微生物によるバイオディーゼル廃グリセロールからの燃料生産

(1)

ホワイトバイオによる廃グリセロール

からのポリマー原料生産

プロセスの開発

筑波大学生命環境系

教授中島敏明

(2)

世界のBDF生産２，９００万トン (2014)

（日本植物油協会HPより）

原料油脂の10％生成

低炭素社会の確立のために・・・

バイオマス燃料

バイオディーゼル燃料(BDF)

＝軽油の代替燃料

メタノール

脂肪酸メチル

エステル（BDF）

グリセロール

植物油脂

（トリグリセリド）

NaOH

300万トン

焼却すると・・・・

４３０万トン

のCO

₂

(3)

1,3-propanediol(1,3-PD)

ポリマー原料

（ポリトリメチレンテレフタレートやポリ3-ヒドロキシプロピオン酸、ポリウレタン等） 市場規模約 650億円（2021） https://www.marketsandmarkets.com

・従来法（石油原料）

プロピレン→アクロレイン→

3-HP(アルデヒド）→1,3PD

・ホワイトバイオ（バイオマス利用）

グルコース

→グリセロール→

1,3PD

グルコースからの生産（食糧との競合、一次生産品の利用）

BDF廃棄グリセロールからの生産（廃棄物の利用と石油代替→二重の効果）

(4)

Citrobacter braakii

TB-96株

◦ TB-96株 ・以前、当研究室のプロジェクトで行った約400Lパイロットプラントスケールでの廃グリセロールからのエタノール生産試験で発生したコンタミ菌 ・非滅菌条件で優占化、1,3-プロパンジオール(1,3-PD)を生産

TB-96株は、1,3-PD生産において実用上優位

研究開始時の生産性：約32g/L 72時間

(5)

検討課題（JST ALCA)

１）生産の最適化

濃度を1.5-2倍（50-60gL）とするか

生産時間を30-50%短縮（1.5-2日）する

（0.91g/L/Hourを２倍以上に）

→培養条件の最適化・固定化菌体・連続発酵

２）代謝解析・育種

ドラフトゲノム解析とアノテーション

代謝経路の解明・ポイントの明確化

→ゲノム解析・

in silico

解析・代謝物の解析・メタボローム

３）コスト計算と総合評価

本菌株の生産性の目標値を具体的な数値として算出

→各種パラメーターの設定と数値解析

(6)

1)生産の最適化

・前培養条件の検討

・浮遊菌体

バッチ培養逐次添加

連続フィード

・固定化菌体

繰り返しバッチ培養

培地成分の低コスト化

連続培養

(7)

連続フィードの検討

0 5 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50 60 70 0 6 12 18 24 30 36 42 48 OD 580 Co n ce n tr atio n ( g /l) Time (h) 連続フィード 0 5 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50 60 70 0 6 12 18 24 30 36 42 48 OD 580 C o n cen trat io n ( g /l) Time (h) 逐次添加

12時間で30ｇ/L ・ 24時間で50ｇ/L

(8)

前培養

固定化培養

_{30℃, 18 h}

本培養

培地全量交換

固定化担体として不織布を使用

培地を新しい培地と

全量交換

し、

培養を

繰り返し

行う (

繰り返しバッチ培養

)

30℃, 9 h

_30℃

10-24 h

不織布

繰り返しバッチ培養

固定化菌体

(9)

純グリセロール

0 20 40 60 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 C o n cen tr ati o n (g /L ) Time (h) Glycerol 1,3-PD

繰り返しバッチ培養

生産量 23.2 g/L 生産速度 2.8 g/L/h 3.9 g/L/h

(10)

廃グリセロール

Crude Glycerol Pure Glycerol 0 20 40 60 0 10 20 30 40 50 C o n cen tr ati o n (g /L ) 0 20 40 60 0 10 20 30 40 50 60 Time (h) Glycerol 1,3-PD Glycerol 1,3-PD

繰り返しバッチ培養

生産量 22.7 g/L 生産速度 1.9→3.0 g/L/h 収率： 0.5 g/g glycerol

(11)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Con cent ration (g /l) Time (h)

Crude Glycerol

Glycerol 1,3-PD Lactate Formate

0 10 20 30 40 50 0 6 12 18 24 30 Con cent ration (g /l) Time (h)

Pure Glycerol

生産量： 25.2 g/L 生産速度： 2.1 g/L/Hour 収率： 0.59 g/g glycerol

培地成分の低コスト化

酵母エキスを25g/L→10g/Lに削減

生産量： 15.1 g/L (66%) 生産速度： 2.5 g/L/Hour (80%) 収率： 0.54 g/g glycerol （培地コスト 40％）

(12)

約

50 ml/Hour

で送・廃液

700ml/14Hour

本培養

培地量 700 ml

Batch Medium

_(g/l)

Yeast

extract

10 Glycerol

50,

100 連続発酵（低コスト培地）

(13)

0 10 20 30 40 50 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Con cent ration (g /l) Time (h)

Glycerol 50 g/l

0 10 20 30 40 50 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Con cent ration (g /l) Time (h)

Glycerol 100 g/l

連続発酵（低コスト培地）

生産量： 19.8 g/L 収率： 0.40 g/g glycerol 生産量： 25.8 g/L 収率： 0.26 g/g glycerol ・生産性は安定・生産量・収率に課題・条件検討（流速・培地）変異株の使用（後述）

(14)

ドラフトゲノム解析

アノテーション

代謝経路の解明・ポイントの明確化

遺伝子破壊系の構築

遺伝子破壊

破壊株による生産（バッチ培養）

２）代謝解析・育種

(15)

Glycerol

Pyruvate

D-lactate

Acetyl-CoA 3-Hydroxypropione aldehyde

1,3-Propanediol

TCA

cycle

NADH NAD+

ATP, NAD+ _ADP,_NADH

２ADP

NAD+

２ATP

NADH NADH NAD+

Ethanol

NADH NAD+

Formate

Acetate

ATP ADP NADH NAD+

Succinate

NADH NAD+ Dihydroxyacetone phosphate 取得済

代謝系の抽出と変異株取得

・乳酸生成系の破壊（ldh) ・ギ酸生成系の破壊（pfl)

(16)

0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 C o n cen tr ati o n (g /l ) Time (h)

ΔldhΔpfl

Δldh

Control

副産物の抑制・生産性の向上

破壊株による生産（バッチ培養）

生産量： 74.2 g/L

生産速度： 2.0 g/L/Hour 収率： 0.65 g/g

(17)

コスト試算

参考 Molel, E., Phillips, H., and Smith, A., 1,3-Propanediol from Crude Glycerol, Senior Design Reports (CBE) 74, Department of Chemical & Biomolecular Engineering,

University of Pennsylvania 2015. 注：PDO=1,3-PD

発酵槽15,000L, 運転時間8,000時間/年 1,3-PDの精製純度を99.98%として算定 1,3-PD市場価格は110～240円/kg（純度99～99.5%）

(18)

既存プロセスとの比較

引用：須藤正夫，「21世紀初の超大型ポリマーPTT」，「工業材料」（日刊工業新聞社）,2002年6月号, http://cmcre.com/archives/764/ 上記出典:マルチクライアント調査「1,3－PDO,PTTの製造,用途および経済性」より作成；シーエムシー出版，2000年8月完了）

(19)

C

₃

ポリマー原料の生産

Target1

1,3-プロパンジオール（1,3-PD）

→ポリトリメチレンテレフタレート

Target2

3-ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）

→ポリ-3-ヒドロキシプロピオン酸

→アクリル酸→ポリアクリル酸

・従来法（石油原料）

プロピレン→アクロレイン→

3-HP(アルデヒド）→1,3PD

アクリル酸

・ホワイトバイオ（バイオマス利用）

グリセロール→

1,3PD

→

3HP

→

アクリル酸

グルコースからの生産（食糧との競合、一次生産品の利用）

BDF廃棄グリセロールからの生産（廃棄物の利用と石油代替→二重の効

果）

世界生産量500万トン（2013）日本触媒IR資料より

(20)

構想：細菌と酵母のコラボレーション

Citrobacter braakii

TB-96株

Candida rugosa

BDF廃グリセロール

1,3-PD

3-HP

BDF廃グリセロールもOK コンタミ耐性！パイロットスケール実証済？休止菌体反応が可能 100％の変換効率（C₄で実証済み）細菌酵母嫌気好気

ホワイトバイオによる3-HP（→アクリル酸）生産のブレークスルー

通気の必要（嫌気・好気2段階反応）

(21)

提供できる技術

現状

• TB-96株（野生株）

• Δldh株

• Δpfl株

• ΔldhΔpfl株

今後

• 他の破壊株・増強株・その他変異株

• 誘導体生産法・生産株

（共同出願希望）

成果有体物

（筑波大学）

(22)

産学連携の経歴

パナック工業（株）2014年度～酵素による光学用ポリエステルフィルムのコート層の剥離に関する研究東亞合成（株） 2012～2015年度バイオ化成品生産性向上遺伝子取得法の確立に関する研究ハイファ・ケミカルLtd.（イスラエル） 2010～2011年度

Microbial degradation of novel biodegradable polyurethanes （新規生分解性ポリウレタンの微生物分解に関する研究）東京瓦斯（株） 2007～2009年度発酵に関する共同研究三菱化学（株） 2007～2008 ポリマーの微生物分解又は酵素分解に関する研究（有）エス・ジー・ラボラトリ 2006（単年度）新規リゾビウム属細菌が生産するカタラーゼの精製フクイバイオケミカル（株） 2006（単年度）チロシナーゼ活性を阻害する作用を有する物質の精製

(23)

微生物による バイオディーゼル廃グリセロール からの燃料生産

ホワイトバイオによる廃グリセロール

からのポリマー原料生産

プロセスの開発

筑波大学 生命環境系

教授 中島敏明

世界のBDF生産 ２，９００万トン (2014)

原料油脂の10％生成

低炭素社会の確立のために・・・

バイオマス燃料

バイオディーゼル燃料(BDF)

＝軽油の代替燃料

メタノール

脂肪酸メチル

エステル（BDF）

グリセロール

植物油脂

（トリグリセリド）

300万トン

焼却すると・・・・

４３０万トン

のCO

1,3-propanediol(1,3-PD)

ポリマー原料

・従来法（石油原料）

プロピレン→アクロレイン→

3-HP(アルデヒド）→1,3PD

・ホワイトバイオ（バイオマス利用）

グルコース

→グリセロール→

1,3PD

BDF廃棄グリセロールからの生産（廃棄物の利用と石油代替→二重の効果）

Citrobacter braakii

TB-96株

TB-96株は、1,3-PD生産において実用上優位

研究開始時の生産性：約32g/L 72時間

検討課題（JST ALCA)

１）生産の最適化

濃度を1.5-2倍（50-60gL）とするか

生産時間を30-50%短縮（1.5-2日）する

（0.91g/L/Hourを２倍以上に）

→培養条件の最適化・固定化菌体・連続発酵

２）代謝解析・育種

ドラフトゲノム解析とアノテーション

代謝経路の解明・ポイントの明確化

→ゲノム解析・

in silico

解析・代謝物の解析・メタボローム

３）コスト計算と総合評価

本菌株の生産性の目標値を具体的な数値として算出

→各種パラメーターの設定と数値解析

1)生産の最適化

・前培養条件の検討

・浮遊菌体

バッチ培養 逐次添加

連続フィード

・固定化菌体

繰り返しバッチ培養

培地成分の低コスト化

連続培養

連続フィードの検討

12時間で30ｇ/L ・ 24時間で50ｇ/L

前培養

固定化培養

30℃, 18 h

本培養

培地全量交換

固定化担体として不織布を使用

培地を新しい培地と

全量交換

し、

培養を

繰り返し

行う (

繰り返しバッチ培養

)

30℃, 9 h

30℃

10-24 h

不織布

微生物によるバイオディーゼル廃グリセロールからの燃料生産

筑波大学生命環境系

教授中島敏明

世界のBDF生産２，９００万トン (2014)

バッチ培養逐次添加

_{30℃, 18 h}

_30℃

_(g/l)

₃