ペルオキシダーゼ吸着における繊維のゼータ電位の影響

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(1)Title. ペルオキシダーゼ吸着における繊維のゼータ電位の影響. Author(s). 藤本, 明弘; 森田, みゆき. Citation. 北海道教育大学紀要. 自然科学編, 65(1): 35-40. Issue Date. 2014-08. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/7578. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) 北海道教育大学紀要(自然科学編)第 6 5巻第 1号 J o u r n a lo fHokkaidoU n i v e r s i t yo fE d u c a t i o n( N a t u r a lS c i e n c e s )Vo . l6 5 .No. l. 平成 2 6イ￨二 8月. Augus . t2014. ペルオキシダーゼ吸着における繊維のゼータ電位の影響藤本明弘・森田みゆき北海道教育大学被服学・生活環境工学研究室. I n f l u e n c eo fZ e t ap o t e n t i a lo fF i b e ronA d s o r p t i o no fP e r o x i d a s e FU]IMOTOA k i h i r oandMORITA Miyuki D e p a r t r n e n to fT e x t i l eS c i e n c e- E n g i n e e r i n go fL i f ean【IE n v i r o n r n e n . tSapporoCarnpus. HokkaidoU n i v e r s i t yo fE d u c a t i o n，S a p p o r o .0 0 2 8 5 0 2. ABSTRACT Asb a s i cr e s e a r c hf o ri m m o b i l i z i n gt h ePODt ot h ef i b e r，t h ei n f l u e n c eo ft e x t i l ef i b e rz e t a p o t e n t i a lonh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e(HRP)andsoybeanp e r o x i d a s e( S P O )a d s o r p t i o no n t o a l u e sd e c r e a s e dt h en e g a t i v ez e t ap o t e n t i a lo fa l lt e x t i l e s t e x t i l e swasexamined，LowpHv o l l o w i n g7dayso fp r e s e r v a t i o no fp e r o x i d a s ei nCarmodyb u f f e ra tv a r i o u spH s t u d i e d， F oremains t a b l ebetweenpH5 9andSPOr e v a l u e si nt h erangepH2 9，HRPwasfoundt c i d i cc o n d i t i o n sr e s u l t e di nah i g hHRPa d s o r p t i o nr a t ef o r maineds t a b l ebetweenpH4 9，A h epHwash i g h e rt h a nt h ei s o e l e c t r i cp o i n to fHRP(pH7 . 2 )， a l lt e x t i l e s，However，whent t h ea d s o r p t i o nr a t eo fHRPt oc o t t o nand6 n y l o nt e x t i l e sweret h eh i g h e s t .Undera c i d i c h ea d s o r p t i o nr a t eo fSPOt oa l lt e x t i l e ss t u d i e dwash i g h， A crudee x t r a c to f c o n d i t i o n s，t l l o w i n gt h e i ra d s o r p t i o nt ot e x t i l ef i b e r st ob e SPOc o n t a i n smanyc o n t a m i n a t i n gp r o t e i n s，a examineda sw e l LSPOi nt h ee x t r a c tc l e a r l ya d s o r b e dp r e f e r e n t i a l l yo n t oc o t t o nandp o l y e s t e rt e x t i l e sa tpH5 .. 1.緒言. また，ベルオキシダーゼは動植物界に広く存在しており，その中でも西洋わさび由来ベルオキシ. ベルオキシダーゼ (POD) は，過酸化水素を. ダーゼ ( HRP) は最も研究されており 3)，動物由. 第一基質としてアミノ化合物やフェノール化合物. 来の PODに比べて安定性が高く，植物由来の. などの各種水素供与体の酸化を触媒する酵素であ. PODの中では反応性が高い。また，同じ植物か. る。こうした性質を利用して，漂白剤 1)やバイオ. ら抽出される大豆由来ベルオキシダーゼ ( S P O ). センサ _2)への利用に関する研究がおこなわれて. はHRPに比べて熱・ pH安定性が良いことが報告. いる。. されている 4-5)。. 3 5.

(3) 藤本明弘・森日みゆき. しかし，ベルオキシダーゼを含めた酵素は溶液. 繊維は財団法人日本規格協会(JI S染色堅ろう. 系で反応することから，反応液中より酵素のみを. 度試験用 ] I SL0 8 0 3 準拠)の木綿布吊，ポリエス. 変性させずに回収し，これを再利用することは技. テル(ポリエチレンテレフタレート)布吊，関西. 術的に非常に困難であることから，反応液中に十. 衣生活協会の 6 ナイロン布吊を使用した O 布吊. 分に酵素活性を持った酵素が残存していても，こ. は体積比 1 :1のエ夕ノ一ル水;混昆合溶液中で. れを変性，失活させて除去し反応生成物を分離. i 溶容性およびび、油 i 溶容性成分を除去しし，風乾後試半苧利料 : [ 干 [ . ととし. している 6)。つまり，一回の反応ごとに酵素を捨. て用いた o Table1に試料として用いた布吊の厚. ててしまっている。さらに，一般的に酵素は高価. さ，糸密度を示す。. な場合が多いこともあり，酵素を利用することはコスト面という大きな課題がある。また，溶解した状態の酵素は一般的に不安定であって，酵素反応をおこなうのに適した温度や. ゼータ電位の測定には，大塚電子製ゼータ電位・粒径測定システム ELSZ-1000seriesを用いた。吸光度は，目立製 U-2010形紫外可視分光光度. pHでも比較的早く失活するという欠点もある 7)。. 計を用いて，光路長 1cmの石英セルで測定した。. こうした酵素の欠点は，酵素を固定化すること. 温度制御には，目立製 1 3 1 0 0 4 0 温度表示付き恒温. で解消できることがわかっている。酵素の固定化. セルホルダーと目立製 TEMPERATURECON-. 方法には物理的吸着法，イオン結合法，共有結合. TROLLERSDR-30を使用した。 pHの測定には. 法，架橋法，包括法がある。中でもイオン結合法. HORIBApHメーター F-23をf 吏用した。. は，固定化操作がきわめて簡便であることや担体. 布吊への POD吸着処理には YAMATO製. の再生が可能なこと，酵素の修飾を伴わないこ. W ATERBATHINCUBATORBT-25を{吏用し. と8)などから有用な固定化方法の一つであり，酵. た。. 素固定化量と酵素と担体の聞のゼータ電位差が相関関係にあることが報告されている則。一方，繊維は表面積が大きいため，表面に多量の酵素を結合でき，さらに，糸・布 .i 慮紙状など様々な形状に加工できる点から酵素固定化担体と. T a b l e1 T h i c k n e s sandWeavingD e n s i t yo fT e x t i l e s WeavingD e n s i t y ( / c m ). T h i c k n e s s M a t e r i a l s (mm). して有用であると考えられる。. e n d s. p i c k s. C o t t o n. 0 . 2 6 0. 3 1. 2 7. PODの固定化を目的として，繊維のゼータ電位. 6 N y l o n. 0 . 1 1 5. 4 6. 3 7. が PODの吸着に及ぼす影響について検討した。. P o l y e s t e r. 0 . 0 7 9. 4 3. 3 9. 本研究では，イオン結合法による繊維への. 2 .実験 2 . 1 試薬および装置 PODは HRP (等電点 pH7.2，和光純薬)と SPO (大豆の根からの抽出液)を精製せずに使用した。. HRP， SPO の活性はそれぞれ. 2 . 2 操作 SPO抽出液の調製:大豆(品種:あおしずく) の根 5 0gに水 250mlを加えてミキサーで約 5分間粉砕い櫨過した後，. 4Cで 1 0分間遠心分離 0. ( 3 0 0 0 r .p .m) した上澄み液を回収して，これを SPOt 白出 j 夜とした。. 21 .1U/0.2m ， l 24.5U/0.2mlに調製して使用し. 繊維のゼータ電位の測定 :Carmody緩衝液. た。その他の試薬は全て試薬特級を使用した。水. ( p H 5 9 ) 中の繊維(木綿， 6 ーナイロン，ポリエ. はイオン交換水を一回蒸留し，さらに超純水処理. ステル)のゼータ電位を大塚電子製ゼータ電位・. したものを使用した。. 粒径測定システム ELSZ-1000seriesを用いて測. 3 6.

(4) ベルオキシダーゼ吸着における繊維のゼータ電位の影響. 定した。ゼータ電位は測定した電気浸透プロット. 4 )から算出した。なお，次式(. 1 )および Smoluchowskiの式( 2 ) より森・岡本の式(. ンパク質として牛血清アルブミンを使用した。. を用いて算出した。溶媒の物性値は 2 5Cにおける 0. BCA法では標準タ. タンパク質吸着率(%). =( ( X2-X1)IX2)x100. 純水の値(屈折率:1 . 3 3 2 8，粘度:0 . 8 8 7 8，誘電. ( 4 ). 8 . 3 ) を使用した。率 :7 Uobs( z )=AUo( z / b )2+dUo( z / b ). +( 1-A)Uo+Up. ( 1 ). Z :セル中心位置からの距離. 3 . 結果と考察 3 . 1 繊維のゼータ電位の測定. Uobs(z):セル中の z位置における見かけの. Carmody緩衝液 ( p H 5 9 ) 中における木綿， 6 -. 移動度. ナイロン，ポリエステル繊維のゼータ電位を求め. A :1 I [( 2 1 3 )一 ( 0 .420166/K)]. た。各 pHにおける繊維のゼータ電位を Fig.1. K=a/b:2 aと2bはセル断面の横と縦の長さ，. に示す。どの繊維においても pHが高くなるにつれ，ゼータ電位の負の値が大きくなる傾向がみら. a>b. Up:粒子の真の移動度. れた。これは pHの増加にともなって，各繊維表. Uo:セルの上面，下面における平均移動度. 面のカルボキシル基の解離 11)する量が増えたた. dUo:セル上面と下面における移動度の差. めと考えられる。一般に疎水性の繊維のゼータ電. (=4πηU/ε(2) U:電気移動度，. ε :溶媒の誘電率，. η:溶媒. 位は親水性繊維より負の値が大きくなると報告されており. 1 2 )，本条件下においても疎水性繊維で. ある 6 -ナイロン，ポリエステルのゼータ電位の負. の粘度各種 PODの pHに対する保存安定性: POD溶. の値が大きくなった。また， 6ーナイロンは分子末. p H 2 9 ) を体積比 1 :1 液と Carmody競衝液 (. 端にカルボキシル基とアミノ基を持つことから，. 7日間 4Cで保存した。保存開. ある pHで等電点を持つ両性繊維であると知られ. 始時と 7日保存後の POD活性はグアヤコール. ているが，本条件下では等電点を得られなかった。. の割合で混合し，. 0. 法 10)を用いて測定した。. 。. PODの布吊への吸着:布吊 0.14gを Carmody緩 Carmody緩衝液. 衝液に一晩浸漬した。その後，. から取り出した布吊を体積比 1 : 1の割合で. Carmody緩衝液と混合した POD溶液に 1 :5 0 の浴比で入れ，. 2時間 3 0 分， 2 0Cでインキュベー 0. トした。さらに，冷蔵庫で布吊を一晩エージング. ， . ; >. ω 5. 器. 、つ話. 器 M I 0 ω. ~ナ....，段. した。繊維への POD吸着率は布吊を取り出した. POD残液の活性 (U1) と布吊を入れていない. 、. ひ、. o. 吟-'. 仏. 、 . . . . . . . : :. . τ四 . d ・・. 語. 品 -15. 〉ぜ. POD溶液の活性 ( U 2 ) をグアヤコール法で測定し，次式( 3 )から算出した。. POD吸着率(%)=((U2-U1)/U2 )x100. ( 3 ). SPO溶液中のタンパク質の布吊への吸着:布吊へのタンパク質吸着率は布吊を取り出した SPO 残液に含まれるタンパク質濃度 (X1) と布吊を. ω 2 0. 4. 5. 6 7 8 pH. 9. 1 0. : ・: ・. F i g .1I n f l u e n c eo fpHo nZ e t aP o t e n t i a lo fF i b e r s . C o t t o n. 6 N y l o n 0:P o l y e s t e r. 入れていない SPO溶液に含まれるタンパク質濃. ) をビシンコニン酸 (BCA) 法で求め，度 (X2. 3 7.

(5) 藤本明弘・森日みゆき. 3 . 2 PODの保存安定性に及ぼす pHの影響. 20. 各 pH条件下での繊維のゼータ電位を利用した. PODの吸着を検討するため， PODの保存安定性に及ぼす pHの影響を調べた。各 pHにおける. ¥ i E1 5 z 4 唱 f " d ~ 命. 保存開始時の酵素溶液の活性に対する 7日後の. HRPと SPOの残存活性を Fig.2と Fig.3に示 H5-9の範囲で残存活性が80%以上す。 HRPは p SPOにおいては. あり，安定であった。また，. pH4-9の範囲で、残存活性が80%以上あり， HRP. 2 z =1 0. S E E 〈. 出 p : ; ふ. ぺミd. 5. に比べて広範囲の pHで保存安定性がよいことがわかった。これは，. 0 4 5. SPOの方が HRPに比べ酸. ・. 性領域で活性部位の立体構造の乱れが起こらな. Y 3. パ・. 6. 7 pH. S. 9. 1 0. : ・: ・. F i g .4A d s o r p t i o nr a t eo fHRPo nT e x t i l e s .. かったものと考えられる。. C o t t o n. 6 N y l o n 0: P o l y e s t e r. 5hhM1苦︿叩忍ぶ略語叫似. ' ' a. 20 1申. M. 母、. -1 5 d). 議以. 210 2 345 6 7 8 9 pH F i g . 2R e m a i n i n gA c t i v i t yo fHRPa f t e r7d a y s .. 骨。. 記的. 1 0 0. ( ( ). 品〈. Q. 5. 民・. 、.. 。. 、、、 '. 、0. 、、司'. 、ぜ. 輔ゐ晶ム品. 678 pH. 試 . _ _8 0 b. : ・: ・. ;>. 怒 6 0. F i g .5A d s o r p t i o nr a t eo fSPOo nT e x t i l e s .. 4. 設 40 t :. C o t t o n. g u. 6 N y l o n 0:P o l y e s t e r. ーナイロン布 HRPにおいては， pH7で、木綿， 6. ~. 2. 3. 4. き. 6. 7. 8. 9. pH F i g .3R e m a i n i n gA c t i v i t yo fSPOa f t e r7d a y s .. 吊への吸着率が最も低くなり，. pH7より pHが低. ーナイロンくなるもしくは高くなるほど，木綿， 6 布吊にへの吸着率が高くなる傾向を示したo. pH7より低い pH条件下では，木綿， 6ナイロン 3 . 3 布吊への POD吸着に及ぼす pHの影響. 繊維のゼータ電位の負の値は pHが低下すると減. 上述の PODが安定である pH条件下で布吊へ. 少するが，一方 HRPは等電点が p H7.2であるこ. H5-9条件下での各の POD吸着性を検討した。 p. とから， pHが低下するとゼータ電位の正の値が. ig.4に， p H4-9条件下布吊への HRP吸着率を F. 増加する。つまり， pH7より低い pH条件下では，. i g . 5に示す。での各布吊への SPO吸着率を F. 繊維のゼータ電位の負の値の減少よりも HRPの. 3 8.

(6) ベルオキシダーゼ吸着における繊維のゼータ電位の影響. ゼータ電位の正の値が増加する割合の方が大きくなることにより，. HRPと木綿，. 3 . 4 各 pHにおける布吊への SPO抽出液中. HRPと6ーナイ. ロン繊維聞のゼータ電位差が大きくなったため静. のタンパク質の吸着. 3. 3で、布吊への SPO吸着性について検討し. 電的吸着量が増加したことから HRP吸着率が高. たが，用いた SPOは未精製であるため，. くなったと考えられる。. 出液中には SPO以外のその他のタンパク質が多. 一方，. pH7より高い pH条件下においては，等. SPO抽. く含まれていると考えられる。そのため，. SPO. 電点より低い pHであるために HRPの分子構造. を含めたタンパク質の布吊への吸着性について検. 内の静電的反発が起こると考えられる。そのため. 討した。 pH4-9条件下で、の布吊へのタンパク質. HRPの高分子鎖が広がった状態となり，繊維と. 吸着率を Fig.6に示す。どの布吊においても. より多くの面で水素結合を形成したために吸着量. pH4-5の範囲で、タンパク質吸着率が高い傾向がみ. が増加したため HRP吸着率が高くなったと推定. られた。これは，. される。. ゼータ電位の負の値が減少し，ゼータ電位の負の. ポリエステル布吊においても，. pHが低くなるにつれ，布吊の. pHが低くなる. 値が大きいタンパク質の静電的吸着量が増加し. につれ HRP吸着率が高くなる傾向を示した。こ. た，もしくは pHが低くなるにつれて減少する繊. れは，木綿， 6 ナイロン繊維の場合と同様に，. 維のゼータ電位の負の値の割合よりも，増加する. pHが低下することにより減少するポリエステル. ゼータ電位の正の値の割合が大きいタンパク質と. 繊維のゼータ電位の負の値よりも増加する HRP. の静電的吸着量が増加したものと考えられる。ま. のゼータ電位の正の値の割合の方が大きくなるこ. た，木綿布吊は pH9条件でタンパク質吸着率が. HRPの静電的吸着量が増加したため. 高くなった。これは pH9で、木綿布吊と水素結合. とにより，. HRP吸着率が高くなったと考えられる。. するタンパク質の吸着量の増加，もしくは木締布. F i g .5 )，木綿布吊は低い pH SPOにおいて ( 条件下で SPO吸着率が高くなる傾向がみられた。. 吊に対してゼータ電位差が大きくなるタンパク質との静電的吸着量が増加したためと考えられる。. SPOの等電点が pH4-513-14)付近にあるこ. 従って Fig.5と F i g .6より，木綿，ポリエステ. とから，低い pH条件下では SPOが凝集するこ. ル布吊においては pH5条件下で、 SPOが優先的に. とで一定の布吊の表面積により多くの SPOが吸. 吸着することが明らかとなった。. また，. 着したため SPO吸着率が高くなったと考えられる。また， 6ナイロン，ポリエステル布吊においても低い pH条件下で比較的 SPO吸着率が高い. 率. 20. 、、守、治. 傾向がみられる。これは木綿布吊と同様に低い. 1 5. 2 喧. ~. 5. SPO吸着率が高くなったと考えられる。. て '3. を晶. 〈. ンパク質に比べて SPOと疎水性結合しやすい条件であったため SPO吸着率が高くなったと推定される。. 2 2 h. 品 3. 3. 4. 5. 6. J4. リエステル布吊の場合は SPO抽出液中の他のタ. 。. 1VJho. ク質に比べて SPOが水素結合しやすい条件，. ポ. イロン布吊の場合は SPO抽出液中の他のタンパ. 。. 点器. 5. E. -ナロン布吊ともに SPO吸着率が高くなった。 6. ; : : :. 怒 .. ‘ ・. pH8においてはポリエステル， 6ーナイ. ，. また，. 0. 、、 ‘ ‘ ‘ ‘ ，. ち10. ' amv 畠. 吊の表面積により多くの SPOが吸着したため. ・7 o. pH条件下では SPOが凝集することで一定の布. 吟4. 7. 8. 9. 1 0. pH F i g .6A d s o r p t i o nr a t eo fS o y b e a nP r o t e i no nT e x t i l e s . N y l o n • :C o t t o n • :6. o: P o l y e s t e r 3 9.

(7) 藤本明弘・森日みゆき. pH6においてポリエステル布吊のタンパク質吸着率がマイナスを示しているが，これはこの pH 条件においてタンパク質吸着率が低く，さらに. SPO抽出液中に含まれる物質により BCA法における反応を阻害されたためと推測されるが，今後. ( 1 9 7 8 ) 4) A.Henriksen.O .Mirza.C .I n d i a n i .K .Teilum，G . .G .Welinder，M.G a j h e d e .P r o t e i nS c i .， Smulevich，K 1 0，1 0 8 ー1 1 5( 2 0 0 1 ) o r i s a k i .K .Iwata，K .I to .J .O l e oS c i . . 5) M.M o r i t a，M.M 5 3 .1 7 7 1 8 1( 2 0 0 4 ) 6) T 畑一良I~ ，“固定化酵素"講談社サイエンティフィク，. 検討する必要がある。. 2( 1 9 7 5 ) 7)千畑一郎，土佐哲也，高分子学会誌， 1 6，8 2 3 8 2 4 ( 1 9 6 7 ). 8)福井三郎，田中 j 屋夫，“バイオリアクター:生化学的. 4 .総括. 3( 19 8 6 ) 側而から"共立山版， 2. 全ての繊維種(木綿， 6ナイロン，ポリエステル)の布吊において，繊維のゼータ電位は pHが高くなるにつれ，負のゼータ電位の値が大きくな. .M e t r e v e l i，M.Franzreb，F .H .Frim 9) N .S c h u l t z，G me ，l C .Syldatk，C o l l o i d sandSurfacesB :B i o i n t e r 6，3 9 4 4( 2 0 0 8 ) f a c e s .，6 1 0 )T . Hosoya，M. Morrison，J . Bio. l Chem.，2 4 2， 2 8 2 8 2 8 3 6( 19 6 7 ). る傾向がみられた。. POD水溶液の保存安定性に及ぼす pHの影響について検討した結果，. HRPにおいては pH5-9. の範囲で残存活性が80%以上あり，. SPOにおい. 3，4 8 5 4 9 1( 1 9 8 4 ) 1 1 ) 田川美恵子，油化学会誌， 3 1 2 ) 須沢利郎，工業化学雑誌， 6 4，5 7 3 5 7 6( 1 9 6 1 ) n 1 3 ) B.].Ryan.N.Carolan.C.O.Fagain，Trendsi 5 5 3 6 3( 2 0 0 6 ) B i o t e c h n o l o g y . 2 4， 3. ては pH4-9の範囲で残存活性が80%以上あるこ. 1 4 )S .Toiguchi， K .H a y a s h i .Y .Adachi， M.Motoki， K .. SPOの方が HRPに比べて長期間広範. Haraguchi.NipponShokuhinKogyoG a k k a i s h i .3 6，. とから，. 囲の pHで安定であることが明らかになった。. 5 9 7 6 0 2( 1 9 8 9 ). 布吊への POD吸着性について検討した結果，全ての布吊で pHが低くなるほど HRP吸着率が高くなった。また，木綿， 6ナイロン布吊においては HRPの等電点である pH7より pHが低くなる，もしくは高くなるほど吸着率が高くなった。. SPOにおいても低い pH条件下で全ての布吊の SPO吸着率が高くなる傾向がみられた。さらに， SPO抽出液中に含まれる SPO以外のタンパク質の吸着性について検討した結果，木綿，ポリエステル布吊においては，. pH5条件で最も SPOが優. 先的に吸着することが明らかになった。繊維への POD吸着においては，繊維のゼータ電位よりも PODのゼータ電位，構造が大きく影響していると推測されるので，今後は PODのゼータ電位の測定も検討する必要がある。. 引用文献 1)森田みゆき，繊維学会誌， 6 3，7 1 1( 2 0 0 7 ) 2) 青 1 1 1 1 湯，桜井定人，日本化学会誌， 7 ，4 7 9 4 8 3( 1 9 9 7 ) 3 5 4 3) 田村守，“ヘムタンパク質の化学"化学同人， 5. 4 0. (藤本明弘札幌校大学院生) (森田みゆき. 札幌校教授).

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