虚血再灌流障害に対する分子状水素の保護作用

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(1)● シンポジウム 3 脳梗塞病態と新治療開発. 虚血再灌流障害に対する分子状水素の保護作用野田百美1, 2. 要旨脳白質のモデルとして使われているマウス視神経を用い，飲用水中の分子状水素（H2）が虚血による視神経機能障害を改善させるかどうかを検討した．視神経機能の測定には，摘出後，複合活動電位（CAP）の面積を測定した．灌流チャンバーを脱酸素・脱グルコース（OGD）にすると，CAP は速やかに消失し，再灌流後は 25％程度しか回復しない．ところが，10∼14 日間，H2 水を飲用したマウスの視神経では，CAP が完全に消失することはなく，再灌流後の回復も顕著に改善された．虚血・再灌流後の視神経線維の脱落は，H2 水飲用群で有意に減少しており，グリア細胞（とくにオリゴデンドロサイト）の核 8-オキソグアニン（nu8-oxoG：酸化 DNA 障害のマーカー）の蓄積は，H2 水飲用群において，有意に抑制されていた．これらの結果は，有髄神経が占める白質の保護に H2 水飲用が有効であることを示唆しており，酸化ストレス耐性と治療の有用性が期待される．（脳循環代謝 26：77∼81，2015）. キーワード : 分子状水素，脳白質，視神経，脱酸素・脱グルコース，8-オキソグアニン. ものの5, 16~19），単なる抗酸化作用あるいはフリーラジ. 1．はじめに. カルスカベンジャーとしての作用では説明できない作用も次々と報告されている．たとえば，シグナル伝達. 2007 年に大澤らが，細胞レベルで分子状水素（水素. 制御作用15, 20）としての作用などがある．また，PD 疾. ガス，H2）が活性酸素種（ROS）のうち，最も毒性の高. 患モデル動物で H2 吸入よりも H2 水摂取の方が効果が. いヒドロキシラジカルのみを特異的に減少させるこ. 顕著であり，腸内 H2 産生を亢進させるラクツロース. と，またラット脳の虚血・再灌流障害巣が，2％H2 吸. 投与では効果がなかったこと21）をヒントに，胃からの. 入により，顕著に縮小すること1）を示した．以来，. グレリン放出を介する作用22）などが報告されている．. パーキンソン病（PD）を含む多くの酸化ストレス関. 本研究では，H2 がラジカルスカベンジャーとして. 2, 3）. 連障害および疾患に H2 吸入あるいは H2 含有飲用水. ではなく，長期的な H2 水摂取により，臨床上，問題. （H2 水）が保護的・予防的に効くことが示されてい. となっている虚血・再灌流後の脳白質の障害に対して. る4~6）．また，様々な臨床応用も始まり，中枢神経系関. 保護効果をもつかどうかを検討した．. 連疾患では，PD や脳幹梗塞，末梢では 2 型糖尿 7）. 8）. 2．実験方法. 病9），リュウマチ10, 11），ミオパチー12），スポーツ選手の筋疲労13），放射線治療の副作用14）など，種々の疾患・障害で有意な効果が報告されている6, 15）．しかし，そ. 実験動物：雄の Swiss Webster マウス（4∼8 週齢）を. の作用機序として，主に抗酸化作用と考えられてきた. 使用した． CAP 測定：視神経を摘出し，CAP を測定する. 1. 方法，また，OGD の方法は，以前の論文に準じて. 2. 行った23, 24）．. 九州大学大学院薬学研究院病態生理学分野九州大学ヌクレオチドプール研究センター〒 812-8582 福岡市東区馬出 3-1-1，コラボステーション I，8F TEL: 092-642-6574 FAX: 092-642-6574 E-mail: noda@phar.kyushu-u.ac.jp. H2 水：水道水で満たしたガラス給水ビンを逆にし，給水口からポリエチレンチューブを介して H2 ボンベより H2 をバブリングし，一定量の水が減り，ビ. ─ 77 ─.

(2) 図1. 脳循環代謝第 26 巻第 2 号. 図 1．複合活動電位面積消失に対する H2 水飲用の保護効果 A：視神経の複合活動電位（CAP）は，脱酸素・脱グルコース（OGD）にすると速やかに消失し，再灌流後は 20％程度回復するにとどまる（水道水）．ところが，10∼14 週間，H2 水を飲用したマウスから摘出した視神経では，OGD 後でも CAP は消失せず，回復も顕著によかった． B：再灌流後，1 時間後の CAP 面積の割合．H2 水群で有意に回復した．＊＊ <P: 0.01. ンの上部が H2 で満たされた状態で飽和 H2 水に近い濃. とがわかった（図 2 下段）．コントロール群（無 OGD）. 度（1.2 ppm）になることを H2 計で確認した．H2 水は. では，H2 水飲用の影響は見られなかった．. 10∼14 日間，毎日交換した．. 虚血・再灌流障害の要因は酸化ストレスであること. 免疫染色：SMI-31 を用いた視神経線維の染色25）およ. が示唆されているため，酸化ストレス障害のマーカー. び nu8-oxoG の染色は．それぞれ以前の方法に倣った． 3）. の一つである nu8-oxoG （核の酸化 DNA）の蓄積を観察した．神経線維染色と同様，OGD 後，5 時間灌流した. 3．結果と考察. 視神経で，nu8-oxoG の蓄積を免疫染色で解析したところ，水道水飲用群では，nu8-oxoG 蓄積は有意に増. 水道水を飲用したマウスの摘出視神経から CAP を. 加したが，H2 水飲用群ではほとんど nu8-oxoG 蓄積は. 測定し，60 分間の定常状態後に，灌流液を OGD にす. 見られなかった（図 3）．視神経には神経細胞はなく，. ると，CAP は速やかに消失した．60 分後，酸素・グ. グリア細胞（オリゴデンドロサイト，アストロサイ. ルコース入りの液にて再灌流を行うと，わずかに回復. ト，ミクログリア）が存在する．nu8-oxoG 蓄積が見ら. した．一方，H2 水を飲用したマウスから摘出した視. れた細胞は，形態から主にオリゴデンドロサイトであ. 神経の CAP は，OGD にしても完全に消失することは. ることが示唆された．. なく，再灌流後の CAP も明らかに回復がよかった（図. 以上の結果は，10∼14 日間の H2 水飲用は，虚血プ. 1A）．再灌流後，1 時間経った時点での CAP 面積の割. レコンディショニングと似たような現象を起こし，虚. 合を計測すると，水道水飲用群では約 25％程度に回復. 血・再灌流障害を軽減させ，神経軸索を保護するこ. するにとどまったのに対し，H2 水飲用群では，55％. と，あるいは虚血・再灌流による酸化ストレスに対し. 程度にまで回復が見られた（図 1B）．. て耐性を獲得させることを示唆している．nu8-oxoG. OGD 後，5 時間灌流した後にパラフォルムアルデヒ. 蓄積は主にオリゴデンドロサイトで起こり（図未掲. ドで固定し，視神経の神経線維（軸索）を SMI-31 で免. 載），それが H2 水飲用によって抑制されることから，. 疫染色を行った．コントロール群（無 OGD）と比較検. 神経軸索保護における H2 水飲用とグリア細胞の関係. 討すると，水道水飲用群では OGD で神経線維の顕著. が強く示唆される．一方，PD モデルで H2 水飲用によ. な脱落が見られたのに対し，H2 水飲用群では，脱落. る胃からのグレリン放出が報告されており26），H2 水飲. が抑制されていた（図 2 上段）．SMI-31 の蛍光強度を. 用の効果にグレリン受容体が必要であることから，視. 測定すると，OGD 後では，水道水飲用群では MI-31. 神経においても，グレリン受容体が関与するかどうか. の蛍光強度が有意に減るのに対し，H2 水飲用群で. を検討する必要がある．今後，H2 水飲用の作用機序. は，SMI-31 蛍光強度はほとんど減らず，水道水飲用. 解明とともに，ヒトにおける効果の検討が必要であろ. 群と比較すると，有意に神経線維が保護されているこ. う．それによって，脳白質の虚血・再灌流障害に対す. ─ 78 ─.

(3) 図2. 虚血再灌流障害に対する分子状水素の保護作用. 図 2．OGD による視神経線維（軸索）の脱落に対する H2 水飲用の保護効果 Control 群（無 OGD）と OGD 群（再灌流後，5 時間）の視神経線維（軸索）を SMI-31 で免疫染色した画像（上段）と，SMI-31 蛍光強度の比較（下段）．図3. 血・再灌流障害の保護効果を検討した．10∼14 日間の H2 水飲用は，摘出したマウス視神経を虚血・再灌流に晒した際に観察される CAP の減少および視神経軸索の脱落を有意に軽減させ，酸化ストレスマーカーである nu8-oxoG の蓄積を防いだ．すなわち，H2 水飲用は脳白質の虚血・再灌流障害を保護・軽減する効果があると示唆された．今後，その作用機序を明らかにすると共に，ヒトにおける効果の検証が待たれる．謝辞：藤田慶大博士（現・東京医科歯科大），山藤芽実さん（修士卒業生），中別府雄作教授（九州大学），ブルースランソム教授（ワシントン大学・シアトル）のご協力に感謝いたします．図 3．OGD 後の核内 8-オキソグアニン（nu8-oxoG）の蓄積に対する H2 水飲用の抑制効果 Control 群（無 OGD）と OGD 群（再灌流後，5 時間）の視神経における nu8-oxoG の蓄積を，抗 nu8-oxoG 抗体で免疫染色を行い，2 次抗体の蛍光強度を指標に比較検討したもの．水道水飲用群では，nu8-oxoG 蓄積が有意に増加したが，H2 水飲用群では nu8-oxoG 蓄積がほとんど抑制されていた．. 文献 1） Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, Watanabe M, Nishimaki K, Yamagata K, Katsura K, Katayama Y, Asoh S, Ohta S: Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals. Nat Med 13: 688–694, 2007 2） Fu Y, Ito M, Fujita Y, Ito M, Ichihara M, Masuda A,. る新たな予防・治療法が立証されることが期待される．. Suzuki Y, Maesawa S, Kajita Y, Hirayama M, Ohsawa I, Ohta S, Ohno K: Molecular hydrogen is protective against 6-hydroxydopamine-induced nigrostriatal degeneration in a rat model of Parkinson's disease. Neurosci Lett 453:. 4．まとめ. 81–85, 2009 3） Fujita K, Seike T, Yutsudo N, Ohno M, Yamada H, Yama-. マウス視神経を用い，H2 水飲用による脳白質の虚 ─ 79 ─. guchi H, Sakumi K, Yamakawa Y, Kido MA, Takaki A,.

(4) 脳循環代謝第 26 巻第 2 号. Katafuchi T, Tanaka Y, Nakabeppu Y, Noda M: Hydrogen. Toyoda Y, Nakao A: Effects of drinking hydrogen-rich. in drinking water reduces dopaminergic neuronal loss in. water on the quality of life of patients treated with radio-. the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. PLoS ONE 4: e7247, 2009. therapy for liver tumors. Med Gas Res 1: 11, 2011 15） Noda M, Fujita K, Ohsawa I, Ito M, Ohno K: Multiple. 4） Huang CS, Kawamura T, Toyoda Y, Nakao A: Recent. effects of molecular hydrogen and its distinct mechanism.. advances in hydrogen research as a therapeutic medical gas. Free Radic Res 44: 971–982, 2010. J Neurol Disord 2: 1000189, 2014 16） Fujita K, Yamafuji M, Nakabeppu Y, Noda M: Therapeu-. 5） Ohta S: Molecular hydrogen as a preventive and therapeu-. tic approach to neurodegenerative diseases by medical. tic medical gas: initiation, development and potential of. gases: focusing on redox signaling and related antioxidant. hydrogen medicine. Pharmacol Ther 114: 1–11, 2014. enzymes. Oxid Med Cell Longev 2012: 324256, 2012. 6） Ohta S: Molecular hydrogen as a novel antioxidant: over-. 17） Dixon BJ, Tang J, Zhang JH: The evolution of molecular. view of the advantages of hydrogen for medical applica-. hydrogen: a noteworthy potential therapy with clinical sig-. tions. Meth Enzymol 555: 289–317, 2015. niﬁcance. Med Gas Res 3: 10, 2013. 7） Yoritaka A, Takanashi M, Hirayama M, Nakahara T, Ohta. 18） Ohno K, Ito M, Ichihara M: Molecular hydrogen as an. S, Hattori N: Pilot study of H2 therapy in Parkinson's dis-. emerging therapeutic medical gas for neurodegenerative. ease: a randomized double-blind placebo-controlled trial.. and other diseases. Oxid Med Cell Longev 2012: 353152,. Mov Disord 28: 836–839, 2013. 2012. 8） Ono H, Nishijima Y, Adachi N, Tachibana S, Chitoku S,. 19） Yokota T, Kamimura N, Igarashi T, Takahashi H, Ohta S,. Mukaihara S, Sakamoto M, Kudo Y, Nakazawa J, Kaneko. Oharazawa H: Protective effect of molecular hydrogen. K, Nawashiro H: Improved brain MRI indices in the acute. against oxidative stress caused by peroxynitrite derived. brain stem infarct sites treated with hydroxyl radical scav-. from nitric oxide in rat retina. Clin Experiment Ophthal-. engers, Edaravone and hydrogen, as compared to Edaravone alone. A non-controlled study. Med Gas Res 1: 12,. mol, doi: 10.1111/ceo.12525. [Epub ahead of print] 2015 20） Itoh T, Fujita Y, Ito M, Masuda A, Ohno K, Ichihara M,. 2011. Kojima T, Nozawa Y, Ito M: Molecular hydrogen sup-. 9） Kajiyama S, Hasegawa G, Asano M, Hosoda H, Fukui M,. presses FcepsilonRI-mediated signal transduction and pre-. Nakamura N, Kitawaki J, Imai S, Nakano K, Ohta M,. vents degranulation of mast cells. Biochem Biophys Res. Adachi T, Obayashi H, Yoshikawa T: Supplementation of. Commun 389: 651–656, 2009. hydrogen-rich water improves lipid and glucose metabo-. 21） Ito M, Hirayama M, Yamai K, Goto S, Ito M, Ichihara M,. lism in patients with type 2 diabetes or impaired glucose. Ohno K: Drinking hydrogen water and intermittent hydro-. tolerance. Nutr Res 28: 137–143, 2008. gen gas exposure, but not lactulose or continuous hydro-. 10） Ishibashi T: Molecular hydrogen: new antioxidant and. gen gas exposure, prevent 6-hydorxydopamine-induced. anti-inflammatory therapy for rheumatoid arthritis and related diseases. Curr Pharm Des 19: 6375–6381, 2013. Parkinson’ s disease in rats. Med Gas Res 2: 15, 2012 22） Matsumoto A, Yamafuji M, Tachibana T, Nakabeppu Y,. 11） Ishibashi T, Sato B, Rikitake M, Seo T, Kurokawa R, Hara. Noda M, Nakaya H: Oral 'hydrogen water' induces neuro-. Y, Naritomi Y, Hara H, Nagao T: Consumption of water. protective ghrelin secretion in mice. Sci Rep 3: 3273, 2013. containing a high concentration of molecular hydrogen. 23） Tekkök SB, Brown AM, Ransom BR: Axon function per-. reduces oxidative stress and disease activity in patients. sists during anoxia in mammalian white matter. J Cereb. with rheumatoid arthritis: an open-label pilot study. Med. Blood Flow Metab 23: 1340–1347, 2003. Gas Res 2: 27, 2012. 24） Brown AM, Tekkök SB, Ransom BR: Glycogen regula-. 12） Ito M, Ibi T, Sahashi K, Ichihara M, Ito M, Ohno K:. tion and functional role in mouse white matter. J Physiol. Open-label trial and randomized, double-blind, placebo-. 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(5) 虚血再灌流障害に対する分子状水素の保護作用. Abstract Protective effect of molecular hydrogen against white matter ischemic injury Mami Noda1, 2 1Laboratory of Pathophysiology, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyushu University, Fukuoka, Japan 2Division of Neurofunctional Genomics, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, Fukuoka, Japan The central nervous system (CNS) white matter (WM) ischemia is an important clinical problem and may produce injury, in part, by reactive oxygen species (ROS)-induced mitochondrial dysfunction. Using the mouse optic nerve (MON) WM model, we tested whether hydrogen (H2) in drinking water reduced functional WM ischemic injury. Functional integrity of MON was determined by quantitatively monitoring the area of MON compound action potential (CAP) in vitro. A 60 min period of oxygen and glucose deprivation (OGD) caused prompt loss of the CAP followed by an average 20% recovery. After 10–14 days of H2-water, the CAP area did not disappear during ischemia and recovered to a significantly great extent during reperfusion. Immunostaining of axonal neurofilament also showed significant protection by previous drinking of H2-water. Accumulation of nuclear 8-oxoguanine (8-oxoG), a marker of oxidative DNA damage, was observed mainly in oligodendrocytes after OGD. The level of 8-oxoG and lipid peroxidation after OGD were significantly reduced in optic nerves from H2-water drinking mice. The importance of these observations is that ischemic protection of myelinated CNS WM by drinking H2-water provided partial protection in a novel manner, suggesting oxidative stress-resistance and intriguing therapeutic options. Key words: molecular hydrogen, white matter, optic nerve, oxygen and glucose deprivation, 8-oxoguanine. ─ 81 ─.

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