s and the related  INTRODUCTION

PLA

2

  induces  several  pharmacological  ef- fects  including  presynaptic  neurotoxicity,  myotoxicity  and  cardiotoxicity  as  well  as  anticoagulation,  hemolysis,  hemorrhage,  edema-induction  and  platelet-aggregation  inhibition [3‒5].  Habu ( T. flavoviridis ) in- habiting in the southwestern islands of Ja- pan contains several PLA

2

s and the related  INTRODUCTION

Phospholipase A

2

 (EC 3.1.1.4) is the major  component of most snake venoms [1], and  the  detailed  insight  into  the  structure  and  mechanism  of  these  enzymes  is  available  [2].  It catalyzes the hydrolysis of phospho- lipids  at  its  _sn -2  position.    Snake  venom 

Structural Analysis of Two Isoforms of Subunit B in Phospholipase A

₂

  Inhibitor PLI γ  from the Serum of Habu,  Trimeresurus flavoviridis

Narumi AOKI, Masanobu DESHIMARU, and Shigeyuki TERADA^１）

（Received November 

30

, 

2007

）

Abstract

Two distinct types of phospholipase A2 inhibitors (PLIs), PLI^α and PLI^γ, are present in the  serum of Habu (Trimeresurus flavoviridis). It is expected that, like other PLIγs, T. flavoviridis  PLIγ may contain two homologous subunits, A- and B-chains (also called α- and β-chains). 

Five proteins, termed PLI-I to PLI-V, were identified as the constituting subunits of two types  of PLIs. Based on the primary structures and the molecular sizes, PLI-I was assigned to be the  subunit A of T. flavoviridis PLIγ. In order to prove that PLI-II and PLI-III are the subunit B,  we have purified these proteins from the same serum, and determined the complete amino acid  sequences  by  peptide  analysis.  The  cDNA  encoding  PLI-II  was  also  cloned  from  a  cDNA  li- brary of the T. flavoviridis liver. The respective nucleotide sequence encoded 

19

-residue signal  sequences, followed by 

181

-residue proteins. Both PLI-II and PLI-III were glycosylated at Asn¹⁴,  and showed a high homology to several B-chains of PLIγ identified in other snakes. Gel filtra- tion analysis showed that all the PLIs exist in the T. flavoviridis serum as the high molecular  forms of more than 

60

 kDa, and PLI-II and PLI-III also associate to form the corresponding ho- modimers.

Key words:  amino acid sequence, cDNA cloning, phospholipase A2 inhibitor, snake serum,    Trimeresurus flavoviridis

1) Department of Chemistry, Faculty of Science, Fukuoka University, 8-19-1 Nanakuma, Jonan-ku, Fukuoka  814-0180, Japan

 Abbreviations: BPI, basic protein I; BPII, basic protein II; MALDI, matrix-assisted laser desorption ionization; PLA2,  phospholipase  A2;  PLI,  phospholipase  A2  inhibitor;  PCR,  polymerase  chain  reaction;  RACE,  rapid  amplification  of  cDNA ends; SDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; TFA, trifluoroacetic acid; TOF, time-of-flight; UTR,  untranslated region.

proteins such as acidic [Asp

⁴⁹

]-PLA

2

s (PLA2  and PLA-N), a basic [Asp

⁴⁹

]-PLA

₂

 (PLA-B),  and basic proteins I and II (BPI and BPII) [5

‒8].

Venomous  snakes  have  PLA

2

  inhibitors  (PLIs), proteins capable of inhibiting snake  venom PLA

₂

s, in their blood sera [9].  The  role of these proteins is postulated to pro- tect  themselves  from  the  leakage  of  their  own venomous PLA

2

s into their circulatory  system.    Many  PLIs  have  been  isolated  from various snake sera and their primary  structures  have  been  determined  [10‒

14].  PLIs can be divided into three groups  (PLI

α

,  PLI

β

,  and  PLI

γ

)  based  on  their  structural  characteristics.    PLI

α

s  are  75‒

100-kDa glycoproteins composed of three or  four  subunits  and  have  the  carbohydrate- recognition  domain  of  Ca

²⁺

-dependent  (C- type)  lectins  [12,16].    PLI

β

  is  a  160-kDa  glycoprotein composed of three identical 50  kDa subunits with leucine-rich repeats [17].  

PLI

γ

s  are  oligomeric  proteins  consisting  of  glycosylated  subunit  A  and  non-glyco- sylated subunit B [12‒14,18].  The subunit  B  of  Elaphe quadrivirgata PLI

γ

,  however,  contains  a  suger  chain  at  residue  12  [19].  

The primary structure of both subunits has  dual  three-finger  motifs  and  is  related  to  the Ly-6 superfamily [20].

Five  proteins  named  PLI-I  to  PLI-V  in  T. flavoviridis serum  have  already  been  identified by affinity chromatography [21].  

PLI-I corresponds to a subunit A of PLI

γ

,  and  the  cDNA  has  already  been  cloned  [21].  PLI-IV and PLI-V are the member of 

α

  type  PLIs,  and  identical  to  PLI-A  and  PLI-B [10], respectively.  The structures of  PLI-II and PLI-III have not yet known.  In  the  present  study,  we  have  isolated  two  PLA

2

 inhibitors, PLI-II and PLI-III, from  _T.

flavoviridis   serum,  and  determined  their  complete amino acid sequences by peptide  sequencing as well as by cDNA cloning of 

PLI-II.  We also discuss the subunit struc- ture of  T. flavoviridis PLI

γ

.

MATERIALS AND METHODS Materials : The blood of  T. flavoviridis in  the  Amami  Oshima  islands  was  collected  by decapitation.  The serum was separated  by  centrifugation  and  stored  at 

−

20

℃

.   Ethanol  precipitation  was  carried  out  as  described  [22].    All  other  reagents  were  purchased from Wako Pure Chem.  (Osaka).

Electrophoresis :  SDS‒PAGE  was  carried  out on 12.5% gels by Laemmli

'

s method [23],  or on 10% polyacrylamide gels as described  by Schagger and von Jagow [24].  Bovine  serum albumin (67,000), ovalbumin (46,000),  carbonic  anhydrase  (30,000),  and  chymo- trypsinogen (24,000) were used as molecu- lar  weight  markers.    Prestained  XL-ladder  marker  kit  (Apro  science)  was  also  used.  

After  running  the  gels  under  a  constant  current, they were stained with 0.1% Coo- massie  brilliant  blue  R-250  and  destained  with 10% acetic acid.

Mass spectrometric analysis :  Mass  spec- trum was measured on a Voyager DE-STR  matrix-assisted  laser  desorption  ionization  time-of-flight  (MALDI‒TOF)  mass  spec- trometer (PerSeptive Biosystems).  Sample  was  dissolved  in  0.1%  trifluoroacetic  acid

‒50%  acetonitrile  containing 

α

-cyano-4- hydroxycinnamic  acid  (10  mg/ml)  as  the  matrix,  and  2-

μ

l  aliquots  were  analyzed.  

Spectrum was calibrated by the molecular  mass of apomyoglobin.

Reverse-phase HPLC :  Preparative  re- verse-phase  HPLC  was  performed  on  a 

μ

Bondashere 5

μ

-C8-300Å column (1.9

×

15  cm,  Waters),  and  the  proteins  were  eluted  with a linear gradient of acetonitrile in 0.1% 

trifluoroacetic acid (TFA) at a flow rate of  5 ml/min.

Protein sequencing :  Protein  was  reduced 

and  _S -pyridylethylated  (PE)  according  to  Friedman  _{et al} .  [25]    The  PE-protein  (500 

μ

g  each)  was  digested  at  37ºC  with  bo- vine trypsin (E/S

＝

1:50) for 24 h in 20 mM  Tris‒HCl  (pH  9.0),  Lys-C  (E/S

＝

1:100)  for  5 h in 2 M urea-20 mM Tris‒HCl (pH 9.0), 

α

-chymotrypsin  (E/S

＝

1:50) for 16 h in 1  M  urea‒50  mM  NH

₄

HCO

₃

,  Asp-N  (E/S

＝

1:100) for 16 h in 50 mM Tris‒HCl (pH 8.0),  V8 protease (E/S

＝

1:30) for 16 h, or cleaved  at room temperature by CNBr (100 equiva- lents) for 21 h in 70% HCOOH.  The digests  were  lyophilized,  dissolved  in  0.1%  TFA,  and  fractionated  by  reverse-phase  HPLC  on a YMC-Pack ODS column in 0.1% TFA  with an appropriate gradient of acetonitrile.  

The amino acid sequences of proteins were  determined  by  an  automatic  protein  se- quencing system PPSQ 21 (Shimadzu).

Analytical gel filtration : A sample was dis- solved in 0.2 M NaCl-50 mM phosphate buf- fer (pH 7.0), and put on a TSKgel G3000SW  column (0.75

×

30 cm, Tosoh).  Elution was  carried  out  by  the  same  buffer  at  a  flow  rate of 1.0 ml/min.  Elution was monitored  at  280  nm  and  the  peak  area  was  deter- mined  by  807-IT  integrator  (Jasco).    Mo- lecular weight was calibrated by the reten- tion times of bovine serum albumin (67,000),  ovalbumin  (46,000),  and  soybean  trypsin  inhibitor (21,500).

Synthesis of partial fragment of PLI cDNA .   Total  RNA  was  extracted  from  0.5  g  of  T. flavoviridis liver  by  acid  guanidinium- phenol-chloroform  (AGPC)  method,  and  reverse  transcribed  to  synthesize  cDNA  first strands using adaptor-linked Oligo(dT)  primer  (5

'

-GGCCACGCGTCGACTAGTAC- (dT)

17

-3

'

).    cDNA  obtained  was  used  as  the template for 3

'

-RACE (rapid amplifica- tion  of  cDNA  ends)  reaction.    Synthetic  oligonucleotide,  _{PLI-II_NS} (5

'

-CCNGGN- GARACNTGYAAYGGNACNATGATG-3

'

)  and  3

'

-Adp  (5

'

-GGCCACGCGTCGACTAG-

TAC-3

'

), were used for PCR amplification.  

PLI-II_NS   primer  was  designed  upon  N-terminal  amino  acid  sequence  of  PLI- II, and 3

'

-Adp corresponded to the adaptor  sequence  within  adaptor-linked  oligo(dT)  primer.    Amplification  product  was  once  subcloned into plasmid vector, and its nu- cleotide sequence was determined.  As the  result,  the  sequence  was  confirmed  to  be  the cDNA partial fragment for PLI-II.  PLI- II  cDNA  fragment  was  radiolabeled  with  [

α

-

³²

P]-dCTP (3000 Ci/mmol) using random  primer DNA labeling kit (Takara Bio) and  used  for  hybridization  screening  of  cDNA  library.

Construction of T. flavoviridis liver cDNA library: T. flavoviridis   liver  cDNA  library  was  constructed  using  Creator  SMART  cDNA Library Construction kit (BD Biosci- ences) according to manufacturers

'

 instruc- tion.    Briefly,  cDNA  first  strand  was  syn- thesized using 1 

μ

g of total RNA, followed  by  five  cycles  of  PCR  for  non-specific  en- richment of full-length cDNAs.  The cDNA  fragments  were  then  ligated  to  pDNR-LIB  vector.    When  the  plasmid  clones  were  used  to  transform  _{E. coli} JM109,  resulting  library  contained  2.0

×

10

⁶

  independent  clones.

Cloning and sequence determination of

cDNA encoding PLI-II :  Clones  (9.6

×

10

⁴

) 

from unamplified cDNA library were plated 

on  LB  agar  plates  and  bacterial  colonies 

were  transferred  onto  Hybond-NX  mem-

branes  (GE  Healthcare  Bio-Science)  and 

fixed  by  UV  irradiation.    The  resulted 

replica  membranes  were  prehybridized  in 

Church

^ʼ

s  hybridization  solution  at  65

℃

 

for  30  min  and  then  hybridized  with  ra-

diolabeled  PLI-II  cDNA  overnight  at  50

℃

 

in  Church

^ʼ

s  hybridization  solution.    Mem-

branes  were  finally  washed  twice  for  15 

min  at  50

℃

  with  1

×

SSC,  0.1%  SDS  and 

hybridization signals were visualized using 

BioImage  Analyzer  (Fuji  Film).    Accord- ingly,  14  bacterial  colonies  were  isolated,  cultured  and  their  plasmids  were  purified  by  standard  Alkali-SDS  method.    Nucleo- tide  sequences  of  cDNA  inserts  were  de- termined  using  ABI  PRISM  377  DNA  Se- quencing System (Applied Biosystems).

RESULTS

Purification of phospholipase A

2

inhibitors :  Ethanol  fraction  E

2.0

  of  the  T. flavoviridis   serum  was  prepared  as  described  previ- ously  [22],  and  subjected  to  reverse-phase  HPLC using a C8 column.  Among several  peaks observed in Fig. 1A, five peaks (I

−

V)  contained  the  PLI-related  proteins  as  ana- lyzed  by  SDS-PAGE  and  the  N-terminal  sequencing.    Since  the  protein  in  peak  III  was not homogeneous on SDS-PAGE (Fig. 

1B),  it  was  further  purified  by  gel  filtra- tion  using  a  Sephacryl  S-200HR  column  (data  not  shown).    From  the  N-terminal  sequence analysis, peaks I, IV, and V were  assigned to be PLI-I [21], PLI-A, and PLI-B  [10], respectively.  We assumed that peaks  II and III corresponded to PLI-II and PLI-III  because of their molecular mass as well as  the relative retention time on reverse-phase  HPLC [21].  The apparent molecular mass- es of the purified PLI-I, PLI-II, and PLI-III  were  estimated  to  be  24,  24,  and  25  kDa  by SDS-PAGE, respectively (Fig. 1C).  The  exact  masses  were  determined  by  MALDI

‒TOF  mass  spectrometry  to  be  22,653.9,  22,339.0, and 22,491.0 for PLI-I, PLI-II, and  PLI-III, respectively.

Sequence analysis of PLI-II and PLI-III :  The  N-terminal  sequences  of  _S -pyridyl- ethylated  PLI-II  and  PLI-III  were  directly  determined and shown in Fig. 2. Both pro- teins had a common sequence of XXCXXC,  where  X  is  any  amino  acid  residue  other  than Cys.  This agreed with the structural 

feature  of  N-terminals  in  all  the  PLI

γ

s.  

The complete amino acid sequences of two  inhibitors were determined on the basis of  the results of sequence analysis of peptide  fragments generated by several enzymatic  and chemical digestions.  The sequence of  PLI-II  consisting  of  181  amino  acids  was  determined  by  the  combination  of  BrCN- cleavage and tryptic digestion (Fig. 2A).  A  residue 14 could not be determined by Ed- man degradation, suggesting that it might  be the Asn residue having a carbohydrate  chain.

The  entire  primary  structure  of  PLI-III 

Fig. 1.   (A)  Purification  of  PLA2  inhibi-

tors  by  reverse-phase  HPLC  on  a  μBondashere 

5

μ-C

8

-

300

Å column (

1

.

9

×

15

  cm).  (B)  SDS-PAGE  analysis  of  proteins in peak I‒V in Fig. 

1

A. 

12

.

5

%  gel was used. M, marker proteins. (C)  SDS-PAGE  analysis  of  purified  pro- teins on a 

10

% gel. M, prestained XL- ladder  marker; I,  PLI-I; II,  PLI-II; III,  PLI-III.

was  also  determined  similarly  by  several  enzymatic digestions using Lys-C, chymo- trypsin, and V8 protease.  The arrangement  of  the  fragments  and  the  complete  amino  acid  sequence  are  summarized  in  Fig.  2B. 

PLI-III  was  a  very  similar  protein  to  PLI- II having 181 residues.  It may also have a  sugar chain at residue 14.

Cloning of cDNA encoding PLI-II: T. fla- voviridis  liver cDNA was synthesized using  an adaptor-linked oligo(dT) primer.  Partial  cDNA fragment for PLI-II was then ampli- fied by PCR using the oligonucleotide  _PLI- IIa_NS  that was originally designed based  on N-terminal amino acid sequence of PLI- II (Fig. 2).  As a result, a DNA fragment of  the expected size (approx. 0.7 kb) was ob- tained.  The nucleotide sequence was con- firmed to be the partial fragment of cDNA  in  accord  with  the  amino  acid  sequences  of PLI-II.  The cDNA library was screened  with PLI-II DNA fragment as a probe.  Six  positive clones were obtained from 9.6

×

10

⁴

 

plaques by washing in high stringency (0.2

×

SSC containing 0.1% SDS at 65

℃

).  Fig. 

3  shows  the  nucleotide  sequence  of  full- length cDNA for PLI-II.  It consisted of 920  bp,  including  a  118-bp  5

^ʼ

-untranslated  re- gion (UTR), 603-bp open reading frame en- coding 200 amino acids including a poten- tial  signal  peptide  of  19  amino  acids,  and  202-bp 3

^ʼ

-UTR.  The nucleotide sequence in  the mature protein-coding region of PLI-II  showed 53.9% identity to PLI-I [21].  Amino  acid sequence deduced from the nucleotide  sequence of PLI-II cDNA was agreed well  to the protein sequence as cited in Fig. 2.

Comparison of amino acid sequences of PLIs : The amino acid sequences of  _{T. fla-} voviridis  PLI-II and PLI-III were compared  with those of several subunit proteins that  constitute  PLI

γ

s  from  the  Elapidae,  Hy- drophidae, Boidae, and Colubridae families  (Fig.  4).    Sequences  of  subunits  A  and  B  are  separately  shown  and  the  conserved  residues are also marked separately.  Nev-

Fig. 2.   Sequence determination of T. flavoviridis phospholipase A2 inhibitors. Sugar-attached Asn  residues are marked by closed circles. Sequences determined directly from the intact pro- teins are underlined.

ertheless,  most  of  the  Cys  residues  are  located at the same positions in both sub- units except Cys

¹⁰⁵

 and Cys

¹¹³

 of subunit B.  

The  T. flavoviridis   PLI-I  has  the  common  features of PLI

γ

-subunit A: the presence of  highly conserved 16 cysteine residues and  N-linked  carbohydrate  site  at  Asn

¹⁵⁷

  (the  position 158 in the sequence (1) in Fig. 4A).  

It  showed  the  highest  similarity  to  _Agkis- trodon blomhoffii siniticus   PLI

γ

-subunit  A  (87% identity; the sequence (2) in Fig. 4A)  [26].

On  the  other  hand,  the  T. flavoviridis   PLI-II and PLI-III were highly homologous  (more than 53% identities) to other subunits 

B of PLI

γ

s (Fig. 4B).  In addition, all the  cysteine residues were invariable.  A sugar  chain is attached at residues 14 of  _{T. flavo-} viridis  PLI

γ

-B (PLI-II and PLI-III) as well  as at residue 12 of  E. quadrivirgata  PLI

γ

-B  [19].    Although  G. blomhoff ii siniticus PLI

γ

-B  has  a  putative  glycosylation  site  at residue 14, the protein was not glycosyl- ated  [17].    Other  proteins  have  no  sugar  chain.

Oligomer formation of PLIs : Analytical gel  filtration using a TSKgel G3000SW column  showed that PLI-I, PLI-II, and PLI-III were  eluted at 9.07, 8.84, and 9.13 min which cor- responded  to  the  molecular  masses  of  25, 

Fig. 3.  Nucleotide sequence of PLI-II. Deduced amino acid sequence is cited below the nucleotide  sequence. Start and stop codons are boxed. Polyadenylation signal is underlined.

Fig. 4.   Comparison  of  the  amino  acid  sequences  of γ-type  phospholipase  A2  inhibitors.  (A)  Sub- units A, (1) [accession No. BAA24503] T. flavoviridis PLI-I (subunit A), (2) [BAA86970] Gloy- dius blomhoffii siniticus subunit  A,  (3)  [AAF23778] Notechis ater ^α-subunit 1,  (4)  [AAF23779]  Notechis ater ^α-subunit 2, (5) [AAF23780] Notechis ater ^α-subunit 3, (6) [CAB56616] Notechis scutatus α-subunit ii, (7) [CAB56617] Notechis scutatus α-subunit iii, (8) [AAF23781] Oxyura- nus scutellatus α-subunit 1, (9) [AAF23782] Oxyuranus scutellatus α-subunit 2, (10) [AAF23783]  Pseudonaja textilis α-subunit,  (11)  [AAF23785] Oxyuranus microlepidotus α-subunit 2,  (12)  [BAA83078] Elaphe quadrivirgata  subunit  A,  (13)  [AAB32582] Naja kaouthia 31  kDa  sub- unit,  (14)  [AAA19162] Crotalus durissus terrificus  CNF,  (15)  [AAR04437] Lachesis muta muta  α-subunit 1,  and  (16)  [AAR04438] Lachesis muta muta α-subunit 2.  (B)  Subunits  B,  (17) T.

flavoviridis  subunit  B1  (PLI-II),  (18) T. flavoviridis  subunit  B2  (PLI-III),  (19)  [BAA86971]  Gloydius blomhoffii siniticus  subunit  B,  (20)  [AAF21051] Pseudonaja textilis β-subunit 2,  (21)  [AAF21050] Pseudonaja textilis β-subunit 1,  (22)  [AAF21047] Oxyuranus scutellatus  subunit  B, (23) [AAF21046] Notechis ater subunit B, (24) [BAA83079] Elaphe quadrivirgata subunit B,  (25) [AAB32583] Naja kaouthia 25 kDa subunit. Cysteine residues are indicated in white-on- black type. Conserved residues in each of subunit A and B are marked by asterisks. Carbo- hydrate-attatched Asn residues are underlined.

30, and 24 kDa, respectively, and also gave  an  additional  peak  corresponding  to  the  molecular  mass  of  100,  56,  or  50  kDa,  re- spectively (data not shown).  These results  indicate  that  PLI-I  is  likely  to  exist  as  an  oligomer,  and  PLI-II  and  PLI-III  prefer  to  form the homodimers.

When  T. flavoviridis  serum was analyzed  by gel filtration under the same conditions,  four protein peaks were eluted at 5.00, 6.64,  7.54,  and  11.68  min  (Fig.  5A).    The  last  peak  contained  no  protein.    To  examine  the presence of PLIs in these peaks on gel  filtration,  effluents  from  the  column  were  divided  into  five  fractions  (F1  to  F5)  as  shown  in  Fig.  5A,  and  the  fractions  were  subjected directly to an analytical reverse- phase  HPLC.    As  shown  in  Fig.  5B,  no  monomeric  PLI  was  found  in  fraction  F5.  

Most of the PLIs were detected in fractions  F3,  and  a  small  amount  in  F2  and  F4  as  well.    The  major  components  of  _{T. flavo-} viridis  serum proteins in these fractions are  summarized in Table 1.  The apparent mo- lecular-mass range of F3 was a range from  65 to 130 kDa.  This result clearly indicates  that all of the PLIs are not monomeric but  exist  in  the  high-molecular-mass  form  in  the serum as previously reported [9].

DISCUSSION

Two groups of PLIs have been identified  in  the  serum  of  T. flavoviridis ,  PLI

α

  and  PLI

γ

 [21].  PLI

γ

 have the two repeats of  a  unit  termed  the  three-finger  motif  [20],  which  has  also  been  found  in  urokinase- type  plasminogen  activator  receptor  [27],  Ly-6 [28], CD59 [29] and neurotoxins [30].  

In the present study, we have purified five  proteins (PLI-I to PLI-V) from the serum of  T. flavoviridis .  Though the fraction III con- tained two proteins (Fig. 1B), a pure PLI-III  was obtained after a contaminating 47-kDa 

protein was removed by gel filtration.  This  47-kDa protein was identified to be a novel  HSF-like protein (unpublished data).  Ana- lytical gel filtration showed that the resul- tant each of PLI-I, PLI-II, and PLI-III gave  an  additional  peak  in  the  molecular  mass  range from 50 to 100 kDa being attributable  to its dimer or oligomer.

Sequence  analysis  showed  that  PLI- IV  and  PLI-V  corresponded  to  PLI-A  and  PLI-B [10], respectively, and are known to 

Fig. 5.   Analysis  of  molecular  sizes  of  PLIs. 

(A) Analytical gel filtration of T. fla- voviridis serum on a TSKgel G

3000

SW  column (

0

.

75

×

30

 cm) in 

0

.

2

 M NaCl‒

50

 mM phosphate buffer (pH 

7

.

0

). (B)  Reverse-phase  HPLC  of  gel  filtration  fractions  on  a  SepaxBio-C

8

  column  (

0

.

46

×

25

 cm). Arrows show the reten- tion times of several PLIs.

be the subunits of 

α

-type PLIs.  Other pro- teins, PLI-I to PLI-III, were assigned to the  subunits of PLI

γ

.  According to Nobuhisa  et al.  [21], PLI-I is a major component of in- hibitory  proteins  against  three  basic  PLA

2

  isozymes  in  T. flavoviridis   venom,  that  is,  a basic PLA-B, BPI and BPII [7,8].  PLI

α

  is known to bind mainly to PLA2 (a major  [Asp

⁴⁹

] PLA

2

 in the venom) [6].  Although  PLI-II  and  PLI-III  are  thought  to  be  the  components  of  hetrooligomeric  PLI

γ

  [21],  their  structures  were  not  yet  elucidated.  

Therefore, we have determined their com- plete  amino  acid  sequences  by  peptide  analysis as well as the cDNA cloning.

As  the  results,  PLI-II  and  PLI-III  have  been proved to be the isoforms of  _{T. flavo-} viridis  PLI

γ

-B since they showed a high  homology  to  the  subunits  B  from  several  other  snakes.    However,  we  have  no  evi- dence that PLI-I and PLI-II/III can associate  to form a high molecular-mass heterooligo- mer in the blood plasma of  T. flavoviridis .   Moreover, as far as we know, the organiza- tion  of  T. flavoviridis   PLI

γ

  has  not  been  reported.  Though the molar ratio of 25- to  20-kDa  subunits  was  reported  to  approxi- mately  2  in  A. blomhoffii siniticus   PLI

γ

  [17],  the  contents  of  two  subunits  in  the  T. flavoviridis   serum  are  greatly  different  and  seem  unexplainable  by  the  formation  of  2:1  heterooligomer.    Considering  that 

three subunits of  T. flavoviridis  PLI

γ

 were  detected in a wide range of the serum frac- tions (F2‒F4 in Fig. 5) on the analytical gel  filtration, most of PLI

γ

 may be composed  of PLI-I alone and a part of PLI-I may exist  as the heterooligomer with the subunits B.

When  various  amounts  of  the  purified  PLI-II  or  PLI-III  were  mixed  with  a  fixed  amount  of  PLI-I  and  the  mixtures  were  then  analyzed  by  the  analytical  gel  filtra- tion,  any  new  peak  corresponding  to  the  complex  could  not  be  observed  (data  not  shown).    Because  our  PLIs  were  purified  by  reverse-phase  HPLC  under  the  acidic  conditions,  they  could  be  significantly  damaged.  When PLI-I was purified under  the mild conditions, it gave a single peak  at approximately 120 kDa and no peak of  25 kDa was detected (data not shown).

Some snakes have the isoforms of either  subunit A (

α

-chain), B 

（β

-chain), or both  (Fig.  4).    For  example,  Oxyuranus scutel- latus, Notechis ater ,  and  N. scutatus   have  several  isoforms  of  subunit  A,  and  _{O. mi-} crolepidotus, Pseudonaja textilis ,  and  _{T. fla-} voviridis  possess the isoforms of subunit B  [32].  The isoforms are found for both sub- units  of  O. microlepidotus   PLI

γ

  (Sekuloski  et al.,   unpublished  data).    This  enables  to  expand  the  repertoires  of  the  specificity  by the combination of many isoforms, and  seems  to  the  results  of  diversification  of 

Table 1. Characterization of fractions of T. flavoviridis serum on an analytical gel filtration.

Fraction Molecular size

(kDa)^a) Components^b)

F

1

>

500

High molecular mass proteins F

2 130

‒

340

Globulins

F

3 65

‒

130

Serum albumin, PLI-I, PLI-II, PLI-III, PLI-A, PLI-B, HSF

F

4 30

‒

65

serotriflin, SSP-

1

 to SSP-

5

F

5 18

‒

30

Low molecular mass compounds

a)  The column was calibrated by thyroglobin (

669

 kDa), apoferritin (

443

 kDa), β-amylase (

200

 kDa),  bovine serum albumin (

67

 kDa), ovalbumin (

46

 kDa), soybean Kunitz trypsin inhibitor (

20

.

5

 kDa),  and SSP-

1

 (

1

.

0

 kDa).

b)  HSF, habu serum factor [

22

]: SSP, small serum protein.

PLI

γ

 genes to adapt the rapid evolution of  the target enzyme, PLA

₂

 [33].

Recently,  the  nucleotide  sequence  of  the  cDNA  encoding  T. flavoviridis   PLI- II  was  uploaded  by  So  _{et al.}     [34]  on  the  DDBJ  sequence  data  bank:  accession  No.  

BAF75726.  Three nucleotide was different  from  our  sequence:  A

³²³

TGCCT

³²⁸

  instead  of our sequence A

³²³

CGTCT

³²⁸

.  This results  in  the  change  of  the  primary  structure  of  PLI-II from Thr

⁵⁰

-Ser

⁵¹

 to Met

⁵⁰

-Pro

⁵¹

.  These  nucleotide substitution may reflect the in- traspecies  diversification,  or  represent  the  similar gene on a different allele.

REFERENCES

[１] E .   A .   D e n n i s ,  J. Biol. Chem. ,  269, 

13057

-

13060

 (

1994

).

[２]D. L. Scott and P. B. Sigler, in :^“Advances  in Protein Chemistry^”, 45, 

53

-

88

 (

1994

).

[３]G.  A.  Boffa,  M.  C.  Boffa,  and  J.  J. 

Winchenne, Biochim. Biophys. Acta, 429, 

828

‒

838

 (

1976

).

[４] J. E. Fletcher, B.E. Rapuano, E. Condrea,  C.  C.  Yang,  and  P.  Rosenberg,  Toxicol. 

Appl. Pharmaco

l

., 59, 

375

-

388

 (

1981

).

[５]H.  Kihara,  R.  Uchikawa,  S.  Hattori,  and  M. Ohno, Biochem. Int., 28, 

895

-

903

 (

1992

).

[６]S.  Tanaka,  N.  Mohri,  H.  Kihara,  and  M. 

Ohno, J. Biochem., 99, 

281

-

289

 (

1986

).

[７] S.  -Y.  Liu,  K.,  Yoshizumi,  N.  Oda,  M. 

Ohno, F. Tokunaga, S. Iwanaga, and H. 

Kihara, J. Biochem., 107, 

400

-

408

 (

1990

).

[８]K.  Yoshizumi,  S.  -Y.  Liu,  T.  Miyata,  S. 

Saita,  M.  Ohno,  S.  Iwanaga,  and  H.  Ki- hara, Toxicon, 28, 

43

-

54

 (

1990

).

[９]R.  D.  Dunn  and  K.  W.  Broady, Biochim.

Biophys. Acta, 1533, 

29

-

37

 (

2001

).

[

10

] S. Inoue, H. Kogaki, K. Ikeda, Y. Same- jima, and T. Omori-Satoh, J. Biol. Chem.,  266, 

1001

-

1007

 (

1991

).

[

11

]S.  Lizano,  B.  Lomonte,  J.  W.  Fox,  and  J.  M.  Gutierrez, Biochem. J., 326, 

853

-

859

  (

1997

).

[

12

] N.  Ohkura,  S.  Inoue,  K.  Ikeda,  and  K. 

Hayashi, J. Biochem., 113, 

413

-

419

 (

1993

).

[

13

]N.  Ohkura,  S.  Inoue,  K.  Ikeda,  and  K. 

Hayashi, Biochem. Biophys. Res. Common.,  200, 

784

-

788

 (

1994

).

[

14

]J.  Perales,  C.  Villela,  G.  B.  Domont,  V. 

Choumet,  B.  Saliou,  H.  Moussatche,  C. 

Bon, and G. Faure, Eur. J. Biochem., 227, 

19

-

26

 (

1995

).

[

15

] S.  Inoue,  A.  Shimada,  N.  Ohkura,  K. 

Ikeda, Y. Samejima, T. Omori-Satoh, and  K.  Hayashi, Biochem. Mol. Biol. Int., 41, 

529

-

537

 (

1997

).

[

16

]H. Kogaki, S. Inoue, K. Ikeda, Y. Same- jima, T. Omori-Satoh, and K. Hayashi, J.

Biochem., 106, 

966

-

971

 (

1991

).

[

17

] N.  Ohkura,  H.  Okuhara,  S.  Inoue,  K. 

Ikeda,  and  K.  Hayashi, Biochem. J., 325, 

527

-

531

 (

1997

).

[

18

]C. L. Fortes-Dial, Y. Lin, J. Ewell, C. R. 

Diniz, and T. -Y. Liu, J. Biol. Chem., 269, 

15646

-

15651

 (

1994

).

[

19

] K.  Okumura,  K.  Masui,  S.  Inoue,  K. 

Ikeda,  and  K.  Hayashi, Biochem. J., 341, 

165

-

171

 (

1999

).

[

20

]N.  Ohkura,  S.  Inoue,  K.  Ikeda,  and  K. 

Hayashi, Biochem. Biophys. Res. Commun.,  204, 

1212

-

1218

 (

1994

).

[

21

]I.  Nobuhisa,  S.  Inamasu,  M.  Nakai,  A. 

Tatsui,  T.  Mimori,  T.  Ogawa,  Y.  Shi- mohigashi,  Y.  Fukumaki,  S.  Hattori,  H. 

Kihara,  M.  Ohno, Eur. J. Biochem., 249, 

838

-

845

 (

1997

).

[

22

]M. Deshimaru, C. Tanaka, A. Tokunaga,  M.  Goto,  and  S.  Terada, Fukuoka Univ.

Sci. Rep., 33, 

45

-

53

 (

2003

).

[

23

] U.  K.  Laemmli, Nature, 227, 

680

-

685

  (

1970

).

[

24

] H.  Schagger,  G.  von  Jagow, Anal. Bio- chem., 166, 

368

-

379

 (

1987

).

[

25

]M. Friedman, L. H. Krull, J. F. Cavins, J.

Biol. Chem., 245 

3868

-

3871

 (

1970

).

[

26

]K.  Okumura,  S.  Inoue,  N.  Ohkura,  K. 

Ikeda, and K. Hayashi, IUBMB Life, 48, 

99

-

104

 (

1999

).

[

27

] Y.  Wang,  J.  Dang,  L.  K.  Johnson,  J.  J. 

Selhamer, and W. F. Doe, Eur. J. Biochem.,  227, 

116

-

122

 (

1995

).

[

28

]T.  J.  Fleming,  C.  O'hUigin,  and  T.  R. 

Malek, J. Immunol., 150, 

5379

-

5390

 (

1993

).

[

29

]J. G. Petranka, D.E. Fleenor, K. Sykes, R. 

E. Kaufman, and W. F. Rosse, Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A., 89, 

7876

-

7879

 (

1992

).

[

30

] N.  Fuse,  T.  Tsuchiya,  Y.  Nonomura,  A. 

Menez,  and  T.  Tamiya, Eur. J. Biochem.,  193, 

629

-

633

 (

1990

).

[

32

]P.  G.  Hains,  B.  Nield,  S.  Sekuloski,  R. 

Dunn,  and  K.  Broady, J. Mol. Biol., 312, 

875

-

884

 (

2001

).

[

33

] K. Nakashima, I. Nobuhisa, M. Deshima- ru, M. Nakai, T. Ogawa, Y. Shimohigashi,  Y.  Fukumaki,  M.  Hattori,  Y.  Sakaki,  S. 

Hattori,  and  M.  Ohno, Proc. Natl. Acad.

Sci. U.S.A., 92, 

5605

-

5609

 (

1995

).

[

34

]S.  So,  T.  Chijiwa,  I.  Nobuhisa,  N.  Oda- Ueda,  S.  Hattori,  and  M.  Ohno,  DDBJ/

EMBL/GenBank  database,  http://www.

ddbj.nig.ac.jp