JCPE Journal, Vol.13, No.4,255-262 (2001)
投 稿 論 文
化 学 計 算 を用 い た カテ キ ン類 の抗 酸 化 作 用 機 構 の解 明
栗 原 正 明1*, 近 藤 一 成2, 豊 田 正 武2, 宮 田 直 樹1 国 立 医 薬 品 食 品 衛 生 研 究 所 1有 機 化 学 部, 2食 品 部 (〒158-8501東 京 都 世 田 谷 区 上 用 賀1-18-1)Received 3 September 2001; accepted 26 November 2001
半 経 験 的 分 子 軌 道 法 に よ り カ テ キ ン 類 の す べ て のC-H,O-HのBond Dissociation Enthalpy (BDE)を 計 算 し た 。 そ の 結 果,ベ ン ジ ル 位 で あ るC環 のC-2位 のC-HのBDEが 特 に 低 い 値 で あ る こ と か ら,こ の 水 素 の 引 き 抜 き が カ テ キ ン の 抗 酸 化 作 用 に 重 要 で あ る と 考 え た 。 LC/MS/MS,UV等 の 結 果 と あ わ せ る こ と に よ り カ テ キ ン の ラ ジ カ ル 消 去 の メ カ ニ ズ ム を 提 出 し た 。 1. 緒 言 活 性 酸 素 を は じ め とす る フ リ ー ラ ジ カ ル 種 が 生 体 傷 害 の 大 き な 原 因 の ひ と つ で あ り,老 化 や 疾 病 に 深 くか か わ っ て い る と考 え ら れ て い る 。 こ の よ う な 酸 化 ス ト レ ス を 防 御 す る こ と が で き れ ば,疾 病 の 予 防 に つ な が る と の 期 待 か ら,カ テ キ ン を初 め と し て 抗 酸 化 物 質 が 大 き な 注 目 を集 め 、 活 発 な 研 究 が 行 わ れ て い る 。 カテ キ ン類 は 茶(Camellia sinensis)に 含 ま れ る ポ リフ ェ ノ ー ル で,発 が ん抑 制1),抗 ア レ ル ギ ー 作 用2)な ど数 多 くの 生 物 作 用 が 報 告 され て 注 目 さ れ て い る 。 そ の 作 用 は 主 に カ テ キ ン の 抗 酸 化 作 用 に 基 づ く もの と 考 え ら れ て い る 。 こ の 抗 酸 化 作 用 は,酸 素 ラ ジ カ ル 種 を一 電 子 還 元 し 消 去 す る こ とに よ り発 揮 され る 。 通 常,抗 酸 化 物 質 の フ ェ ノ ー ル 性 水 酸 基 が 反 応 部 位 と な る 。 Fig. 1
い こ と が わ か っ て き た 。 実 際,カ テ キ ン の 一 成 分 で あ る(-)-epicatechin 1は フ ラ ボ ノ イ ドの quercetin5よ り還 元 能 が 低 い に も 関 わ らず,そ の 抗 酸 化 作 用 は 同 等 か そ れ 以 上 強 い 。 ま た, カ テ キ ン類 の 中 で も,ラ ジ カ ル 消 去 能 と水 酸 基 の 数 は 必 ず し もパ ラ レ ル で は な い 。 こ れ は, カ テ キ ン の 場 合 に は 抗 酸 化 作 用 に 関 わ る 反 応 部 位 が フ ェ ノ ー ル 性 水 酸 基 以 外 に も存 在 す る こ と を示 唆 し て い る 。 こ れ ま で 抗 酸 化 作 用 に 関 す る 数 多 くの 報 告 が 存 在 す る もの の,そ の 作 用 機 構,反 応 機 構 に 関 す る 報 告 は ほ と ん ど な く,唯 一 カ テ コ ー ル 部 分 が 反 応 して 自 身 はo-キ ノ ン と な る と推 測 さ れ て い る の み で あ る.ま た,ポ リ フ ェ ノ ー ル 類 の 生 物 活 性 発 現 に は そ の 酸 化 体 も 関 与 し て い る こ と が 十 分 考 え ら れ る 。 した が っ て,種 々 の 生 物 活 性 機 構 を 理 解 す る う え で 抗 酸 化 作 用 機 構 を 明 ら か に す る こ と は 不 可 欠 で あ る 。 そ こ で,カ テ キ ン 類 ((-)-epicatechin 1,(-)-epigallocatechin 2,(-)-epicatechin gallate3, (-)-epigallocatechin gallate 4) の ラ ジ カ ル 消 去 の メ カ ニ ズ ム を 明 ら か に す る た め,化 学 計 算(分 子 力 学 法 、 お よ び 分 子 軌 道 法)を 用 い る こ と を 検 討 した 。 さ ら に,LC/MS/MS,UV等 の 機 器 分 析 の 結 果 と 合 わ せ て,抗 酸 化 の 作 用 メ カ ニ ズ ム の 解 明 を行 っ た 。
2. 方 法
半 経 験 的 分 子 軌 道 法 を 用 い て4種 の カ テ キ ン 類1∼4の 全 て のC-H,O-HのBond
Dissociation Eenthalpy(BDE)3,4)を 求 め た(Fig.2)。 計 算 方 法 の 手 順 を 以 下 に 示 す 。 初 め に, 分 子 力 学 計 算 に よ る 化 合 物 の コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン解 析 を行 い,最 安 定 構 造 を 求 め た 。Fig.3に 1∼4の 最 安 定 コ ン フ ォマ ー の 三 次 元 構 造 を 示 し た 。3,4に 関 して は エ ネ ル ギ ー 差 の 小 さ い 二 つ の コ ン フ ォマ ー を 最 安 定 構 造 と した 。 そ の 構 造 を 初 期 構 造 と し,半 経 験 的 分 子 軌 道 法(PM3)に よ り生 成 熱 を 求 め た 。 そ の 際, 水 酸 基 か ら水 素 ラ ジ カ ル を除 い た ラ ジ カ ル 種 の 場 合,隣 接 す る 水 酸 基 の 向 き に よ りエ ネ ル ギ ー が 異 な る 場 合 が あ る の で 隣 接 す る水 酸 基 を 回 転 さ せ た もの も計 算 し,一 番 低 い エ ネ ル ギ ー の もの を 求 め た 。 プ ロ グ ラ ム は 分 子 力 学 計 算 に よ る コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン解 析 に はMacro Model (Schrodinger,Inc.)を,半 経 験 的 分 子 軌 道 法 はSPARTAN(Wavefunction,Inc.)を 用 い た 。 計 算 の 仕 様 に 関 して はTable 1の 条 件 を 用 い た 。 Fig. 2
1: EC 2: EGC
3: ECG
4: EGCG
Fig. 3
3. 結 果 及 び 考 察
先 に 示 し た 様 に 、 経 験 的 分 子 軌 道 法(PM3)に よ っ て 求 め た カ テ キ ン 類1∼4のC-H,O-Hの BDEの 計 算 結 果 をFig.4に 示 し た 。 カ テ キ ン の ベ ン ジ ル 位 で あ り,酸 素 原 子 と 結 合 し たC-2 位 のC-HのBDEは,フ ェ ノ ー ル 性 水 酸 基 のO-HのBDE(EC:72.1 kcal/mol,EGC:68.4 kcal/mol,ECG:69.1 kcal/mol,EGCG:67.7kcal/mol)と 比 較 し て も,特 に 低 い と い う 結 果 を 得 た
(EC:64.8kcal/mol,EGC:65.5kcal/mol,ECG:64.6kcal/mol,EGCG:65.3kcal/mol)。 こ の こ と は,カ テ キ ン のC-2位 か ら の 水 素 ラ ジ カ ル の 引 き 抜 き が,他 の 水 素 と 比 較 し て も,容 易 に お こ る こ と を 示 し て い る 。 カ テ キ ン 類 が ラ ジ カ ル 種 と 共 存 し た と き,フ ェ ノ ー ル 性 水 酸 基 の 水 素 引 き 抜 き に 加 え て,こ のC-2位 の 水 素 引 き 抜 き が ラ ジ カ ル 消 去 の 機 構 に 重 要 な 役 割 を 果 た す こ と が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に,ラ ジ カ ル 開 始 剤2,2'-azobis (2-aminopropane) dihydrochloride (AAPH)と カ テ キ ン 類 か ら 生 成 す る 反 応 中 間 体 のLC/MS/MSお よ びUVス ペ ク トル 等 の 実 験 結 果 と 併 せ て 考 察 す る こ と に よ り 、 カ テ キ ン 類 の ラ ジ カ ル 消 去 の メ カ ニ ズ ム を 提 出 し た5,6)
(Fig.5,Fig.6)。
1: EC 2: EGC
3: ECG 4: EGCG
す な わ ち,EC 1に お い て はLC/MS/MSの フ ラ グ メ ン ト解 析 及 びUVに よ る 解 析 か ら8の 生 成 を確 認 で き た こ と よ り,Aの 機 構 を 推 定 し た 。 EGC 2で は, LC/MS/MS及 びUVに よ り,中 間 体14を 確 認 した 。 また,SOD添 加 実 験 等 に よ り ス ー パ ー オ キ サ イ ド(O2)の 生 成 が 示 され た 。 EGCがECよ り抗 酸 化 能 が 低 い の は,こ の 生 成 す る 活 性 酸 素 に よ り抗 酸 化 作 用 が 相 殺 され る もの と 考 え ら れ る 。 同 様 の 実 験 に よ り,ECG, EGCGの 抗 酸 化 の 作 用 機 構 もC,Dの よ う に 推 定 した 。 A B Fig. 5
C
D
ま た,カ テ キ ン の2量 体 で あ るprocyanidin B-1を1 ,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)の
ラ ジ カ ル と 共 存 さ せ る とprocyanidin A-1が 生 成 す る こ と を 見 い だ し た7)(Fig .7)。 こ れ は, カ テ キ ン のc-2位 の 水 素 が ラ ジ カ ル に よ り 引 き 抜 か れ る ,直 接 的 な 証 拠 と 考 え ら れ る 。
procyanidin B-1 (PB-1) procyanidin A-1 (PA-1) こ の よ う に,カ テ キ ン類 の 抗 酸 化 作 用 は,酸 素 原 子 と 結 合 し て い る ベ ン ジ ル位 炭 素 か ら の 水 素 ラ ジ カ ル の 引 き抜 き が 重 要 な 役 割 を し て い る こ と示 し た 。 カ テ キ ン以 外 の 抗 酸 化 物 質 で も こ れ と 同 じ炭 素 を 有 して い る もの が あ り,そ の 抗 酸 化 の メ カニ ズ ム との 関係 に興味 が持 た れ る(Fig.8)。 sesaminol theaflavin 謝 辞 本 研 究 の 一 部 は,厚 生 省 特 別 研 究 「生 物 シ ス テ ム に作 用 す る 化 学 物 質 の 機 能 と 三 次 元 構 造 相 関 の 解 明 」 に よ っ て 行 っ た.
参考文献
1)
Brown, J. P. A. Mutat. Res., 75, 243-277(1980).
2)
Middeton, E., Kondasmami, C.: Biochem, Pharmacol., 43, 1167-1179 (1992) .
3)
Van Arnum, S. D. and Stepsus, N.: Tetrahedron Lett., 38, 305-308 (1997) .
4)
Wright, J. S., Carpenter, D. J., McKay, D. J., Ingold, K . U.: J. Am. Chem. Soc., 119,
Fig. 75)
Kondo, K., Kurihara, M., Miyata, N., Suzuki, T. and Toyoda, M.: Arch. Biochem. Biophys.,
362, 79-86 (1999).
6)
Kondo, K., Kurihara, M., Miyata, N., Suzuki, T., Toyoda, M.: Free Radical Biol. Med., 27,
855-863 (1999).
7)
Kondo, K., Kurihara, M., Fukuhara, K., Miyata, N., Suzuki, T., Toyoda, M.: Tetrahedron
Lett., 41, 485-488 (2000).
8)
Saint-Cricq de Gaulejac, N.., Provost, C. and Vivas, N.: J. Agric. Food Chem., 47, 425
(1999).
Antioxidation
Mechanisms
of Catechins:
A Computational
Study
Masaaki Kurihara1*, Kazunari Kondo2, Masatake Toyoda2 and Naoki Miyata1
1Division of Organic Chemistry and 2Division of Foods , National Institute of Health Sciences
(1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo 158-8501, Japan)