関 西 病 虫 研 報(28):19-24(1986)
各 種 殺 菌 剤 を添 加 した 選 択 分 離 用 基 本 培 地 上 に
お け るAphanomyces
iridis卵 胞 子 の 発 芽
一 谷 多 喜 郎*・ 東 川 光 子*
Takio
ICHITANI
and Teruko
HIGASHIKAWA:
Germination
of Aphanomyces
iridis
oospores
on the basal
medium
for selective
isolation
with addition
of bactericides
and fungicides
Summary
This study examined the effect of different bactericides and fungicides on oospore germination of Aphanomyces iridis. The results obtained are as follows. (1) Oospores can be divided into
mor-phologically complete and incomplete oospores under a light microscope. (2) Both corn meal decoction (CMD) and FOWLES's defined liquid (FDL) media are suitable for producing many complete oospores. (3) Complete oospores with high germinability can be obtained after growing the fungus on either CMD
or FDL medium for 2 weeks at 25•Ž. (4) Optimum temperature and pH for oospore germination are 25℃
and about 6.4, respectively. (5) No inhibitory action of oospore germination is usually seen when chloramphenicol, streptomycin sulfate and vancomycin are used at concentrations up to 100, 80 and 400 ppm, respectively, although the latter two are both sometimes inhibitory at 20-40 and 100 ppm.(6) Anphotericin B, benomyl and iprodione inhibit oospore germination at concetrations higher than 5, 0.5 and 50-100 ppm, respectively. Benomyl is highly inhibitory even at 0.5-1 ppm. Metalaxyl inhibits at the intermediate concentrations used and thiophanatemethyl inhibits at the concentrations higher than 10-50 ppm.
Proc. Kansai P1. Prot. Soc. (28):19-24(1986)
緒 言
最 近,ダ ッチ ・ア イ リス に 黄 化 腐 敗 病 を 起 こ す 新 し い 病 原 菌 と し てAphanomyces iridis ICHITANI & KODAMAが 同 定 さ れ た7,8).本 菌 に 対 し て は 特 異 的 に 有 効 な 薬 剤 が な く11),土 壌 伝 染 性 の 本 病 に 対 し て は 専 ら 耕 種 的 防 除 法 の 確 立 が 期 待 され て い る.し か し,本 菌 の 土 壌 中 に お け る 生 態 に つ い て は,一 部5,6)を除 き,ほ
と ん ど 明 ら か に され て い な い.こ れ ま で に 数 多 く の 報 告 が あ るA. cochlioides, A. euteichesに お い て さ え, 罹 病 組 織 か ら の 分 離 に 関 す る 研 究 が あ る1,2,14,15)のみ で,自 然 土 壌 か ら の 検 出 に つ い て の 報 告 は 見 当 た ら な い. 本 研 究 は,Aphanomyces属 菌 を 罹 病 組 織 か ら 分 離 す る 際 に 用 い ら れ て い るBacto-CMAと こ れ に 添 加 さ れ て い る 数 種 の 殺 菌 剤 を 供 試 し,A.iridisを 土 壌 か ら 検 出 ・分 離 す る に 先 立 っ て そ の 卵 胞 子 の 発 芽 を 調 べ た も の で あ る. 本 研 究 を 行 うに 当 た り,本 菌 の 罹 病 組 織 か ら の 分 離 に つ い て 種 々 の 有 益 な ご 助 言 を 頂 い た 奈 良 県 農 業 試 験 場 の 小 玉 孝 司 博 士 と堀 本 圭 一 技 師 に お 礼 を 申 し 上 べ る. 実 験 材 料 1.供 試 菌 と そ の 卵 胞 子 卵 胞 子 形 成 の 良 好 なA. iridis UOP AP-37を 用 い,ト ウ モ ロ コ シ 煎 汁 寒 天
(CMA)培 地9)あ る い はFOWLESのDefined medi-um3)(FDL培 地)に2%粉 末 寒 天 を 加 え た も の(pH6.2) で3-6か 月 毎 に 移 植 し,15-22℃ で 保 存 し た.
本 菌 の 卵 胞 子 は 次 の よ う に し て 採 取 した.天 然 培 地
*大 阪 府 立 大学 農 学 部 College of Agriculture, University of Osaka Prefecture, Sakai 591, Japan.
粉 末 寒 天 を 加 え た も の で 本 菌 を 斜 面 培 養(25℃,1-2 週 間)し,菌 そ う片(径 約5mm)を 寒 天 と 共 に 切 り抜 き,三 角 フ ラ ス コ 内 の 培 地 に1個 ず つ 移 植 し た.25℃ 暗 黒 下 で 一 定 期 間 静 置 培 養 し,形 成 した 菌 そ う を 凍 結 す る こ と な く 滅 菌 蒸 留 水 で 無 菌 的 に 洗 浄 し,磨 砕 (14,000rpm,2分 間;佐 久 間 製 作 所 製 ・ホ モ ブ レ ン ダ ー)後KUSUNOKI & ICHITANI(1982)12)の 方 法 で 卵 胞 子 浮 遊 液 を 得 た. 2.発 芽 試 験 用 の 培 地 本 属 菌 の 選 択 分 離 用 基 本 培 地 と し て 用 い ら れ て い るBacto-CMA15)を 径9cmの ペ ト リ皿 に10mlず つ 分 注 ・固 化 さ せ,直 ち に 使 用 した . 3.供 試 薬 剤 ア ン フ ォ テ リ シ ンB,ベ ノ ミル(50% 水 和 剤),ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル,イ プ ロ ジ オ ン(50% 水 和 剤),メ タ ラ キ シ ル(25%水 和 剤),ス ト レ プ トマ イ シ ン硫 酸 塩,チ ォ フ ァ ネ ー トメ チ ル(70%水 和 剤), バ ン コ マ イ シ ン を 用 い た.ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル の み は ア セ トン に 溶 解 し,他 の 薬 剤 は 全 て 滅 菌 蒸 留 水 に 溶 解 し て そ れ ぞ れ 高 圧 滅 菌 し た 発 芽 試 験 用 の 培 地 に 使 用 直 前 に 無 菌 的 に 混 合 し た. 実 験 方 法 と 結 果 1.供 試 卵 胞 子 の 類 別 卵 胞 子 の 発 芽 率 を 求 め る に 先 立 っ て,CMDとFDLの 培 地 で 本 菌 の 生 長 曲 線 を 調 べ た 際 に 卵 胞 子 の 形 態 を 詳 し く観 察 し た と こ ろ,次 の よ うに2分 す る こ と が で き た.図 版I-I∼5か ら 明 ら か な よ う に,比 較 的 厚 い 卵 胞 子 壁 が 存 在 す る か,卵 胞 子 壁 は 薄 くて も 明 瞭 に 認 め られ(太 い 矢 印),卵 球 内 が 砂 粒 状 ま た は 正 常 に 観 察 さ れ る(細 い 矢 印)卵 胞 子(形 態 的 に 完 全 な 卵 胞 子,以 下 特 記 し な い 限 り卵 胞 子 とは こ れ を 意 味 す る)と,図 版I-6に 見 られ る よ う に,卵 胞 子 壁 が 波 状 に 著 し く変 形 して い る(太 い 矢 印)か あ る い は 明 瞭 に 認 め られ ず(太 い 矢 印),卵 球 内 部 も 顕 著 に 果 粒 状 を 呈 し て い る(細 い 矢 印)か 消 失 ・空 洞 化(細 い 矢 印)し て い る 卵 胞 子(形 態 的 に 不 完 全 な 卵 胞 子) と に 分 け る こ と が で き た. 2.卵 胞 子 形 成 が 良 好 な培 地 の 選 抜 ジ ャ ガ イ モ(男 し ゃ く)塊 茎 の 煎 汁(PD,2009/1),ダ イ コ ン(青 首 大 根)根 部 の 煎 汁(RD,200g/1)4),CMD,ア サ の 種 実 の 煎 汁(HSD,20g/1),V8野 菜 ジ ュ ー ス(Campbell Soup Co.,Ltd.)の10%液(V8J),FDLの 各 培 地 を 次 の よ う に し て 調 製 し た.は じ め の4種 類 の 培 地 は,1時 間 煮 培 地 上 で25℃,2週 間 培 養 した 菌 を 上 記6種 類 の 培 地 に 寒 天 片 と 共 に 移 植 し,25℃,1週 間 静 置 培 養 し た. 生 育 した 各 菌 そ う を 培 養 液 と共 に ホ モ ブ レ ン ダ ー で 磨 砕(14,000rpm,1分 間)し て 移 植 源 と し,こ の1mlを 49m1の 各 培 養 液 に 分 注 し た .25℃ で 静 置 培 養 し,30-47 日 ま で の 間 の 一 定 期 間 毎 に フ ラ ス コ を2本 ず つ 用 い て 菌 体 乾 燥 重 量(mg/フ ラ ス コ)を 測 定 し,前 述(KUSUNO-KI &I CHITANI,1982)12)の 方 法 で 卵 胞 子 を 採 取 した . 実 験 を2回 反 復 した と こ ろ,菌 糸 生 育 と卵 胞 子 形 成 に つ い て は 同 一 の 傾 向 を 示 した .こ こ で は,2回 目の 結 果 を 実 験 期 間 中 に 得 ら れ た 最 大 値 で 示 す と,菌 糸 生 育 量 はRD培 地 で43.95mg(14日 後)で あ っ た .ま た, 形 成 し た 形 態 的 に 完 全 な 卵 胞 子 の 数 は,FDL培 地 で 最 も 高 く2.93×104個/ml(14日 後),RDとCMD培 地 で も 各1.34×104個/ml(21日 後),6.64×103個/ml(47日 後)と 高 か っ た.し か し,HSD培 地 で は6.68×102個/ ml(14日 後)と 低 く,PD,V8Jで は 実 験 期 間 中 に 全 く 形 成 す る こ と が な か っ た.不 完 全 な 卵 胞 子 を 含 む 全 卵 胞 子 の 形 成 に つ い て も 調 べ た と こ ろ,上 記 の 完 全 な 卵 胞 子 の 場 合 と 同 様 の 傾 向 を 示 した. 従 っ て,卵 胞 子 形 成 良 好 な 培 地 と し てFDLとCMD の 両 培 地 を 次 の 実 験 に 用 い る こ と に し た . 3.卵 胞 子 の 発 芽 能FDL及 びCMDの 培 地 を 用 い,25℃,7-149日 間 静 置 培 養 し,上 述 の 実 験 の よ う に 卵 胞 子 浮 遊 液 を 得 た.発 芽 試 験 用 の 培 地 上 の 互 い に 隣 接 し た5か 所 に 卵 胞 子 浮 遊 液(1.3×105個/ml)を 滴 下(点 滴 径 約2cm)し,25℃,24時 間 静 置 し て 各 箇 所 の 不 完 全 な 卵 胞 子 を 含 む 全 卵 胞 子 と そ の うち の 完 全 な 卵 胞 子 に つ い て そ れ ぞ れ の 発 芽 率 を 求 め た(図 版I -7 ,太 い 矢 印 参 照).実 験 は2回 反 復 した と こ ろ,両 発 芽 率 間 で 同 一 の 傾 向 が 見 られ た.第1図 は2回 目の 実 験 結 果 を 示 し て い る が,両 培 地 で2週 間 培 養 後 に 得 た 卵 胞 子 で 最 も 高 い 発 芽 率 を 認 め た .こ の 場 合,FDL 培 地 で 培 養 し た も の か ら 得 た 卵 胞 子 が 常 に よ り高 い 発 芽 率 を 示 し た.従 っ て,以 下 の 実 験 に はFDL培 地 で 形 成 さ せ た 卵 胞 子 を 用 い る こ と に し た. 4.卵 胞 子 の 発 芽 最 適 の 温 度 とpH本 菌 をFDL培 地 で25℃,2週 間 培 養 し て 卵 胞 子 を 作 ら せ,前 項 と 同 じ よ う に し て 発 芽 試 験 用 の 培 地 上 の5か 所 に 滴 下 し, 15,20,25,30℃ の 各 温 度 下 に24時 間 静 置 培 養 し て 発 芽 率 を 求 め た.ま た,あ ら か じめSORENSEN氏 の りん
一 谷 多 喜 郎 ・東 川 光 子:各 種 殺 菌 剤 を 添 加 し た 選 択 分 離 用 基 本 培 地 上 に お け るAphanomyces iridis卵胞 子 の 発 芽 21 酸 緩 衝 液16)でpHを5.2-7.2の 範 囲 に 調 節(2mlの 緩 衝 液 を58mlの 発 芽 培 地 に 添 加 し てpHを 調 節)し た 発 芽 培 地 上 に 卵 胞 子 浮 遊 液 を 滴 下 し,発 芽 率 を 求 め た. 実 験 を2回 反 復 した と こ ろ,25℃ 附 近,pH6.4に 卵 胞 子 発 芽 の 最 適 が あ り.以 下 の 各 種 殺 菌 剤 の 卵 胞 子 発 芽 に 及 ぼ す 影 響 は,こ の 条 件 下 で 調 べ る こ と に し た. 5.各 種 抗 細 菌 性 抗 生 物 質 の 卵 胞 子 発 芽 に 及 ぼ す 影 響 ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル2)と バ ン コ マ イ シ ン15)に 比 較 の た め に ス トレ プ トマ イ シ ン硫 酸 塩 を 用 い,発 芽 最 適 の 温 度(25℃)とpH(6.4)下 で24時 間 後 に 卵 胞 子 の 発 芽 に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ た.FDL培 地 で25℃,2週 間 静 置 培 養 し,前 述(実 験 材 料 の 項)の よ う に し て 作 製 し た 卵 胞 子 浮 遊 液(1.3×10 5個/ml)を,上 記 の ペ ト リ皿 内 の 培 地 の 中 央 部 に1か 所 滴 下(径 約2cm)し, 区 当 た り5枚 の ペ ト リ皿 を 用 い た.こ れ ら の べ ト リ皿 の 水 平 と 垂 直 の 位 置 を 任 意 に 変 え,恒 温 室 内 で 各 区 の ペ ト リ皿 が 同 じ よ う に 配 置 さ れ て い る よ う に し, 20-70(平 均37)個/ペ ト リ皿 の 卵 胞 子 に つ い て 発 芽 率 を 測 定 し た. 実 験 は2回 反 復 し,得 られ た 結 果 は 第1表 に 示 す よ うに,ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル は 供 試 した100ppmま で の 濃 度 で は 発 芽 に 対 す る 阻 害 作 用 を 認 め な か っ た.同 様 に, ス ト レ プ トマ イ シ ン と バ ン コ マ イ シ ソ も用 い た 濃 度 で 阻 害 作 用 を 認 め な か っ た が,反 復 す る と中 間 の 濃 度 で や や 阻 害 的(20-40%)で あ る と い う結 果 を 得 た. 6.各 種 抗 か び 剤 の 卵 胞 子 発 芽 に 及 ぼ す 影 響 前 項 と 同 じ よ う に し て,ア ン フ ォ テ リシ ンB15),ベ ノ ミ ル15),イ プ ロ ジ オ ン2),メ タ ラ キ シ ル2,15),チ ォ フ ァ ネ ー トメ チ ル1)の 卵 胞 子 発 芽 に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ た. 実 験 を2回 反 復 し,得 ら れ た 結 果 を 第2表 に 示 す と, ア ン フ ォ テ リシ ンB,ベ ノ ミル,イ プ ロ ジ オ ン は そ れ ぞ れ5,0.5,50-100ppm以 上 で,メ タ ラ キ シ ル は 用 い た 中 間 の 濃 度 で,チ ォ フ ァ ネ ー トメ チ ル は10-50ppm以 上 の 濃 度 で 明 ら か に 阻 害 的(30-60%)で あ っ た.特 に,ベ ノ ミ ル は0.5-1ppmの 低 濃 度 で も 阻 害 力 (36-58%)を 保 持 し て い た. 考 察 卵 胞 子 以 外 の 繁 殖 体 を 取 り除 き卵 胞 子 の み を 採 取 す る 方 法 は,Pythium属 菌 で 詳 し く検 討 さ れ て い る10,12) が,本 属 菌 で は 調 べ ら れ て い な い.本 菌 の 卵 胞 子 は 凍 結 す る と発 芽 し な く な り(一 谷 他 ・未 発 表),こ の 場 合 添 加 す る 保 護 剤 の 検 討 が な され て い な い の で,凍 結 に よ り卵 胞 子 以 外 の 繁 殖 体 を 死 滅 ・除 去12)さ せ る こ と は 不 可 能 で あ る ・そ こ で,本 実 験 で は 篩 別 操 作12)を 無 菌 的 に 注 意 深 く行 っ て 卵 胞 子 の 浮 遊 液 を 得 る こ と に した.
Fig.1. Relation between production of morphologically complete oospores and their germination.
(-•E-:Dry weight, -•¢-: No. of incomplete oospores produced, -• -: No. of complete oospores
(1) Means within a column not followed by the same letter are significantly different (P:0.05 by t -test).
Table 2. Effect of different fungicides on oospore germination of Aphanomyces iridis (UOP Ap-37)
on Bacto-corn meal agar (1)
(1) Means within a column not followed by the same letter are significantly different (P:0 .05 by t -test).•\•\: Not conducted.
一 谷 多 喜 郎 ・東 川 光 子:各 種 殺 菌 剤 を 添 加 し た 選 択 分 離 用 基 本 培 地 上 に お け るAphanomyces iridis卵胞 子 の 発 芽 23 これ に よ って,発 芽 試験 に は支 障 が な い程 度 に まで 菌 糸 片 な どの夾 雑 物 を 取 り除 くこ とが で きた. 本 菌 の 卵胞 子 は定 常期 に形 成 され,形 態 的 に完 全 な もの と不 完全 な もの に 顕微 鏡(200倍)下 で 容 易 に類 別 す る こ とが で きた.完 全 な卵 胞 子 に つ いて は,卵 胞 子 壁 の 厚 さか ら800倍 の顕 微 鏡 下 で 卵 胞 子 の 成 熟 度 を 推 定 す る こ とが で きた.卵 胞子 壁 の 薄 い もの(図 版I-1, 2参 照)を 未 熟,厚 い もの(図 版I-3∼5参 照)を 成 熟 した 卵 胞 子 と して 扱 って それ ぞ れ の形 成 過 程 を み た 別 の実 験(一 谷他 ・未 発表)と,卵 胞 子 の発 芽 率 を 経 時 的 に調 べ た 本実 験 の 結 果 を あわ せ 考察 す る と,卵 胞 子 の成 熟 が 進 行 し始 め る と考 え られ る時期 に発 芽 率 が 高 まる よ うで あ る.そ の 後,卵 胞 子 壁 が さ らに厚 く な る時期 に は全 く発芽 す る こ とな く,休 眠状 態 に入 る と推 察 された.従 って,本 実験 で は発 芽 率 の高 い2週 間 培 養 の 比 較 的 若 い 卵 胞 子 を 用 い,最 芽 最 適 条 件 (25℃,pH6.4)下 で 各種 殺 菌 剤 を 分離 培 地 に添 加 し, 発 芽 に及 ぼ す影 響 を 調 べた. 本 実 験 で は,最 近,Aphanomyces属 菌 に良好 な選 択 分 離 用 の基 本 培 地 で あ る と され て い るBacto-CMA を 用 い て発 芽試 験 を行 った.し か し,A.iridisに は炭 素 源,窒 素 源,硫 黄 源 を 添加 した 土壌 煎 汁 寒 天 培地 が よい(奈 良 農試 ・堀 本 氏 か らの私 信)と 言 わ れ て い る の で,こ れ ま で に報 告 が あ る本 属 菌 に 対 す る 他 の培 地14)と共 に,こ れ らの培 地 上 に お け る卵 胞 子 の 発 芽 を 調 べ る必要 があ る. 本 属 菌 を罹 病 組 織 か ら分 離 す る の に有 効 な薬 剤 の 種 類 と濃 度 につ いて は,既 に報 告 が あ る2,15).本実験 で は, これ と同一 の分 離 用 基 本 培 地 上 でA.iridisの 卵 胞 子 発 芽 に著 しい影 響 を 与 え る こ とが な い殺 菌 剤 の種 類 と 濃 度 範 囲 を 明 らか に した.今 後,こ れ らの殺 菌 剤 を基 本培 地 に添 加 し,人 工 接種 土 壌 や 現地 の発 生 土壌 か ら ア イ リス黄 化腐 敗 病 菌 を 実際 に検 出 ・分離 し,こ の選 択 分離 培 地 の 有効 性 を 調 べ る心 要 が あ る. 摘要:本 実 験 は,Aphanomyces属 菌 を罹 病 組 織 か ら 分 離 す る 際 に 用 い られ て い るBacto-CMAと これ に 添 加 され て い る各種 の殺 菌 剤 を用 い,A.iridis卵 胞 子 の 発 芽 を調 べ た もの で あ る.得 られ た 結 果 は以 下 の と お りで あ る. 1.本 菌 の卵 胞 子 は顕 微 鏡(低 倍)下 で 容 易 に形 態 的 に完 全 と不 完 全 の卵 胞 子 に分 け る こ とが で きた. 2.FDLとCMDの 培 地 は完 全 な卵 胞 子 形 成 のた め の 良好 な 培地 で あ った.FDL培 地 で25℃,2週 間培 養 す る と,最 も高 い発 芽 率 を もつ 完 全 な卵 胞 子 が得 られ た. 3.卵 胞 子 の 発 芽 適 温 は25℃ 附 近,最 適pHは 約6.4 で あ っ た. 4.ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル は 用 い た100ppmま で の 濃 度 で 発 芽 阻 害 作 用 を 認 め な か っ た.同 様 に,ス ト レ プ ト マ イ シ ン硫 酸 塩 や バ イ コ マ イ シ ン も 用 い た 各80,400ppm ま で の 濃 度 で 阻 害 作 用 を 認 め な い か,反 復 す る と 中 間 の 濃 度 で や や 阻 害 的 で あ っ た. 5.ア ン フ ォ テ リシ ンB,ベ ノ ミル,イ プ ロ ジ オ ン は 各5,0.5,50-100ppm以 上 の 濃 度 で 明 ら か な 阻 害 作 用 を 認 め た.ベ ノ ミル は0.5-1ppmの 低 濃 度 で も 阻 害 力 を 保 持 し て い た.ま た,メ タ ラ キ シ ル は 用 い た 中 間 の 濃 度 で,チ ォ フ ァ ネ ー ト メ チ ル は10-50ppm以 上 の 濃 度 で 共 に 阻 害 的 で あ っ た. 引 用 文 献
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Plate I
1•`5: Morphologically complete oospores(Thick arrows -clearly observed walls; thin arrows
-normal oospheres)6: Morphologicall
y incomplete oospores (Thick arrows-wavy or almost
unrecognizable walls; thin arrows-granular or almost empty oospheres 7: Germinating oospore
