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原著
(
平 成12年10月13日平 成 受 付 12年12月5日 受 理)
Kupffer細
胞 除 去op/opマ
ウ ス に お け る
Kupffer細
胞 再 生 過 程 の 検 討
貝 津 智 佳 子1,2)
1)新 潟大学医学部第二病 理 2)新 潟大学医学部第二 内科Repopulation
of Kupffer cells in op/op mice after administration
of
liposome-encapsulated
dichloromethylene
diphosphonate
Chikako Kaizu1,2)
1) Second Department of Pathology, Niigata University School of Medicine
2) Second Department of Internal Medicine, Niigata versity School of Medicine
Kupffer cells were selectively eliminated in the macrophage colony stimulating factor
(M-CSF)-deficient
osteopetrotic (op/op) mice by intravenous administration of
liposome-entrapped dichloromethylene diphosphonate. Repopulation of Kupffer cells was observed in
the Kupffer cell-depleted littermate mouse (op/+)
liver by 14 days after treatment. In
contrast, repopulation of Kupffer cells was not observed in the Kupffer cell-depleted op/
op mice through the observation period of 56 days. Daily administration of M-CSF induced
remarkable repopulation of Kupffer cells and proliferation of macrophage precursor cells,
whereas GM-CSF and IL-3 were less effective. These findings indicated that M-CSF plays
a major role in Kupffer cell development.
Key words
op/op mice, Kupffer cell, M-CSF, GM-CSF, IL-3
緒言
Kupffer細 胞 は 肝 類 洞 内 に 存 在 す る 在 住 マ ク ロ フ ァ ー ジ で あ り,代 謝 や 生 体 防 御 に お い て 重 要 な 役 割 を果 た して い る.本 細 胞 の 起 源 に つ い て は,内 皮 細 胞 由 来 説 や 末 梢 血 単 球 由来 説 が 提 唱 さ れ,論 争 が く り ひ ろ げ られ て きた.van Furthら は,ト リチ ウ ム サ イ ミ ジ ン を 用 い た 単 球 の 標 識 追 跡 実 験 か ら,骨 髄 造 血 巣 に発 生 す る 単 球 系 前 駆 細 胞 が 単 球 へ 分 化 し,血 液 を循 環 し た 後,肝 を は じ め種 々 の 組 織 に 定 着 す る と結 論 し,単 核 食 細 胞 系 を提 唱 し た1).そ れ に よ る と,Kupffer細 胞 は単 球 系 の最 終 分 化 段 階 の 細 胞 で,分 裂 能 は な く,短 期 間 で 死 滅 す る もの と み な さ れ た.し か し,網 内 系 の 刺 激 状 態 や,89Srを 用 い た 単 球 減 少 マ ウ ス の 検 討 で はKupffer細 胞 は 増 殖 能 を 有 し,自 己 増 殖 能 に よ る 供 給 が 可 能 な 細 胞 で あ る こ と が 確 認 さ れ て い る2).こ れ ら の 検 討 の 中 で,Kupffer細 胞 の 分 化,増 殖 に は そ の 微 小 環 境, こ と に そ の 組 織 の 産 生 す るサ イ トヵ イ ンや 増 殖 因 子 の 役 割 が 注 目 さ れ,in vitroで は マ ク ロ フ ァー ジ の 分 化 過 程 に お け る マ ク ロ フ ァ ー ジ コ ロ ニ ー刺 激 因 子(macrophage colony stimulating factor:M-CSF),顆 粒 球-マ ク ロ フ ァ ー ジ コ ロ ニ ー 刺 激 因 子
(granulocyte-macrophage colony stimulating fac-tor:GM-CSF),イ ン タ ー ロ イ キ ン-3 (interleukin-3:IL-3)な どの 増 殖 因 子 の 単 独 お よ び 複 合 的 作 用 が 重 視 さ れ て い る3-6).M-CSFの 機 能 欠 損 マ ウ ス で あ る 大 理 石 病 マ ウ ス(op/opマ ウ ス)で は,Kupffer細 胞 を 含 め た 組 織 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 減 少 と分 化 異 常 が 認 め られ,M-CSF依 存 性,
群 の 増 殖 に,M-CSFが 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と を報 告 した16). 以 上 の 成 績 を も とに 本 研 究 で は,op/opマ ウ ス の Kupffer細 胞 枯 渇 モ デ ル を作 製 し,そ の 再 生 過 程 に お け る サ イ トカ イ ン の 関 与 を 検 討 し た の で 報 告 す る.
材料 と方 法
1.リ ポ ソ ー ム の 作 製 lipo-MDPはRooijenら の 方 法11)に 従 っ て, 58.72mgの フ ォ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン(日 本 生 化 学),8.75mgの デ ヘ キ サ デ シ ル フ ォ ス フ ェ イ ト (和 光)お よ び24.75mgの コ レ ス テ ロ ー ル(和 光) を ク ロ ロ フ ォル ム に 融 解 し,ナ ス 型 コ ル ベ ン 内 で 低 圧 下 で 乾 燥,薄 膜 を 形 成 し た.650mM(0.9455g) のdichrolo methylene diphosphonate (MDP)を 含 む5mlの 燐 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水(PBS)で 水 和 し, 手 振盪 法 に て 振盪 後,0.8μm孔 の ミ リ ポ ア フ ィ ル タ ー で 大 き さ を そ ろ え て,15,000回 転/分 で10分 間 遠 心.最 終 的 にPBS4mlに 溶 解 した. 2.動 物 8-12週 令 の 雌 性op/opマ ウ ス と そ の 正 常 同 腹 マ ウ ス を 用 い た.lipo-MDPをop/opマ ウ ス と,正 常 同 腹 マ ウ ス に0.1ml静 注 し,以 後,投 与56日 後 ま で,各3匹 づ つ 経 時 的 に 屠 殺 し,肝 脾 を 採 取 し た.ま た,op/opマ ウ ス で はlipo-MDP投 与14日 後 よ り,Myintら の 方 法19)に 従 い,そ れ ぞ れM -CSF5μg ,IL-3 100ng,GM-CSF 5ngを5日 間 連 日 投 与 し,lipo-MDP投 与 後14日 目 を0日 と し て,以 後3,5,6,8,11日 に各3匹 屠 殺 して,肝 脾 を採 取 した.3.免 疫 染色
肝 脾 をperiodate-lysine-paraform-aldehyde 包 埋 し,ク リ オ ス タ ッ ト(Bright,Huntington, UK)を 使 用 し て6μmに 薄 切 し た.Isobeら の 方 法20)に 従 い,内 因 性 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ の 阻 害 を 行 い,一 次 抗 体 と し て は 抗 マ ウ ス マ ク ロ フ ァ ー ジ モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体F4/80,抗 マ ウ ス マ ク ロ フ ァ ー ジ 前 駆 細 胞 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体ER-MP20,抗 マ ウ ス マ ク ロ フ ァ ー ジ 前 駆 細 胞 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体ER-MP58を 用 い た21,22)(図1).二 次 抗 体 と し て はanti -rat Ig-horseradish peroxidase-linked F(ab)2 fragment (Amersham,Little Chalfont,UK)を 用 い た.3,3-diaminobenzidine (DAB;Dojin Chem-ical Co.,Kumamoto,Japan)を 用 い て 可 視 化 し た 後 に メ チ ル グ リ ー ン に て 核 染 を 行 っ た.陽 性 細 胞 は 光 学 顕 微 鏡 下 高 倍 率 に て20視 野 計 測 し,1mm2当 た り に 換 算,評 価 し た. 4.増 殖 能 の 検 討 増 殖 因 子 負 荷 群 に[3H] thymidine (specific activity,3.0TBq/mmole)(Du Pont,Wilmington, DE)を 屠 殺1時 間 前 に 静 注 し,組 織 採 取,免 疫 染 色 を 施 行 後,ス ラ イ ドガ ラ ス に 蒸 留 水 で1:2の 比 率 に 希 釈 し た 感 光 乳 剤(Sakura NR-M2)を 塗 布 し て,4℃ で10日 間 露 光 後 に 現 像 し た.核 上 に10個 以 上 のgrainを 有 す る も の を増 殖 細 胞 と判 定 し た.増 殖 細 胞 の 陽 性 細 胞 に 対 す る 割 合 を 算 定 し,評 価 し た.
5.Reverse transcriptase
polymerase chain
reac-tion (RT-PCR)
lipo-MDP投 与 後,経 時 的 に屠 殺 した 増 殖 因 子 非 負 荷 群 の 肝,脾 か らtotal RNAをAGPC法23)で 抽 出 し,cDNAを 合 成 し,表1に 示 し た プ ラ イ マ ー を 用 い てIL-3,GM-CSF,β-actinのPCR反 応 を 行 い,電 気 泳 動 を 行 い,mRNAの 発 現 を 判 定 し た.2001年 第40巻4号 29 表1 図2 lipo-MDP投 与 後 の 正 常 同 腹 マ ウ スF4/80陽 性Kupffer細 胞 a)Control,b)2日 後,c)7日 後 ×200 6.統 計 処 理 統 計 処 理 は す べ てStudent t-testに よ っ て 行 っ た.
結
果
1.Kupffer細 胞 枯 渇 後 のKupffer細 胞 お よ び 前 駆 細 胞 群 の 動 態 免 疫 染 色 の 結 果,F4/80陽 性Kupffer細 胞 は 正 常 同 腹 マ ウ ス で は3日 間 消 失 し,そ の 後 徐 々 に 出 現, 増 加 し て,約2週 間 で 正 常 域 に 回 復 し た(図2, 3).Kupffer細 胞 の 消 失 し て い る 期 間 内 に 肝 内 で はERたMP58,ERたMP20陽 性 の マ ク ロ フ ァー ジ 前 駆 細 胞 が 一 過 性 に 増 加 し た.脾 臓 で はF4/80陽 性 マ ク ロ フ ァー ジ は3日 間 消 失 し た が,徐 々 に 回 復 し,約10日 後 に正 常 に 復 した.そ れ に 対 して0p/op マ ウ ス で は,lipo-MDP投 与 後,Kupffer細 胞 は 消 失 し,8週 間 後 で も回 復 せ ず(図4),前 駆 細 胞 群 の 増 加 は 軽 度 で あ っ た.し か し,op/opマ ウ ス の 脾 臓 で は,F4/80陽 性 マ ク ロ フ ァ ー ジ は正 常 同 腹 マ ウ ス と 同 様3日 間 消 失 し た 後 に 約10日 間 で 回 復 した (図5a,5b). 2.増 殖 因 子mRNAの 発 現 正 常 同 腹 マ ウ ス,op/opマ ウ ス の 脾 臓 で はGM-CSF mRNAの 発 現 を認 め た が,IL-3 mRNAの 発 現 は み られ な か っ た.肝 臓 で は両 群 の マ ウ ス にIL -3,GM-CSF mRNAの 発 現 は み ら れ な か っ た (図6).M-CSFは 正 常 同 腹 マ ウ ス 肝 に お い てday 2,3に お い て発 現 亢 進 が 見 られ た が,op/opマ ウ ス で は み ら れ な か っ た. 3.増 殖 因 子 負 荷 実 験 M-CSF連 日投 与 群 で はF4/80陽 性 細 胞 は著 明 に 回 復,増 加 し,前 駆 細 胞 群 の 増 加 も顕 著 で あ っ た (図7a).ト リチ ウ ム サ イ ミ ジ ン オ ー トラ ジ オ グ ラ フ ィ ー で はERたMP58陽 性 細 胞,F4/80陽 性 細 胞 の 増 殖 能 の 充 進 が 認 め ら れ た(図7b,8).GM-CSF,IL-3投 与 群 で もF4/80陽 性 細 胞 の 再 生,増重 要 な役 割 を演 じ,GM-CSF・M-CSFは,造 血 前 駆 細 胞 か ら マ ク ロ フ ァ ー ジ へ の 分 化 成 熟 過 程 の 異 GM-CFC)は,M-CSFを 欠 損 す るop/opマ ウ ス 線 維 芽 細 胞 との 共 培 養 に お い て 未 熟 な 形 態 の マ ク ロ 図3 正 常 同腹 マ ウ ス肝 に お け るlipo-MDP投 与 後 の 陽性 細 胞 数 図4 op/opマ ウ ス 肝 に お け るlipo-MDP投 与 後 の 陽 性 細 胞 数 図5a 正 常 同 腹 マ ウス 脾 に お け るlipo-MDP投 与 後 の F4/80陽 性 細 胞 数 図5b op/opマ ウ ス 脾 に お け るlipo-MDP投 与 後 の F4/80陽 性 細 胞 数
2001年 第40巻4号 31
図6
図7a op/opマ ウ ス 肝 に お け るlipo-MDP投 与 後M-CSF連 日 負 荷 後 の 陽 性 細 胞 数 control;無 処 置op/opマ ウ ス 図7b op/opマ ウ ス 肝 に お け るlipo-MDP投 与 後M-CSF連 日 負 荷 後 の 増 殖 能 control;無 処 置op/opマ ウ ス 図8 lipo-MDP投 与 後MたCSF負 荷6日 後 のop/opマ ウ ス 肝 臓 オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ イ ー a) ER-MP58陽 性 細 胞 b) F4/80陽 性 細 胞 ×400
図10 lipo-MDP投 与 後 サ イ トカ イ ン 負 荷5日 後 のop/opマ ウ ス 肝 臓 の オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー a) GM-CSF,F4/80陽 性 細 胞 b) IL-3,ER-MP58陽 性 細 胞 ×400 フ ァ ー ジ に 分 化 す る.こ れ ら の 分 化,成 熟 にM-CSFが 極 め て 重 要 な作 用 を 発 揮 す る こ と を 明 示 し て い る が,同 時 に,M-CSFに 依 存 し な い マ ク ロ フ ァー ジ の 分 化 機 序 の 存 在 も 示 唆 し て い る.事 実, Myintら は,op/opマ ウ ス にGM-CSF,IL-3を 投 与 し,破 骨 細 胞 や 組 織 マ ク ロ フ ァー ジ の 増 加 を 観 察 し て い る19).一 方,Langerhans細 胞,骨 髄 中 の 単 球 とマ ク ロ フ ァ ー ジ,胸 腺,リ ン パ 節 中 の マ ク ロ フ ァ ー ジ はop/opマ ウ ス で も減 少 し な い こ とか ら, そ の 分 化 はM-CSFの 影 響 を 受 け な い と考 え ら れ る.そ れ に 対 し て,op/opマ ウ ス 脾 のMOMA-1 陽 性marginal metallophilic macrophageとER-TR9陽 性marginal zone macrophageはop/opマ
ウ ス で ほ と ん ど み られ な い が,M-CSF投 与 に 対 す る 反 応 は 不 十 分 で あ り,こ れ ら マ ク ロ フ ァ ー ジ は M-CSF依 存 性 で は あ る が,M-CSF不 応 性 マ ク ロ フ ァ ー ジ と み な さ れ る27).以 上 の 成 績 か ら,M -CSF非 依 存 性 の マ ク ロ フ ァー ジ の 分 化,成 熟 過 程 は 局 所 で 産 生 さ れ るIL-3やGM-CSFに よ っ て 制 御 さ れ て い る と 推 測 さ れ る25).こ の よ う に,M -CSFは 主 な 組 織 マ ク ロ フ ァー ジ と そ の 前 駆 細 胞 の 分 化 成 熟 過 程 を 制 御 し,GM-CSFやIL-3は 一 部 の マ ク ロ フ ァ ー ジ 亜 群 の 成 熟,分 化 を調 節 して い る こ とが 想 定 さ れ る. マ ク ロ フ ァ ー ジ 除 去 法 を 用 い たKupffer細 胞 枯 渇Balb/cマ ウ ス モ デ ル で は,Kupffer細 胞 の 枯 渇 期 間 中 に肝 内 に マ ク ロ フ ァー ジ 前 駆 細 胞 が 増 加,増 殖 し16),ま た,枯 渇 期 間 に お い て,肝 でM-CSF mRNAの 発 現 亢 進 が 見 ら れ,そ れ に 対 応 し て, M-CSF responsive cellsと され るER-MP58陽 性 細 胞 の 増 殖 能 が 亢 進 す る.さ ら にM-CSF投 与 に よ り,枯 渇 期 間 の 短 縮 は 見 られ な い が,再 生 は促 進 さ れ る こ とが 示 さ れ て い る16).本 研 究 で も,正 常 同 腹 マ ウ ス で はBalb/cマ ウ ス と同 様 の 成 績 を 得 た が, op/opマ ウ ス で は 前 駆 細 胞 は少 な く,Kupffer細 胞 枯 渇 期 問 中 も ほ と ん ど増 加 し な か っ た.こ の こ と か
2001年 第40巻4号 33
図11a op/opマ ウ ス 肝 に お け るlipo-MDP投 与 後 GM-CSF連 日負 荷 後 の 陽 性 細 胞 数
control;無 処 置op/opマ ウ ス
図11b op/opマ ウ ス 肝 に お け るlipo-MDP投 与 後 GM-CSF連 日 負 荷 後 の 増 殖 能
control;無 処 置op/opマ ウ ス
図12a op/opマ ウ ス 肝 に お け るlipo-MDP投 与 後IL-3 連 日 負 荷 後 の 陽 性 細 胞 数
control;無 処 置op/opマ ウ ス
図12b op/opマ ウ ス 肝 に お け るlipo-MDP投 与 後IL-3 連 日負 荷 後 の 増 殖 能 control;無 処 置op/opマ ウ ス ら も,M-CSFは マ ク ロ フ ァ ー ジ前 駆 細 胞 の 分 化 ・ 増 殖 に 重 要 で あ る こ とが 示 唆 さ れ る. Kupffer細 胞 除 去op/opマ ウ ス で は,脾 臓 の マ ク ロ フ ァー ジ は 正 常 同 腹 マ ウ ス と 同 様 に 回 復 し た. Kupffer細 胞 は 正 常 同 腹 マ ウ ス 肝 で は,Balb/cマ ウ ス と同 様 に14日 後 ま で に 回 復 し た.意 外 な こ と に,Kupffer細 胞 はop/opマ ウ ス で は,lipo-MDP 投 与 後56日 後 まで の 観 察 期 間 中 再 生 し な か っ た.つ ま り,Kupffer細 胞 の 再 生 に はM-CSFが 必 須 で あ る が,脾 マ ク ロ フ ァー ジ の再 生 に は 必 須 で は な い こ とが 判 明 した.こ の 差 の 原 因 と し て,血 中 サ イ トヵ イ ン よ り も組 織 局 所 で の サ イ トヵ イ ン産 生 の 差 が 考 え ら れ た.Cecchiniら24)は,脾 臓 の マ ク ロ フ ァ ー ジ の 分 化 にGM-CSFの 重 要 性 を 報 告 し た.事 実, 肝 脾 に お け るマ ク ロ フ ァー ジ 除 去 後 の 脾 で は正 常 同 腹 マ ウ ス,op/opマ ウ ス と も にGM-CSFの mRNAの 発 現 が 認 め ら れ た の に 対 し,肝 で は 発 現 が み ら れ な か っ た. 以 上 の 成 績 を も と に本 研 究 で は,マ ク ロ フ ァー ジ 除 去op/opマ ウ ス にGM-CSF,ILた3,M-CSF負 荷 を 施 行 した.そ の 結 果,M-CSFは 最 も強 力 に マ ク ロ フ ァー ジ お よ び 前 駆 細 胞 に作 用 す る こ と が 明 ら か と な っ た.無 処 置op/opマ ウ ス にM-CSFを 投 与 した 場 合 と同 様,Kupffer細 胞 は 急 激 に増 加,増 殖 し,一 時 的 に 正 常 のop/opマ ウ ス のKupffer細 胞 の10倍 に も 達 し た.一 方,GM-CSF,IL-3に よ っ て も あ る 程 度Kupffer細 胞 の 再 生 が 惹 起 さ れ た.し か し,両 者 の 作 用 に は 差 異 が み ら れ,IL-3
る20,21).本 研 究 に お け るin vivoで の 各 増 殖 因 子 の 作 用 は これ ら の増 殖 因 子 のin vitroで の 効 果 と相 似 し て い る と考 え られ た.そ れ で は,マ ク ロ フ ァー ジ 除 去op/opマ ウ ス で は な ぜKupffer細 胞 が 回 復 し な か っ た の で あ ろ う か.op/opマ ウ ス で はGM-CSFやIL-3は 正 常 に存 在 す る が,肝 臓 で は 産 生 量 が 少 く,生 理 的 濃 度 で はKupffer細 胞 の 分 化 ・生 存 を 維 持 で き な い 可 能 性 が 考 え られ る.老 齢op/op マ ウ ス で は破 骨 細 胞 の 増 加 に よ る 骨 病 変 の 改 善 が み ら れ,こ れ はGM-CSFの 産 生 増 大 に よ る と み な さ 以 上,マ ク ロ フ ァ ー ジ 除 去op/opマ ウ ス モ デ ル は,マ ク ロ フ ァ ー ジ の 分 化 機 序 の 解 析 と種 々 増 殖 因 子 の マ ク ロ フ ァ ー ジ お よ び 前 駆 細 胞 に対 す る作 用 機 序 の 検 討 に 有 用 な モ デ ル と考 え ら れ た.
謝辞:ご 指 導 をいた だ き ま した新 潟-学 医学部 第
二病 理
内藤
眞教授,同 第 二 内科
下條 文武 教
授 に感謝 いた し ます.ま た,山 本
尚先生 をは じ
め,第 二 病理 の教 室 員,技 官 の皆 様 の ご支 援 に心
か ら御礼 申 し上 げ ます.
文 献
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2001年 第40巻4号 35
