Database Center for Life Science Online Service Masami Horikoshi, Ryosuke Himukai, Takashi Kuzuhara,

1195 蛋 白 質 核 酸 酵素Vol.49No.8(2004)

Short Review

蛋白質構造変換酵素FKBPに

よる遺伝子

発現制御機構

堀越正美 ・日向亮介 ・葛原 隆

新 しい 遺 伝 子 発 現 制 御機 構 を生 み 出す に は,こ れ ま で にな い 活 性 をも つ ドメ イ ン ・因 子 ・酵 素 あ る い は複 合 体 の 登 場 が必 要 不 可 欠 で あ る.ヌ ク レオ ソー ム,ク ロマ チ ン,そ して 染 色 体 の 構 造 変 換 活 性 は,染 色 体 機 能 領 域 の 形 成 機 構 を 考 え る うえ で 避 けて 通 れ な い 活 性 で あ る 、免 疫 抑 制 剤FK506の 結 合 蛋 白質FKBPは,ペ プ チ ジル プ ロ リル シス トラ ン スイ ソメ ラ ー ゼ(PPIase) 活 性 を も つ.新 しい タ イ プの ク ロマ チ ン 因 子 の 候 補 と して核 型FKBPを 取 り上 げ,そ のN末 端 側 領 域 の 化 学 的 性 質 に着 目 した.解 析 の結 果,核 型FKBPのN末 端 側 領 域 は従 来 と は異 な る 性 質 を も つ ヒス トン シ ャペ ロン 活 性 を 有 す る こ と が判 明 した.ま た,ヘ テ ロ ク ロマ チ ン 領 域 を 形 成 し細 胞 増 殖 ・老 化 の 中心 的存 在 と し て に わ か に 注 目 を浴 び て い るrDNA領 域 で の サ イ レ ン シ ング 反 応 に核 型FKBPが 関与 し,そ のPPlaseド メ イ ン が サ イ レン シ ン グ 活 性 を 制 御 して い る こ と も見 い だ した.こ れ らの 知 見 は,染 色 体 機 能 領 域 の 形 成 を 考 え る うえ で 新 しい1ペ ー ジ を 書 き 加 え る こ と に な った. FK506結 合 蛋 白 質(FKBP)ペ プ チ ジ ル プ ロ リル シ ス トう ン ス イ ソ メ ラ ー ゼ (PPlase)ヒ ス トンシ ャペ ロ ンrDNAサ イ レン シ ン グ 染 色 体 機 能 領域 は じめ に 1961年 のJacob,Monodに 始 ま る 遺 伝 学 を 中 心 と し た 遺 伝 子 発 現 制 御 機 構 論1)は,1960∼1980年 代 の Ptashneを 代 表 と す る,実 体 を 重 視 し た 生 化 学 的 解 析 を 中 心 と し,原 核 生 物,フ ァ ー ジ,お よ び 出 芽 酵 母 に お け る 単 純 さ を 追 求 し た 遺 伝 子 発 現 制 御 機 構 論2),そ し て, 1970∼1990年 代 のRoederを 代 表 とす る,真 核 生 物 に お け る 多 様 性 を 追 求 し た 遺 伝 子 発 現 制 御 機 構 論3)と し て 発 展 を 遂 げ た.エ ン ハ ン サ ー 作 用 機 構 な ど の 問 題 は 解 決 さ れ て い な い も の の,こ れ ら は 裸 のDNAを 用 い,DNA-転 写 因 子 間,い,DNA-転 写 因 子-転 写 因 子 間 相 互 作 用 を 中 心 に 解 析 さ れ た 遺 伝 子 発 現 制 御 機 構 論 と し て,お お よ そ の 全 体 像 は 明 ら か に な っ て い る. 1970年 代 か ら,遺 伝 子DNAと ヒ ス ト ン と の 複 合 体 で あ る ヌ ク レ オ ソ ー ム 構 造 を 中 心 と し た 解 析 論4)が Kornbergを 代 表 と し て 始 ま り,1990年 代 後 半 か ら は さ ま ざ ま な ク ロ マ チ ン 因子 が 単 離 ・解 析 さ れ て,Allisを 代 表 とす る,ヒ ス トンの 化 学 修 飾 か ら生 命 化 学 反 応 まで を説 明 し よ う とす る 「ヒ ス トン コ ー ド」表 作 成5)を通 し, ヌ ク レオ ソー ム構 造 変換 レベ ル で の 遺 伝 子 発 現 制 御 機 構 論 の完 成 に向 け,今 も多 くの 研 究 者 に よ る研 究 競 争 が 繰 り広 げ られ て い る.こ れ らは,ヌ ク レ オ ソ ー ムーヌ ク レ オ ソ ー ム構 造 変 換 因子 間,ヌ ク レ オ ソー ム構 造 変換 因子-ヌ ク レオ ソー ム構 造 変 換 因 子 間 相 互 作 用 を 中心 と した 遺 伝 子 発 現 制 御 機 構 論 と な っ て い る. さ らに 高 次 な 構 造 で あ る ク ロマ チ ン,お よ び染 色 体 レ ベ ル で の構 造 領 域 で あ るユ ー ク ロ マ チ ン ・ヘ テ ロ ク ロマ チ ンの 問題 は,機 能 領 域 と して捉 え た 染 色 体 活 性 領 域 お よ び 不 活 性 領 域,す な わ ち,染 色 体 機 能 領 域 お よ び境 界 領 域 の 形 成 機 構 の 問 題 と 考 え る こ と が で き る.裸 の DNAあ る い は ヌ ク レオ ソー ム レベ ル で の 遺 伝 子 発 現 制 御 研 究 に比 べ 解 析 が 遅 れ て い る もの の,こ の 問 題 は,バ

Masami Horikoshi, Ryosuke Himukai, Takashi Kuzuhara, 東京大学分子細胞生物学研究所 E-mail : horikosh@iam.u-tokyo.ac.jp http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/homasami/

Mechanisms of gene regulation centered on peptidyl prolyl cis-trans isomerase

1196 蛋 白質 核 酸 酵 素Vol.49No.8(2004) ウ ン ダ リ ー エ レ メ ン ト(boundary element)や イ ン ス レ ー タ ー(insulator)と い っ た 境 界 領 域 形 成 因 子 か ら 出 発 す るFelsenfeldを 代 表 と す る 考 え 方6)と,染 色 体 機 能 領 域 か ら 出 発 す る 筆 者 ら の 考 え 方7,8)の 両 面 か ら 説 明 が 行 な わ れ よ う と し て い る.こ の よ う な 研 究 で 解 析 さ れ る べ き 対 象 は,DNA-ヒ ス ト ン 間 相 互 作 用 だ け で な く,多 様 な ピ ス ト ン結 合 因 子 を 含 む さ ま ざ ま な タ イ プ の 蛋 白 質-蛋 白 質 問 相 互 作 用 で あ り,そ の 複 雑 さ は 計 り し れ な い. 筆 者 ら は,こ の よ う な 遺 伝 子 発 現 制 御 機 構 論 構 築 の 歴 史 的 背 景 を ふ ま え,よ り新 し く,よ り深 く,よ り広 く研 究 を 展 開 す る た め,独 自 の 戦 略 で 新 し い タ イ プ の 因 子 を 多 数 単 離 し解 析 を 進 め て き た9).そ し て,転 写 基 本 因 子 と 相 互 作 用 す る 因 子 と し て 単 離 し たFK506結 合 蛋 白 質 (未 発 表)の 非PPIaseド メ イ ン が ク ロ マ チ ン 関 連 活 性 を 有 す る こ と,テ ロ メ ア 領 域,HMRお よ びHML領 域(接 合 型 遺 伝 子 領 域),動 原 体 領 域 に 続 い て,第4の サ イ レ ン シ ン グ 領 域 と し て 発 見 さ れ たrDNA領 域 の サ イ レ ン シ ン グ 反 応 に 関 与 す る こ と,そ し て,PPIaseド メ イ ン は そ のrDNAサ イ レ ン シ ン グ 活 性 を 制 御 し て い る こ と を 突 き止 め た10).ま た,rDNA領 域 で の サ イ レ ン シ ン グ 反 応 は 細 胞 増 殖 ・老 化 に お い て 中 心 的 な 役 割 を 果 た し て い る こ と11)か ら,こ こ で は そ の よ う な 視 点 か ら も議 論 す る. Ⅰ.FKBPに 関 する歴 史 的背 景 ・研 究 臓 器 移 植 や ア トピー 性 皮 膚 炎 な ど の 免 疫 疾 患 の 治 療 に は免 疫 細 胞 の 活 性 化 を抑 制 す る 薬 剤 が 必 要 で あ る.FK 506は,藤 沢 薬 品 工 業 が 混 合 リ ンパ 球 検 定 系 を用 い て 筑 波 山 に 生 育 す る放 線 菌 よ り単 離 ・同 定 した 免 疫 抑 制 剤 で あ る12)(図1a).FK506の 免 疫 抑 制 作 用 はT細 胞 に お け る シ グ ナ ル伝 達 経 路 を 阻 害 す る こ とに よ っ て発 揮 され る こ とが 明 らか に さ れ て い る13).FK506の 作 用 機 構 を 解 明 す る た めFK506結 合 蛋 白 質FKBP(FK506 binding protein)が 単 離 ・精 製 さ れ た.そ の 生 化 学 的 活 性 を 検 討 し た と こ ろ,従 来 の 免 疫 抑 制 剤 シ ク ロ ス ポ リ ンAに 結 合 す る シ ク ロ フ ィ リ ン と 同 じ よ う に,ペ プ チ ジ ル プ ロ リ ル シ ス ト ラ ン ス イ ソ メ ラ ー ゼ(PPIase)活 性 を 有 す る 蛋 白 質 で あ る こ と が 判 明 し た14,15).FKBPの 構 造 をFK506 と の 複 合 体 と し て 図1bに 示 す16).FKBPは 原 核 生 物 か ら 多 細 胞 生 物 ま で 幅 広 く存 在 す る こ と17)か ら 生 物 機 能 に と っ て 基 本 的 な 因 子 で あ る と 考 え ら れ る が,一 方 で 生 存 に は 必 須 で は な い と い っ た 知 見 も あ る18).FKBPは 多 様 な フ ァ ミ リー を形 成 し,細 胞 内 の さ ま ざ ま な場 所 に局 在 す る こ とか ら,多 様 な 場 所 で 多 様 な標 的 蛋 白 質 に作 用 し て い る と考 え られ る. FK506の 免 疫 抑 制 作 用 機 構 を 解 明 す る た め,FK506 と細 胞 質 型FKBPで あ るFKBP12と の 複 合 体 に 相 互 作 用 す る因 子 が 単 離 ・解 析 さ れ,こ の複 合 体 に は カ ル シ ウ ム依 存性 脱 リ ン酸 化 酵 素 カ ル シニ ュ ー リ ンが 結 合 し,そ の脱 リ ン酸 化 酵 素 活 性 が 阻 害 され る こ とが 判 明 した13). 転 写 因子NF-ATは カ ル シ ニ ュ ー リ ンに よ り脱 リ ン酸 化 さ れ て核 に移 行 し,そ こ で 免 疫 細 胞 を活 性 化 す る 因 子 で あ る イ ン ター ロ イ キ ン2の 遺 伝 子 発 現 を オ ン にす る19). で は,FK506が 作 用 しな い 場 合 のFKBP本 来 の作 用 と そ の 標 的蛋 白 質 は何 だ ろ うか?小 胞 体 膜 上 の カ ル シ ウ ム チ ャ ネ ル が 精 製 さ れ た 際 にFKBP12が 共 精 製 さ れ, そ の 結 果 を利 用 した解 析 に よ り,FKBP12の 薬 剤 非 依存 的 な 標 的 蛋 白 質 の1つ は カ ル シ ウ ム チ ャネ ル で あ り,そ の 活 性 を生 化 学 的 ・細 胞 生 物 学 的 に制 御 して い る こ とが 判 明 した20).ま た,ノ ッ ク ア ウ トマ ウス の 作 製 を通 して 心 臓 の カ ル シ ウ ム 動 態 へ の 関 与 が 証 明 され た21). Ⅱ.PPIaseフ ァミ リー に関す る歴 史的 背景 FKBPの 有 す るPPIase活 性 は,プ ロ リ ン の イ ミ ド結 合 のcisとtransを 変 換 す る も の で あ り,蛋 白 質 の 主 鎖 の 向 き を 大 き く 変 換 す る16)(図1c).フ ォ ー ル デ ィ ン グ 図1 FK506とFKBPお よ びPPIaseフ ァ ミ リー (a)FK506の 立 体 構 造.(b)FK506-FKBP複 合 体 の 立 体 構 造.(c) プ ロ リ ン のcis型,trans型 変 換.[a,bは 文 献16を も と に 作 成]

1197 蛋 白質 核 酸 酵 素Vol.49No.8(2004) が 整 っ た 蛋 白 質 に はcis-プ ロ リ ン が 存 在 す る も の の,新 規 に 翻 訳 さ れ た ペ プ チ ド鎖 が も つ の はtrans-プ ロ リ ン の み で あ る こ と が 知 ら れ て い る17).こ の こ と は,tran-プ ロ リ ン とcis-プ ロ リ ン を 変 換 す る 酵 素 が 存 在 し う る こ と を 示 唆 す る.そ の 予 測 に 基 づ い て,PPIase活 性 を 指 標 に そ の 活 性 を 担 う 成 分 の 単 離 が 行 な わ れ た.精 製 さ れ た 蛋 白 質 の1次 構 造 を 決 定 し た と こ ろ,シ ク ロ ス ポ リ ン Aの 標 的 蛋 白 質 シ ク ロ フ ィ リ ン と 同 一 で あ る こ と が 判 明 し た22,23).ま た,FKBPがPPIaseで あ る こ と は 先 に 述 べ た よ う に 証 明 さ れ て い る14,15).PPIaseは1次 構 造 の 違 い と 阻 害 剤 の 違 い に よ り,お も に3つ の 大 き な フ ァ ミ リ ー に 分 類 さ れ る17).FK506に 結 合 す る 因 子 がFKBP フ ァ ミ リ ー,シ ク ロ ス ポ リ ンAに 結 合 す る も の が シ ク ロ フ ィ リ ン フ ァ ミ リ ー,ど ち ら に も 結 合 し な い も の が Pin1/Ess1フ ァ ミ リ ー で あ る.3者 のPPIaseド メ イ ン に は1次 構 造 お よ び3次 構 造 上 の 明 確 な 類 似 性 は な く,そ れ ぞ れ 基 質 特 異 性 も 異 な る17). PPIase研 究 の 代 表 選 手 と し て,シ ク ロ フ ィ リ ン フ ァ ミ リ ー の う ち シ ク ロ フ ィ リ ン,お よ び,Pin1/Ess1フ ァ ミ リ ー の う ちPin1に つ い て 説 明 を 加 え る.免 疫 抑 制 剤 シ ク ロ ス ポ リ ンAに 結 合 す る シ ク ロ フ ィ リ ン フ ァ ミ リ ー はAla-Proを _{基 質 と し て 認 識 す る22,23).PPIaseド メ} イ ン 以 外 の 付 加 的 な ド メ イ ン に 多 様 性 が あ る た め,分 子 量15K∼360Kの 多 様 な フ ァ ミ リ ー と し て 存 在 す る.シ ク ロ フ ィ リ ン はFKBPと 同 様,シ ク ロ ス ポ リ ンA依 存 的 に カ ル シ ニ ュ ー リ ン に 結 合 し,そ の 脱 リ ン酸 化 酵 素 活 性 を 阻 害 す る こ と に よ り免 疫 抑 制 効 果 を 発 揮 す る こ と が 知 ら れ る23,24).Pin1は 核 に 局 在 し,細 胞 分 裂 制 御 に 関 与 す る こ と が わ か っ て い る26).こ の フ ァ ミ リ ー は リ ン 酸 化Ser/Thr-Proを 認 識 し,PPIaseド メ イ ン 以 外 にWW ド メ イ ン を 有 し て い る27).WWド メ イ ン は リ ン 酸 化Ser /Thr-Proに 結 合 す る ド メ イ ン で あ り,PPIaseド メ イ ン の 基 質 特 異 性 と も よ く 対 応 す る.こ の 標 的 蛋 白 質 と し て,細 胞 周 期 調 節 蛋 白 質 で あ るCdc25,tauな ど が 知 ら れ て い る28). Ⅲ.FKBPに着 目 した理 由 以 前 に も記 した よ う に9),正 の転 写 制 御 因子 の うち 進 化 的 に 最 も保 存 さ れ た転 写 基 本 因 子 群 な ど をベ イ トと し て 利 用 し,酵 母two-hybridシ ス テ ム に よ りそ れ らの 相 互 作 用 因 子 と して ク ロマ チ ン関 連 因 子 を得 て 解 析 を行 な っ て きた(文 献7,29∼45),およ び,未 発 表)(図2).そ の な か で,TFIIDのCCG1サ ブ ユ ニ ッ トの 最 保 存 領 域 を用 い て 得 た 多 くの 因 子 の う ち の1つ がFKBPフ ァ ミ リー に属 す る もの で あ っ た(未 発 表).FKBPは 進 化 上 高 度 に 保 存 され て い る 因 子 で あ り,ま た,既 知 因 子 で あ りなが ら,単 離 され た1994年 当時 はFK506に よ る免 疫 抑 制 に 関 す る機 構 解 明 以 外 の 研 究 は 少 な く,FKBP本 来 の 生 化 学 的作 用 ・生 物 学 的 作 用 に 関 す る 研 究 は ほ とん ど行 な わ れ て い な い 状 況 に あ っ た. FKBPがPPIaseで あ る こ と,す な わ ち,蛋 白 質 構 造 変 換 酵 素 で あ る こ とか ら,(1)蛋 白 質-蛋 白 質 間,DNA-蛋 白 質 問 相 互 作 用 が 中 心 とな る遺 伝 子 発 現 制 御 反応,広 くは生 体 内 制 御 反 応 全 般 に 関 与 す る可 能 性,(2)蛋 白 質 構 造 変 換 機 構 の モ デ ル 因 子 と して の 有 用 性,ま た,原 核 生 物 か ら多 細 胞 生 物 に 至 る まで 進 化 的 に保 存 さ れ て い る こ とか ら,(3)生 命 活 動 に お け る 基 本 的 活 性 を 有 し て い る可 能 性,(4)そ れ に も か か わ ら ず 生 存 に必 須 で は な い こ との 生 物 学 的 意 味 な ど,興 味 を 引 か れ る 論 点 が 多 く, そ れ らの 解 明 は 多 方 面 で 大 きな新 しい 道 を切 り開 くで あ ろ う と考 え た.こ こで は,FKBPの 核 内 に お け る生 化 学 的 役 割 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と した 研 究 を 紹 介 す る. 図2 転 写基 本因 子群 との 相互 作 用 活性 を指標 とす る単 離 法 に よ って 得 た,進 化 的 に保 存 さ れ た 機 能 未知 因 子3例 の 生 化 学的 機能 解明

1198 蛋 白 質 核 酸 酵素Vol.49No.8(2004)

Ⅳ.FKBPの

構造と局在性

転 写 基 本 因子 の 相 互 作 用 因 子 の1つ と して ヒ トFKBP を 単 離 した(未 発 表)が,遺 伝 学 的 ・生 化 学 的 な解 析 が 容 易 で あ る 酵 母 に お け る 新 規 核 型FKBPも 単 離 し,解 析 を始 め た32).以 下,こ の核 型FKBPに つ い て紹 介 す る. FKBPフ ァ ミ リー は 細 胞 内 の 多 様 な 場 所 に存 在 す る こ と か ら,多 様 な場 所 で 多 様 な基 質 を 認 識 す る と 考 え ら れ る.そ こで,こ れ らFKBPフ ァ ミ リー が もつPPIaseド メ イ ンの 分 子 系 統 樹 を作 成 し分 類 した と ころ,こ れ は細 胞 内 局 在 に よ る分 類(お も に核,細 胞 質,小 胞 体,核 と 細 胞 質 に局 在 す る グ ル ー プ)と 一 致 す る こ と を 見 い だ し た.新 規 に単 離 し たFKBPが 核 局 在 性 を 示 す こ と が こ こか ら予 想 さ れ た の で,蛍 光 抗 体 法 に よ り検 討 した と こ ろ実 際 に核 に局 在 して い る こ とが 判 明 し,予 測 が 実 証 さ れ た. 次 にPPIaseド メ イ ン以 外 の ドメ イ ン に注 目 した と こ ろ,PPIaseド メ イ ン に よ り分 類 して 見 い だ され た グ ル ー プ に対 応 して ,付 加 的 な ドメ イ ンの構 造 的 特 徴 も分 類 さ れ る こ とが わ か っ た(図3).核 型FKBPはN末 端 領 域 に 長 い ドメ イ ン を有 す る.そ の 領 域 に は,進 化 的 に高 く保 存 さ れ た ドメ イ ン,高 酸 性 ドメ イ ン,高 塩 基性 ドメ イ ンな どが 見 い だ され た.保 存 ドメ イ ンに は対 応 した 特 定 の 相 互 作 用 因子 の 存 在 が 考 え られ る.高 酸 性 ドメ イ ン お よ び 高 塩 基 性 ドメ イ ンの そ れ ぞ れ の 相 互 作 用 の相 手 と して,塩 基 性 物 質 で あ る ピ ス トン や 酸 性 物 質 で あ る DNAな どが 考 え ら れ,核 型FKBPはDNAや ピ ス トン か ら な る ヌ ク レ オ ソ ー ム に 相 互 作 用 して働 くの で は な い か と考 え た, Ⅴ.ヒ ス トンシ ャペ ロン と して の核 型FKBP 前 述 の 理 由 か ら,核 型FKBPの ピ ス ト ン とDNAへ の 相 互 作 用 を想 定 し,ピ ス トン とDNAか ら形 成 さ れ る ヌ ク レ オ ソ ー ム構 造 の 形 成 活 性 に 核 型FKBPは 関 与 す る の で は な い か と 考 え そ の 活性(ヒ ス トン シ ャペ ロ ン活 性)を 検 討 した.超 らせ ん 化 活 性 を検 討 した と こ ろ,ピ ス トン依 存 的 に そ の 活 性 が 見 い だ さ れ た(図4a).超 ら せ ん 化 ア ッ セ イ はDNAの ね じれ を観 察 して い る た め, ヌ ク レオ ソー ム 形 成 活 性 に関 す る 別 の ア ッセ イ系 で あ る MNase切 断 活 性 に よ る 検 討 も加 え た.そ の 結 果,1個 も し く は2個 の ヌ ク レ オ ソ ー ム 様 構 造 に 対 応 す るDNA が 観 察 され た(図4b).両 活 性 に よ り,核 型FKBPが ヒ ス トン シ ャ ペ ロ ン活 性 を有 す る と結 論 づ け た. 従 来 の ヒス ト ンシ ャペ ロ ンが お も に酸 性 蛋 白 質 で あ る の と異 な り,核 型FKBPは 高 酸 性 ドメ イ ンば か りで な く高 塩 基 性 ドメ イ ン と酵 素 活性 を もつPPIaseド メ イ ン を も有 す る こ とか ら,ヒ ス トン シ ャペ ロ ン活 性 と して の 作 用 機 構 も従 来 の ヒ ス トンシ ャペ ロ ン と は 異 な る こ とが 予 想 さ れ た.さ らに,蛋 白質 精 製 の過 程 で 用 い た 陰 イ オ ン交 換 カ ラ ム に 結 合 す る こ とか ら,DNAの よ う な 酸 性 分 子 と相 互作 用 す る こ と も予 想 さ れ た.そ こ で,ヒ ス ト ン と の 前 処 理 に よ る効 果 を検 討 し た と こ ろ,NAP-1を 代 表 とす る従 来 の ヒ ス トン シ ャペ ロ ン とは 異 な り,ヒ ス トン シ ャペ ロ ン活 性 を検 出 す るの に前 処 理 を必 要 と しな か っ た.こ の こ と は,従 来 とは性 質 の 異 な る新 しい タイ プの ヒス トン シ ャペ ロ ンで あ る こ と を示 して い る. 図3 FKBPの 構 造 と細 胞 内 局 在 の 関 連 性 [文献32か ら許 可 を 得 て転 載]

1199 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.49NoⅣ8(2004) Ⅵ.ヒ ス トン シ ャペ ロ ン ドメ イ ン とPPIaseド メ イ ンの 独立 性 FKBPの ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 が 核 型FKBPに 特 異 的 か ど う か を 検 討 し た.細 胞 質 型FKBPに は ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 は な く,核 型FKBPに は 活 性 の あ る こ と が わ か っ た(図5a).し た が っ て,核 型FKBPに 特 異 的 で あ るN末 端 側 領 域 に ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 が あ る と 推 定 し た.次 に,PPIase活 性 が ヒ ス トン シ ャ ペ ロ ン 活 性 に 必 要 か ど う か を 検 討 し た.PPIase活 性 を 阻 害 す るFK506に よ り ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 が 阻 害 さ れ る か ど う か を 検 討 し た と こ ろ,FK506は ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン活 性 を 阻 害 し な い こ と が 判 明 し た(図5b). 上 記2つ の 実 験 か ら,核 型FKBPのN末 端 側 領 域 に あ る 非PPIaseド メ イ ン の み で ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン活 性 が 発 揮 さ れ る こ と が 予 想 さ れ た.そ こ で,核 型FKBP の 欠 失 変 異 体 を 作 成 し,そ のN末 端 側 領 域 だ け で ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 を 示 す か ど う か を 検 討 し た と こ ろ, 核 型FKBPに 特 異 的 なN末 端 側 領 域 が ヒ ス トン シ ャ ペ ロ ン活 性 に 必 要 十 分 で あ る こ と が 判 明 し た(図5c).以 上3つ の 実 験 か ら,核 型FKBPはN末 端 側 の ピ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン ド メ イ ン とC末 端 側 のPPIaseド メ イ ン の2 つ の 独 立 し た ド メ イ ン か ら な る 蛋 白 質 で あ る こ と が わ か っ た. Ⅶ.核 型FKBPのrDNAサ イ レン シ ング 反 応 へ の 関与 生 体 内 で の 核 型FKBPの ク ロ マ チ ン関 連 反 応 に お け る役 割 を検 討 した.出 芽 酵 母細 胞 にお い て は,テ ロ メ ア 領 域,HMRお よ びHML領 域(接 合 型 遺 伝 子 領 域),あ る い はrDNA領 域 に お い て ヘ テ ロ ク ロマ チ ン様 の構 造 体 が 形 成 さ れ,遺 伝 子 発 現 が サ イ レ ンシ ング を受 け て い る こ とが わ か っ て い る46).ま ず 核 型FKBPの 細 胞 内 局 在 性 を 再 検 討 し た と こ ろ,核 小 体 に 濃 縮 さ れ て い る こ と が わか っ た.さ ら に ク ロマ チ ン免 疫 沈 降 法 に よ り,核 型 FKBPはrDNA領 域 に 局 在 して い る こ とが 見 い だ さ れ 図4 核 型FKBPの ヒ ス トン シ ャ ペ ロ ン 活 性 (a)核 型FKBPの ヒス トン シ ャペ ロ ン活 性(超 らぜ ん 化ア ッセ イ) (b)核 型FKBPの ヒス トン シ ャ ペ ロ ン 活 性(MNaseア ッ セ イ) [文献10か ら転 載] 図5 核 型FKBPに 特異 的 で あるN末 側 領域 の ヒス トン シ ャ ペ ロ ン 活 性 に 対 す る 必 要 十 分 性 (a)核 型FKBPと 細 胞 質 型FKBPの ヒス トン シ ャ ペ ロ ン 活 性. (b)核 型FKBPの ヒス トン シ ャペ ロ ン活 性 に対 す るpprasa阻 害 剤FK506の 効 果.(c)核 型FKBPの 欠 失 変 異 体 の ヒ ス トン シ ャペ ロ ン活 性.[文 献10か ら転 載]

1200 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.49No.8(2004) た.こ れ ら の 知 見 と ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン で あ る と い う 生 化 学 的 活 性 の 知 見 か ら,核 型FKBPはrDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 に 関 与 す る の で は な い か と 考 え た.そ こ で, 核 型FKBPの 欠 失 変 異 体 か ら な る 酵 母 細 胞 株 を 作 成 し,rDNA領 域 に 組 み 込 ま れ た レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 を 用 い てrDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 活 性 を 検 討 し た と こ ろ,核 型FKBPの 欠 失 に よ りrDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 活 性 が 解 除 さ れ る こ とが わ か っ た(図6a). 次 に,核 型FKBPの ど の 領 域 がrDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 に 関 与 す る か を 解 析 し た.核 型FKBPの 欠 失 変 異 体 か ら な る 酵 母 細 胞 株 で,核 型FKBPの 全 長,N末 端 側 の ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン ド メ イ ン,も し く はC末 端 側 のPPIaseド メ イ ン を,核 型FKBP自 身 の プ ロ モ ー タ ー か ら 発 現 させ た と こ ろ_{,全 長 あ る い は ヒ ス ト ン シ ャ ペ} ロ ン ド メ イ ン の 発 現 に よ りrDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 活 性 は 回 復 を 示 し た も の の,PPIaseド メ イ ン の 発 現 で は 活 性 の 回 復 は み ら れ な か っ た(図6b).し た が っ て, rDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 に は ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン ド メ イ ン だ け で 十 分 で あ る こ と が 判 明 し た.こ の こ と は, 核 型FKBPが ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 を 通 し てrDNA サ イ レ ン シ ン グ 反 応 に か か わ っ て い る こ と を 示 し て い る. Ⅷ.PPIaseド メ イ ン に よ るrDNAサ イ レ ン シ ン グ反応 制 御 核 型FKBPのPPIaseド メ イ ン はrDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 に 必 須 で は な い と 判 明 し た が,PPIase活 性 は rDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 に ど の よ う に か か わ っ て い る の だ ろ う か?PPIase活 性 中 心 部 位 にPPIase活 性 が 低 下 す る 点 変 異 を 導 入 し,PPIase活 性 のrDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 へ の 役 割 を 検 討 し た と こ ろ,こ の よ う な 点 変 異 に よ りrDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 活 性 が 増 強 さ れ る こ と が 判 明 した(図7a,b). 次 に,こ の 点 変 異 体 が ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 の 制 御 に か か わ る か 否 か を 検 討 し た と こ ろ,ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 に は 大 き く影 響 を 与 え な い こ と が 判 明 し た(図7a, c).し た が っ て,PPIase活 性 は ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン活 性 に 効 果 を も た ら す も の で は な く,ほ か の タ イ プ の ク ロ マ チ ン 関 連 因 子 な ど と の 相 互 作 用 を 通 し てrDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 の 制 御 に 関 与 す る こ と が 考 え ら れ た(図8). 図6 核 型FKBPとrDNAサ イ レ ン シ ン グ反 応 (a)野 生株 と 核 型FKBP欠 失 株 のrDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 活 性.(b)核 型FKBPの ドメ イ ン 変 異 体 に よ るrDNAサ イ レ ン シ ン グ反 応 活 性 の 回復.核 型FKBP欠 失 株 に 、核 型FKBP全 長(野 生 株),ヒ ス トン シ ャペ ロ ン ドメ イ ン(ΔC),あ る い はPPIaseド メ イ ン(ΔN)を 発 現 さ せ た.[文 献10か ら転載] 図7 PPIaseド メ イ ン とrDNAサ イ レン シ ン グ 反 応 (a)PPIaseド メ イ ン 中 のPPIase活 性 に 重 要 な ア ミ ノ酸 残基 の 位置.(b)PPIaseド メイ ン中の 点 変 異 体 に よ るrDNAサ イ レン シ ン グ反 応の 制 御 活性 の 検 討.核 型FKBP欠 失 株 に点 変 異 体 を発 現 さ せ た.(c)ppraseド メ イ ン 中 の点 変 異 体 によ る ヒ ス トン シ ャペ ロ ン活性 の 制 御活 性 の 検討,核 型FKBP欠 失 株 に 点変 異体 を 発現 さ せ た.[文 献10か ら転載]

1201 蛋 白質 核 酸 酵素Vol.49No.8(2004)

Ⅸ.今 後,解 析すべき課題

1.核 型FKBPの ヒス トンシ ャペ ロ ン活 性 従 来 の ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン は,前 処 理 と し て ヒ ス ト ン と 結 合 さ せ て お く こ と に よ り ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 を 発 揮 す る34,38,42,47,48).一方,核 型FKBPの ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 を 生 み 出 す に は ヒ ス ト ン と の 前 処 理 を 必 要 と し な か っ た た め,核 型FKBPに は ピ ス ト ン 以 外 の 標 的 が あ る の で は な い か と 考 え ら れ る.ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン は 初 め て の ク ロ マ チ ン 因 子 と し て 発 見 さ れ49),現 在 広 く 使 わ れ て い る 「シ ャ ペ ロ ン 」 の 言 葉 を 生 み 出 し な が ら も, ヒ ス ト ン 化 学 修 飾 酵 素 に 比 べ 解 析 の 遅 れ た 因 子 で あ っ た.こ こ で 得 た 結 果 は,ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン に は 作 用 機 構 に 差 の あ る も の が2種 以 上 存 在 す る こ と を 示 し て お り,多 様 な ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 に 共 通 性 と 多 様 性 を 見 い だ す こ と を 通 し て,ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン の ク ロ マ チ ン構 造 変 換 に お け る 位 置 づ け が 解 明 で き る だ ろ う. 2.核 型FKBPのPPIase活 性 図7の 結 果 か ら,PPIaseド メ イ ン がrDNAサ イ レ ン シ ン グ に 関 与 す る 蛋 白 質 を 標 的 と し て 働 い て い る こ とが 考 え ら れ る.PPIaseド メ イ ン の 標 的 蛋 白 質 の 候 補 と し て は,ク ロ マ チ ン の お も な 構 成 因 子 の う ち 進 化 的 に 保 存 さ れ た 位 置 に プ ロ リ ン残 基 を 有 す る 因 子 が 考 え ら れ る. PPIaseは,ク ロ マ チ ン構 造 変 換 因 子 と 遺 伝 学 的 相 互 作 用 の あ る こ と が 知 ら れ て い る こ と か ら50),PPIaseド メ イ ンの ク ロ マ チ ン構 造 変 換 因子 に 対 す る 制 御 活性 に よ り サ イ レ ン シ ン グ 反応 の 制 御 を行 な っ て い る こ とが 考 え ら れ る. 筆 者 らがFKBP研 究 を始 め た き っ か け は1994年 に 転 写 基 本 因 子 との 相 互 作 用 を見 い だ した こ と(未 発 表)で あ る が,RNAポ リ メ ラ ー ゼⅡ の 最 大 サ ブユ ニ ッ トのC末 端 側 領 域CTDが,リ ン酸 化 依 存 的 にPPIaseフ ァ ミ リ ー の 一 員 で あ るPin1に 相 互 作 用 す る こ と も 知 られ て お り51),FKBPも 同様 に 転 写 装 置 に相 互 作 用 す る こ と は 当 然 と い え る.さ ら に,転 写 基 本 因 子TFIIDが 転 写 活 性 化 時 に 構 造 変 換 す る 可 能 性 が 筆 者 に よ り1988年 に 示 さ れ て い る こ とか ら52,53),FKBPを 代 表 と す るPPIase を介 した 転 写 基 本 因 子 群 の構 造 変 換 は転 写 活 性 化 機 構 の 新 しい 局 面 を切 り拓 くの に寄 与 す る と考 え られ る.転 写 調 節 因 子 の な か に は 高 プ ロ リ ン領 域 を転 写 活 性 化 ドメ イ ン と して 有 す る もの が 知 られ てお り54),こ の 高 プ ロ リ ン 領 域 の構 造 変 換 を介 して 転 写 制 御 を行 な う可 能性 が あ る. PPIaseド メ イ ン と ヒス トン シ ャ ペ ロ ン ドメ イ ン双 方 と も構 造 変 換 活 性 を有 す る こ と を考 え 合 わ せ る と,両 ド メ イ ン を 通 し て 核 型FKBPは 効 率 よ くク ロマ チ ン機 能 変換 を行 な っ て い る こ とが示 唆 され る. 3.核 型FKBPのrDNAサ イ レンシ ング反応 での役 割 rDNAサ イ レ ン シ ン グ 反 応 に は ヒ ス トン脱 ア セ チ ル 化 酵 素SIR2やRPD3な どの ク ロ マ チ ン因 子 の 関 与 す る こ と が 知 ら れ て い る こ と か ら55),核 型FKBPと そ れ ら の 因子 群 と の 協 調 的 また は阻 害 的 な作 用 を遺 伝 学 的 ・生 化 学 的 に 解 析 す る の が 当 面 の 課 題 と な る.ま た,rDNA サ イ レ ン シ ング 反 応 は細 胞 老 化 と密 接 な関 係 の あ る こ と が 知 ら れ て い る こ とか ら11),核 型FKBPの 働 き は 細 胞 老化 に 関 与 す る 可 能 性 が あ る.す で に細 胞 老 化 と関 連 す る こ と が 知 ら れ て い る ヘ テ ロ ク ロ マ チ ン 因 子SIR2/3/ 411)やDNAヘ リカ ー ゼSGS156,57)と の 機 能 的 相 互 作 用 を 検 討 し,老 化 関連 因 子 問 の相 互 作 用 ネ ッ トワ ー ク を検 討 して い くこ と も必 要 不 可 欠 で あ る.ま た,細 胞 老 化 に伴 っ てrDNAが 環 状DNAと して 染 色 体 外 に 放 出 さ れ る こ とが 知 られ て お り57),こ れ が核 型FKBPのDNAへ の 作 用 活 性 と関 連 して い るの か ど うか を検 討 して い くこ と も必 要 不 可 欠 で あ る. 4.蛋 白質構造変換反応機構の統一的な理解 本 稿 で は,核 型FKBPのPPIaseド メ イ ン 以 外,N末 図8 核 型FKBPに よ る ヒス トン シ ャペ ロ ン活 性 を通 して のrDNAサ イ レンシ ング反 応制 御 機構 モ デル [文献10か ら転載]

1202 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.49No.8(2004) 端 側 領 域 に 関 し て お も に 解 析 し た.加 え て,構 造 変 換 反 応 の モ デ ル と な り う る プ ロ リ ン 異 性 化 反 応 は 蛋 白 質 の 構 造 変 換 反 応 の モ デ ル 系 と し て 有 効 で あ る.FKBPは PPIaseフ ァ ミ リ ー の1つ の ク ラ ス に す ぎ な い も の の, そ の ク ラ ス に は 多 様 なFKBPフ ァ ミ リ ー が あ り 多 様 な 蛋 白 質 を 認 識 し て い る こ と が 知 ら れ て い る17)。FKBPフ ァ ミ リ ー に 相 互 作 用 す る 因 子 の 包 括 的 解 析 お よ び 基 質 蛋 白 質 に お け る 共 通 モ チ ー フ の 探 索,そ し て,FKBPフ ァ ミ リ ー と 基 質 蛋 白 質 複 合 体 の 立 体 構 造 解 析 を 進 め て い く こ と が 重 要 で あ る.PPIaseフ ァ ミ リ ー は,FKBPフ ァ ミ リ ー,シ ク ロ フ ィ リ ン フ ァ ミ リ ー,お よ びPin1/Ess1フ ァ ミ リ ー か ら な り,そ れ ぞ れ 基 質 認 識 配 列 が 異 な る17). し た が っ て,異 な る タ イ プ の 基 質 特 異 性 を も つ 新 し い PPIaseの 単 離 ・解 析 を 行 な い,プ ロ リ ン の 位 置 に お け る 構 造 変 換 に 基 づ い た 生 体 反 応 を 統 一 的 に 理 解 す る こ と も 大 切 で あ る.ま た,PPIaseは 原 核 生 物 か ら 真 核 生 物 に 至 る ま で 進 化 的 に 高 度 に 保 存 さ れ て い る に も か か わ ら ず 生 存 に 必 須 で は な い こ と18)か ら,そ の 解 明 は 進 化 と 構 造 ・機 能 の 関 連 性 を 考 え る う え で 大 い に 有 効 で あ る. お わ りに FKBPあ る い はPPIase研 究 は 約15年 前 に さ か の ぼ れ る が,FKBPの 核 内 で の新 しい 生 化 学 的働 き を 明 らか にす る研 究 は な さ れ て い な か っ た.筆 者 らは,本 稿 で 示 したFKBPへ の 興 味 か ら,(1)FKBP研 究 の 背 景 全 体 を 考 察 し,(2)そ の 方 向 性 を 検 討 し,そ し て,(3)FKBP の 生 化 学 的 機 能 を予 測 し実 証 した.生 物 学 で は,必 ず し もそ の 分 野 を専 門 に して い な くて も,ち ょっ と した ア イ デ アそ して 論 理 に 裏 付 け され た洞 察 力 を も っ て工 夫 を す れ ば,細 胞 増 殖45),細 胞 死37)と同 様 に,新 しい 分 野 に切 り込 め る よ う な知 見 を得 る こ とが で きる. 今 回 の研 究 が 示 す 新 規 性 の 足 が か り とな っ た の は,機 能 未 知 で あ っ たFKBPのN末 端 側 領 域 の1次 構 造 に お け る 特 徴 を 生 か した こ と に よ る.構 造 と機 能 は不 可 分 で あ り,機 能 を類 推 す る に は構 造 と取 り組 む こ とが 大 切 で あ る44,45,58∼61)。な ぜ な ら,構 造 は 機 能 を もつ た め,す な わ ち,あ る 因子 が あ る機 能 を 果 た す と き に は そ れ を可 能 とす る構 造 が と られ る はず だ か らで あ る.そ して,そ の 因 子 に機 能 的 に 対 応 す る 因子 は,構 造 的 に もそ の 因 子 に 対 応 しな け れ ば な ら な いか らで あ る.生 体 反応 は 構 造 を 基 盤 と した 相 互 作 用 と化 学 反 応 の2種 類 の コ ミニ ュ ケ ー シ ョ ンか ら成 り立 ち,程 度 の 異 な る特 異 性 の うえ に立 脚 して い る.し た が っ て,ど の 因 子 と ど の 因 子 との 間 に ど の よ うな 新 しい 特 異 性 を見 い だ す か が,研 究 推 進 の 鍵 に な る ば か りで な く,分 子 機 構 の 核 心 を 映 し出 す こ と はい うま で もな い. 解 析 す る 因 子 が1か ら ηへ と移 行 す る 時 代 に あ っ て, さ ま ざ まな情 報 が 容 易 に手 に入 り,あ らゆ る手 法 に よる 知 見 が 次 々 に 明 らか に され て こ よ う と も,そ れ らの 情報 や 知 見 の な か に埋 もれ て 待 っ て い る意 義(原 理)を 見 い だ し磨 き上 げ る研 究 者 の 眼 や 腕 の確 か さ に科 学 の 進 展 は大 き く依 存 す る と考 え られ るが い か が で あ ろ うか?研 究 者 が 日 々 の実 験 や 議 論 を通 して透 徹 した 論 理 力 ・判 断力 を 上 達 させ る こ とに よ って,細 菌 か ら ヒ トまで 存 在 す る PPIaseの よ う に,ト ラ ンス 型(シ ス 型)の 発 想 を シ ス 型 (ト ラ ンス型)の 発 想 に転 換 す る こ とが 最 も大 切 な こ とな の で あ ろ う. 本 稿 で 紹 介 した研 究 の 一 部 は,科 学 技 術 振 興 事 業 団(現:独 立 行 政 法 人 科 学技 術 振 興 機 構)ERATO堀 越 ジ ー ンセ レク タ ー プ ロ ジ ェク トにお いて 行 な われ た もの で あ る.

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252-255(1994) 堀 越 正 美 略 歴:1985年 東 京 大 学 大 学 院薬 学 系 研 究 科 修 了,ロ ッ ク フ ェ ラ ー 大 学 博 士 研 究 員,助 教 授 を 経 て,1992年 東 京 大 学 分 子 細 胞 生 物 学 研 究 所(当 時:応 用 微 生 物 研 究 所)助 教 授,1997 年 ∼2002年 科 学 技 術 振 興 事 業 団(現:科 学 技 術 振 興 機 構) ERATO堀 越 ジ ー ン セ レ ク タ ー プ ロ ジ ェ ク ト総 括 責 任 者, 研 究 テ ー マ:遺 伝 子 発 現 制 御 機 構 論,関 心 事 ・抱 負:独 創 的 研 究 者 の 育 成 と遺 伝 子 発 現 制 御 機 構 論 の 構 築.