌を同定することができる

^１）

．今回，我々は

Tm mapping

法により，脳膿瘍の排膿液から

Streptococcus interme- dius

を迅速同定し，経験的治療を支持することができた脳膿瘍の男児例を報告する．

症例

患者は

11

歳の男児で，乳児期に他院で両大血管右室起始症，肺動脈狭窄症，総肺静脈還流異常症に対し

て

Fontan

手術（右左短絡作成）を施行され，その後

も他院で術後管理を行われていた．無脾症を指摘されていたが予防的抗菌薬の内服は行われていなかった．

予防接種歴は，Hib ワクチンは未接種で，7 価肺炎球菌結合型ワクチンを

1

回，3 種混合ワクチン，日本脳炎ワクチンを各々

3

回，

MR

ワクチン，水痘ワクチン，

ポリオ生ワクチンを各々

2

回，BCG を接種済であった．X−18 日に頭痛のため近医を受診し鎮痛薬を処方されたが改善せず，X−4 日に頭痛が増悪したため

X

日に前医を再診した．頭部

CT

で脳腫瘍を疑われ当院へ紹介受診した．

入院時体温

36.3℃，血圧86/42mmHg，心拍数80

回/分，呼吸数

20

回/分，意識清明．神経学的に異常所見は認められなかった．血液検査では，

WBC 11,900/

μL（Band 2%，Seg 64％），CRP 0.82mg/dL

と炎症反応の上昇を認めた．頭部造影

MRI

で左前頭葉に，周囲に造影効果のある被膜様構造を有する多房性腫瘤

（57mm×54mm）を認めた（Fig. 1a）．画像所見より脳膿瘍と考え，入院

4

日目に術前抗菌薬としてセファゾリンを投与後に脳膿瘍排膿ドレナージ術を行った．

排膿液の性状は黄緑色膿性，異臭を伴い，グラム染色では連鎖状のグラム陽性球菌が認められた．入院時に採取されていた血液培養は

2

セットとも陰性であった．手術直後からセフォタキシム（CTX）

300mg/kg/

day

とメトロニダゾール（MNZ）40mg/kg/day を開始した．排膿液を用いて当院で

melting temperature mapping

法（以下，Tm mapping 法）を行い，排膿液採取後，4 時間半後に

S. intermedius

を同定した．心臓超音波検査では疣贅や血栓などは認められなかったが，耳鼻科医，歯科医の診察により，副鼻腔炎，齲歯を指摘された．術後

4

日目に排膿液の培養検査からコロニーが得られたため当院で

MALDI Biotyper

（Bruker Japan）による質量分析法で，同じ

S. interme- dius

が

Score Value 2.26（Score Value 2.0

以上は菌種レベルの一致，Score Value 1.7 以上

2.0

未満は属レベルの一致，Score Value 1.7 未満は分類不能）で同定された．また，生化学的性状を調べる

API 20 Strep

（bioMérieux）でも

S. intermedius

と同定された．排膿後に頭痛は軽快し

WBC，CRP

は低下したが，徐々に頭痛が増悪し，入院

15

日目の

MRI

で膿瘍が拡大しており（Fig. 1b），脳膿瘍摘出術を行った．頭痛は消

症例

別刷請求先：（〒330―8777）埼玉県さいたま市中央区新都心 1―2

埼玉県立小児医療センター感染免疫・アレル

ギー科上島洋二

(2)

Fig. 1 Enhanced MRI showing (a) multiple abscesses in the left frontal lobe of the brain upon admission and (b) a ring-enhancing developed lesion that caused a midline shift of the left frontal lobe to the right side of the brain 24 days after admission.

㼍㼎

失し，CTX と

MNZ

を継続した．薬疹を疑う皮疹の出現があり，抗菌薬は計

40

日間で入院

43

日目に終了した．入院

49

日目にアモキシシリン内服後に抜歯を行い，同日退院した．術後

1

年経過するが合併症や後遺症はなく再燃を認めていない．

考察

小児脳膿瘍は，4 人/100 万人程度と稀な疾患である

^２）

．そのリスク因子として，未修復のチアノーゼ性先天性心疾患，化膿性血栓性静脈炎や感染性心内膜炎などの血行性因子が

30％，また，中耳炎や副鼻腔炎，

齲歯，VP シャント感染などの脳の隣接部から直接波及することが

40％程度，原因不明が30％と考えられ

ている

^３）

．また，感染性心内膜炎の中枢神経合併症として脳膿瘍を起こすことが知られている．本症例では，

先天性心疾患に対して

Fontan

手術が行われ，右左短絡が形成されていた．また，来院時に膿性鼻漏があり，

耳鼻咽喉科医の診察で急性副鼻腔炎を，歯科医により齲歯を指摘されていたが，MRI では副鼻腔炎は右上顎洞であり，上顎洞や齲歯に隣接した部位に骨髄炎などはなかった．脳の隣接部から直接波及した可能性は低いと考えられたため，血液培養は陰性であったものの血行性に波及した可能性が考えられた．それぞれのリスク因子に対しては，心臓超音波検査で疣贅がないことを確認し，歯科で口腔環境の保清と抜歯などの適切な介入を行った．

S. intermedius

は

viridans streptococci

の一種で，16

S rDNA

の系統解析では

Streptococcus anginosus，

Streptococcus constellatus，S. intermedius

の

3

種類を含む

anginosus group

に分類される

^４）

．なかでも

S. inter-

medius

は中枢神経感染症や肝膿瘍の起因菌となるこ

とが多い．PubMed で渉猟しえた範囲で，16S rDNA 系統解析で

S. intermedius

が同定され原因菌として報告された

16

歳以下の小児脳膿瘍の過去の

9

症例を

Tableに示す．9

症例中

5

症例では

S. intermedius

以外にも細菌が検出されており，単独感染よりもむしろ複数菌の混合感染と考えられる症例のほうが多かった．

9

症例中，6 症例では培養検査で

S. intermedius

を検出できなかった．一般細菌培養は先行抗菌薬の影響を受けて偽陰性になることがある．このような場合でも

16

S rDNA

であれば同定できる可能性がある．原因菌が

同定できないと，経験的治療で選択した広域抗菌薬を治療終了まで継続せざるを得なくなり，抗菌薬適正使用の観点からも好ましくない．先行して抗菌薬を投与された脳膿瘍の症例では，培養検査よりも

16S rDNA

を用いた検査は原因菌の同定に有用と思われる．

Tm mapping

法は

16S rDNA

に対する

bacterial universal PCR

を用いた細菌の迅速同定検査である

^１）

．先ず，全血やそのほかの臨床検体から

bacterial DNA

を抽出する．次に

bacterial DNA

の

contamination

が皆無である

eukaryote-made Taq DNA polymerase

と

1

つの

bacterial universal primer（全ての細菌をPCR

検出するプライマー）を用いて

1st PCR

を行い，その後に

7

つの

bacterial universal primer

を使用して

2nd nested PCR

を行う．そして，得られた

7

つの

PCR amplicon

の

Tm

値を測定し

2

次元にマッピングし，

データベースに登録されている菌種と照合して細菌を

迅速同定する．同定結果の正確性は

Difference Value

値を用いて評価する．Tm mapping 法の敗血症起炎

(3)

Table Case reports of brain abscesses with S. intermedius detected with the 16S rDNA sequence

Case Sex/

Age (yr)

Clinical

examination Initial symptoms Location

Antibiotic therapy prior

to specimen collection

Culture 16S rDNA sequence Refer- ence

1 M/5 CHD Fever, Headache,

Vomiting

Multiple ＋ S. intermedius S. intermedius S. constellatus Fusobacterium Campylobacter curvus

Filifactor alocis

12)

2 M/10 N/A Fever, Speech

disorder, Convulsion

Fronto- parietal lobe

＋ Negative S. intermedius

S. constellatus

3 M/13 Nothing Fever, Headache Frontal lobe ＋ Negative Prevotella oris

Fusobacterium nucleatum S. intermedius

4 M/13 Sinusitis Headache Frontal lobe ＋ Viridans

Streptococci

S. intermedius 13)

5 F/9 Sinusitis N/A N/A None S. intermedius S. intermedius 14)

6 F/3 N/A N/A N/A None S. intermedius S. intermedius

Actinomyces aphrophilus 7 M/6 Ebstein anomaly,

Otitis media, Patent foramen

ovale

Fever, Headache, Vomiting, Syncope

Multiple ＋ Negative S. intermedius 15)

8 M/16 Nothing Vomiting, Myalgia, Chill, Headache

Multiple ＋ Negative S. intermedius

S. constellatus

9 F/16 Sinusitis Headache Frontal lobe N/A Viridans

Streptococci S. intermedius 16) CHD: congenital heart disease, F: female, GPC: Gram positive cocci, GSD: glycogen storage disease, M: male, N/A: not applicable, ＋: detected

菌同定システム（データベース型起炎菌同定ソフトウェア）には

2019

年

7

月現在，162 菌種が登録されており，それぞれの菌種には更に

2〜3

の

mutant strains

が含まれる．埼玉県立小児医療センターで

2011

年から

2015

年に採取された血液培養で陽性となった

605

ボトルでは，データベースは

99％（588

ボトル）をカバーしていた．一方，菌種では，陽性となった菌種は

46

菌種で，そのうち

91％（42

菌種）をカバーしていた．データベースの拡充により，まれな菌種の同定が可能となるか検証が必要である．Tm mapping 法では，PCR 法により核酸を増幅するため臨床検体

内の

dominant

な菌が増幅される．また，複数菌が量

的に同程度含まれる場合，7 つの

Tm

値が重なり合って起炎菌の同定が困難となるため，Tm mapping 法は主に無菌検体に対する単一菌の同定に適している．

喀痰や肛門周囲膿瘍などの複数菌の関与が多い感染症の起炎菌の同定時には複数菌の菌量の割合によって

dominant

な菌のみ同定するか，同定が不可能となる．

また，bacterial universal primer を用いた

PCR

検出であるため，細菌のみを同定する．Tm mapping 法は培養を要せず臨床検体から直接同定が可能であるため，特に迅速検査を必要とするケースでの用途が期待される．汎用化のためには検査工程で

contamination

が起こらないように簡易化と機械化が今後の課題である．本症例では，術中に得られた排膿液

50μL

から

Bac- terial DNA Extraction Kit（三井化学，日本）を用い

て添付説明書に従って

bacterial DNA

を抽出した．そ

の後，上記の通り

1st PCR

を行い，16S rDNA の増幅を確認した（Fig. 2a）．2nd PCR の結果，7 つの

Tm

値が得られ（Fig. 2b），データベースと照合し

S. inter-

medius

と一致し脳膿瘍の

dominant

な原因菌を早期に

検出した（Fig. 2c）．検出された原因菌の種類から，口腔内ないしは上気道が感染の侵入門戸と考えられた．

脳膿瘍において齲歯や副鼻腔炎などの上気道が感染の侵入門戸と考えられた場合には，viridans strepto-

cocci，Haemophilusspp.，Fusobacteriumspp.，Bacteroi-

des spp.などが一般的な原因菌として頻度が高いため，

内科的治療として，抗菌薬は第三世代セフェムとメトロニダゾールが推奨される

^５）

．小児において初期治療として外科的治療と内科的治療を比較した前向き臨床研究はないが，Arlotti ら

^６）

はシステマティックレビューを行い，入院時に重度の神経学的障害がない

（GCS＞12），2.5cm 未満の小膿瘍，多発性脳膿瘍，外科手術の禁忌がある場合，には内科的治療を先行し，

1〜2

週間以内に臨床的および画像評価による改善が見られない場合，手術を再検討すべきとしている．また，治療期間として，内科的治療のみでは

6〜8

週間，

外科的治療を行った患者では

4〜6

週間の治療が推奨

される．抗菌薬の移行性に関しては，CTX と

MNZ

の脳膿瘍への移行性は良いことが報告されている

^７）^８）

．

本症例では，神経学的所見に異常は認めず，入院時の

MRI

で左前頭葉に被膜様構造を有する多房性腫瘤を

認めた．菌量の減少と原因菌の同定目的に排膿ドレ

ナージを行い，術後から脳膿瘍への移行性の良い

CTX

(4)

Fig. 2 (a) Amplification of the 16S rDNA using the bacterial universal primer. (b) Melting curves of the seven amplicons. (c) The seven melting temperatures (Tm) of the amplicons were mapped and its plot matches with the plot of S. intermedius in the database.

と

MNZ

の点滴静注を継続したが，排膿ドレナージ後，

3

週間後に膿瘍径が

5cm

まで拡大し，改善に乏しいため開頭による膿瘍摘出術を行った．開頭時に得られた排膿液は白色膿であった．開頭に至った理由として，

膿瘍が多房性であったことから初回の排膿ドレナージで十分に排膿されなかった可能性が考えられた．外科的治療と約

6

週間の抗菌薬治療により後遺症なく改善した．

Tm mapping

法は，16S rDNA から得られた

7

つの

amplicon

の

Tm

値をもとに菌を同定するため，厳密には

16S rDNA

系統解析と手法は異なる．

Tm mapping

法によって迅速診断や治療につながった小児の症例は過去に

3

例報告されている

^{９）〜１１）}

．いずれの症例においても

Tm mapping

法で得られた結果と臨床情報を参考にして抗菌薬の

de-esalation，または経験的

治療の支持が行われた．本症例では，排膿ドレナージ直後から経験的治療として

CTX

と

MNZ

で治療を開始し，術直後の排膿液から

Tm mapping

法で

S. inter-

medius

を短時間で同定し，経験的治療としての

CTX

と

MNZ

の継続を支持した．後日，排膿液の培養検査

BacT/ALERT 3D Microbial Detection System

（BioMerieux, France）でコロニーが発育し

MALDI- TOF MS

でも

S. intermedius/milleri

が同定され，その後に得られた感受性の結果も全般的に良好であった．

副鼻腔炎や齲歯を認め，上述のとおり，過去の報告で

は他の口腔内常在菌との複数菌による混合感染が否定できないと判断し，抗菌薬の

de-escalation

は行わず

CTX

と

MNZ

併用をその後も継続した．

様々な検査ツールが開発されているが，それによって得られる結果と臨床情報を鑑み，適切に治療方針を選択することが求められる．本症例では，

Tm mapping

法により

dominant

である原因菌を短時間で同定した

が，同定された菌種から口腔内の常在菌による複数菌の混合感染が想定されたため抗菌薬の

de-escalation

には至らなかった．確実な初期治療を選択することができたが，一方で，複数菌混合感染の診断ないしは否定をどう行い，抗菌薬の適正使用につなげることができるかさらに症例を蓄積し詳細な検討が必要である．

利益相反自己申告：著者仁井見英樹は三井化学（株）

から奨学寄附金を受けている．

本研究は国立研究開発法人日本医療研究開発機構

（AMED）の支援によって行われた．

文献

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(6)

A Case of a Brain Abscess withStreptococcus intermediusRapidly Diagnosed with the Melting Temperature Mapping Method

Yoji UEJIMA^１）^２）, Jun KURIHARA^３）, Mihoko FURUICHI^１）, Satoshi SATO^１）, Hideki NIIMI^２）, Yutaka KAWANO^１）, Tsutomu OH-ISHI^１）& Eisuke SUGANUMA^１）

1)Division of Infectious Diseases and Immunology and Allergy, Saitama Childrenʼs Medical Center, ²⁾Department of Clinical Laboratory and Molecular Pathology, Graduate School of Medical and Pharmaceutical Science, University of

Toyama,³⁾Department of Neurosurgery, Saitama Childrenʼs Medical Center

An 11-year-old boy, who had undergone repair of a total anomalous pulmonary venous connection (TAPVC) and double outlet right ventricle (DORV) during infancy, presented with a headache. Sinusitis and dental caries were also observed. Computed tomography (CT) scan revealed a mass on the left frontal lobe of his brain. He was diagnosed as having a brain abscess (BA) based on the magnetic resonance imaging (MRI) findings. The BA was drained, and the patient was treated with 300mg/kg cefotaxime and 40mg/kg metronidazole per day intravenously as empirical therapy. The melting temperature mapping method re- vealedStreptococcus intermediusin the intracranial pus 4.5 h after drainage. The echocardiogram showed no infective endocarditis. Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI- TOF MS) detected the same organism from the pus 3 days after drainage. The organism was pansuscep- tible, and treatment was continued because the presence of anaerobic, Gram-negative bacilli was suspected in the sinus cavity and dental plaque. The brain abscess, however, grew to 5cm 3 weeks after the drainage even under continued antibiotic therapy. A craniotomy was performed, and the entire abscess, including the abscess wall, was excised. Antibiotics were continued for 6 weeks, and the patient recovered completely.

Rapid detection empirical therapy by administering appropriate antibiotics and total excision of the abscess successfully treated the patient. Thus, the use of rapid diagnostic tests and the melting temperature mapping method had significant impacts on effective antimicrobial stewardship.

Tm mapping 法が迅速診断に有用であった脳膿瘍の小児例 1