各 種 酸 分 泌 抑 制 剤 の 胃 粘 液 糖 蛋 白質 合 成 に対 す る影 響
-in vivoお よびin vitroに おけ
る検討-木
原
康
裕
キ ー ワ ー ド: mucin, galactosyltransferase, H2-receptor antagonist, proton pump inhibitor
緒
言
胃 内腔 面 に は 胃粘 膜 の 被 蓋 上 皮 よ り分 泌 す る粘 液 が 層
を成 し,粘 膜上 皮 層 の上 を被 っ て い る.こ の 被 蓋 粘 液 層
は,糖 蛋 白,血 漿 蛋 白,ム
コ多糖,核
酸 か ら な り,機 械
的 刺 激 に対 す る保 護 作 用,酸
中 和 作 用,抗 ペ プ シ ン作 用
を有 して い る.こ の よ う な機 能 を含 めmucus
barrierと
呼 ば れ る1).粘 液糖 蛋 白 は,そ の粘 液 構 成 物 質 の 中 で も防
御 因 子 と し て 最 も重 要 な も の の 一 つ で あ
る2).UDP-galactosyltransferase (UDP-Gal-T)は,糖
タ ン パ ク質
にUDP-galactoseの
転 移 を触 媒 す る酵 素 で あ り,胃 に
お いて は,主 に 粘 膜 上 皮 細 胞 の ゴル ジ体 に局 在 し,こ の
粘 液 糖 蛋 白生 合 成 の 最 終 段 階 に お け る律 速 酵 素 の 一 つ で
あ る3).こ のUDP-Gal-T活
性 を分 析 す る こ とは,粘 液 糖
蛋 白の 生 合 成 の 解 析,ひ
い て は 胃粘 膜 防 御 機 構 か らみ た
胃潰 瘍 形 成 の生 理,そ
して 抗 潰 瘍 薬 の 効 果 機 序 の 解 明 に
と って 有 用 で あ る.
H2受 容 体 拮 抗 薬(H2
RA)やproton
pump阻
害 薬
(PPI)な どの 各 種 酸 分 泌 抑 制 剤 は,攻 撃 因子 で あ る 胃 酸
の分 泌 を抑 制 す る こ とに よ っ て 胃潰 瘍 治 癒 を飛 躍 的 に 改
善 した.し か し なが ら,防 御 因子 増 強 剤 に比 べ て こ れ ら
酸 分 泌 抑 制 剤 の 胃粘 膜 防御 機 構 へ の影 響 は まだ 十 分 に は
わか っ て い な い.
我 々 は,以 前 よ り各 種 酸 分 泌 抑 制 剤 や 防 御 因 子 増 強 剤
に よ る こ の 胃粘 液 糖 蛋 白合 成 に与 え る影 響 を,UDP-Gal
-T活 性 を 測 定 す る こ と に よ っ て 検 討 し,そ の な か で, cimetidine, omeprazoleは,本 酵 素 活 性 を 低 下 さ せ る こ と を 報 告 し て い る4).し か し,そ の 減 少 が そ の 強 力 な 酸 分 泌 抑 制 作 用 に 伴 う 二 次 的 な も の な の か,薬 剤 に よ る 直 接 的 な 作 用 で あ る の か ど う か は 不 明 で あ る. 今 回,酸 分 泌 抑 制 剤 の 胃 粘 膜 防 御 機 構 へ の 影 響 を 解 明 す る た め,5種 類 の 酸 分 泌 抑 制 剤(cimetidine, ranitidine, famotidine, roxatidine, omeprazole)に つ い て,こ れら 薬 剤 を ラ ッ トに 投 与 し 胃 内 酸 度 を 変 化 さ せ,UDP-Gal -T活 性 の 変 動 を 検 討 し た.さ ら に,ラ ッ ト 胃 粘 膜 よ り 調 整 し た 酵 素 測 定 用 検 体 に こ れ ら の 酸 分 泌 抑 制 剤 を 直 接 加 え,本 酵 素 活 性 へ の 直 接 的 な 影 響 に つ い て も 検 討 し た. 材 料 と 方 法 1. 酵 素 測 定 用 検 体 の 調 整 既 報4)の ご と く,体 重 約200gのSD系 雄 性 ラ ッ ト を 用 い,24時 間 絶 食 の 後,各 種 薬 剤 を 投 与 し,6時 間 後 に 胃 を 摘 出,大 弯 切 開 後,胃 粘 膜 表 面 のpHを 測 定 し た .そ の 後,生 理 食 塩 水 で 軽 く洗 浄 し,胃 体 部 粘 膜 を ス ク レ ー プ し,氷 冷 し た10倍 溶 の0 .25Mス ク ロ ー ス 液 を 加 え Wheaton 200型 ホ モ ジ ナ イ ザ ー に て ホ モ ジ ナ イ ズ 後,500 gで10分 間 遠 心 し,そ の 上 清 を 酵 素 測 定 用 検 体 と し た. 酵 素 検 体 の 蛋 白 量 は,プ ロ テ イ ン ア ッ セ イ キ ッ ト(Bio Rad Labs, Inc., Hercules, CA)を 用 い て 測 定 し た .
2. 胃 粘 膜 表 面pHの 測 定
体 部 小 弯 の 胃 粘 膜 表 面 にpH試 験 紙(Whatman indi cator papers, Whatman Inc., Newton, MA)を 当 て
て 粘 膜 表 面pHを 測 定 し,各 サ ン プ ル の 測 定 値 の 平 均 を
平 均 胃 粘 膜 表 面pHと し た.
3. UDP-Gal-T活 性 測 定
酵 素 活 性 の 測 定 は,既 報 の 如 く行 っ た4).す な わ ち, bovine submaxillary mucin (Sigma Chemical Co ., St. Louis, (平成13年12月20日 受 理) 指 導:辻 孝 夫 教 授(岡 山 大 学 大 学 院 医歯 学 総 合 研 究 科 消 化 器 ・肝 臓 ・ 感 染 症 内科 学 教 室) 連 絡 先:広 島 逓 信 病 院 広 島 市 中 区 東 白鳥 町19-16 木 原 康 裕 電 話: 082-224-5350 Fax: 082-223-5083 E-mail: [email protected]
140 木 原 康 裕
MO)を 硫 酸 処 理 し 作 成 し たasialomucinを 受 容 体 と し
た, 0.05M Tris塩 酸 緩 衝 液, pH 7.5, UDP-galactose, UDP-[3H]-galactose (New England Nuclear Co.,
Boston, MA)お よ び 酵 素 検 体 を 含 ん だ 反 応 溶 液 を37℃ で20分 間 反 応 し た. 1mlの 氷 冷 し た1%リ ン タ ン グ ス テ ン 酸(0.5N HCI溶 解 液)で 反 応 を 止 め,ト リチ ウ ム 標 識galactoseが 転 移 さ れ た 反 応 生 成 物 を5%ト リ ク ロ ロ 酢 酸 で 沈 澱 さ せ た 後, Whatman GF/Bガ ラ ス 濾 紙 (Whatman Inc.)に て 濾 過 し, 5%ト リ ク ロ ロ 酢 酸 で 洗 浄 し,液 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー に て 濾 紙 上 の 放 射 活 性 を 測 定 した.ま た,酵 素 活 性 は, pmoles/mg・protein/ minで 算 出 し た. 4. 各 種 酸 分 泌 抑 制 剤 の 影 響 1) 使 用 薬 剤 以 下 の5種 類 の 酸 分 泌 抑 制 剤 を 使 用 し た.cimetidine, ranitidine hydrochloride, famotidine, roxatidine ace
tate hydrochloride, omeprazole. 2) in vivo実 験
各 種 酸 分 泌 抑 制 剤 の 臨 床 使 用 量 を 参 考 に 換 算 した 用 量, お よ び そ の2倍 量, 10倍 量, 20倍 量, 100倍 量 を1群, 6 匹 の ラ ッ ト に 投 与 し た.す な わ ち, cimetidine 5, 10, 50, 100, 500mg/kg, ranitidine 2.5, 5, 25, 50, 250mg/
kg, famotidine O.25, 0.5, 2.5, 5, 25mg/kg, omeprazole O.5, 1, 5, 10, 50mg/kgを ラ ッ トの 腹 腔 内 に 投 与 し, 投 与 後6時 間 後 屠 殺 し,上 記 の 方 法 でpHお よ びUDP-Gal-T活 性 を 測 定 し た.い ず れ も,各H2 RAは 生 理 食 塩 水 に 溶 解 し, omeprazoleは0.5% carboxymethyl cellulose含 有 ナ ト リ ウ ム 炭 酸 緩 衝 液(pH 9.0)に 懸 濁 し 投 与 し, controlに は 生 理 食 塩 水 の み を 投 与 し た. 次 に,酸 分 泌 抑 制 剤 の 影 響 が 胃 内pHの 変 化 に よ る 二 次 的 な もの か,薬 剤 の 直 接 作 用 に よ る も の か を 明 ら か に す る た め,酸 分 泌 抑 制 剤 と と も に 緩 衝 液 を 胃 内 に 投 与 し, UDP-Gal-T活 性 の 変 動 を 検 討 し た.各 種 酸 分 泌 抑 制 剤
(cimetidine 50mg/kg, ranitidine 25mg/kg, famotidine 2.5mg/kg, omeprazole 10mg/kg,お よ び 構 造 の 異 な るH2 RAと し てroxatidine 20mg/kg)を1群6匹 の ラ ッ トに 腹 腔 内 投 与 す る と と も に,ク エ ン 酸 リ ン 酸 緩 衝 液(pH= 2)を25ｍl/kg経 口 投 与 し,胃 内pHの 上 昇 を 抑 制 し た う え で,薬 剤 投 与6時 間 後 にpHお よ びUDP-Gal-T活 性 を 測 定 し た. 3) in vitro実 験 酸 分 泌 抑 制 剤 のUDP-Gal-T活 性 に 及 ぼ す 直 接 作 用 を 明 ら か に す る た め,数 匹 分 の ラ ッ トか ら 得 た 酵 素 測 定 用 検 体 に 各 種 酸 分 泌 抑 制 剤(0.5mM, 1.0mM)を 加 え て, UDP-Gal-T活 性 を 測 定 し た.各H2 RAはTris塩 酸 緩 衝 液 に 溶 解 し 反 応 溶 液 に 加 え, omeprazoleは 純 エ タ ノー ル に 溶 解 しTris塩 酸 緩 衝 液 に て 希 釈 し て 反 応 溶 液 に 加 え た.UDP-Gal-T活 性 は, controlを100と し た 相 対 量 で 示 し た. 5. 統 計 処 理 数 値 は 平 均 値 ± 標 準 偏 差 で 示 し,分 散 分 析(ANOVA) を 用 い て 検 定 し, P<0,05以 下 を 有 意 差 あ り と判 定 し た. 結 果 1. in vivo実 験 各 種 酸 分 泌 抑 制 剤 を ラ ッ トに 投 与 す る と,い ず れ の 酸 分 泌 抑 制 剤 に お い て も 胃 内pHは 用 量 依 存 的 に 上 昇 し, そ れ に と も な いUDP-Gal-T活 性 はcontrolと 比 べ 有 意 に 低 下 し た(P<0.01)(Figure 1). 次 に 酸 分 泌 抑 制 剤 と と もにpH=2の 緩 衝 液 を経 口 投 与 し た と こ ろ,胃 摘 出 時 の 各 薬 剤 に よ る 胃 粘 膜 表 面pHの 上 昇 は,ほ ぼ 抑 制 さ れ, famotidine, roxatidineお よ び omeprazoleで はUDP-Gal-T活 性 の 低 下 も認 め ら れ な く な っ た.し か し, cimetidineお よ びranitidineで は, 胃 粘 膜 表 面pHの 上 昇 は 抑 制 さ れ た も の の, UDP-Gal-T活 性 は 有 意 に 低 下 し た(p<0.01). (Figure 2). 2. in vitro実 験 酵 素 検 体 に 直 接 各 種 酸 分 泌 抑 制 剤 を 加 え て, UDP-Gal -T活 性 を 測 定 し た と こ ろ, cimetidine(P<0.01)お よ びranitidine(p<0.05)は,用 量 依 存 的 にUDP-Gal-T活 性 を 有 意 に 低 下 さ せ た.famotidine, roxatidine,お よ びomeprazoleで は 有 意 な 酵 素 活 性 の 低 下 は 認 め ら れ な か っ た(Figure 3). 考 察 今 回,我 々 は 各 種 酸 分 泌 抑 制 剤 の 胃 粘 膜 防 御 因 子 に 及 ほ す 影 響 を 明 らか に す る た め,糖 蛋 白 質 合 成 に 関 わ るUDP -Ga1-T活 性 を 指 標 に 検 討 し た .い ず れ の 酸 分 泌 抑 制 剤 投 与 で も 胃 内pHが 上 昇 す る とUDP-Gal-T活 性 の 低 下 が 観 察 さ れ,胃 内 酸 度 に よ りUDP-Gal-T活 性,ひ い て は 胃 粘 膜 防 御 機 構 が 制 御 さ れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た. 胃 内 腔 のpHの 上 昇 に 伴 う 二 次 的 なUDP-Gal-T活 性 の 低 下 は,胃 粘 液 が 胃 液 内 の 塩 酸 か ら 粘 膜 を 防 御 し て い る こ と か ら,生 理 的 に 合 致 し た 変 化 と 考 え ら れ る .し か し, 緩 衝 液 に よ り 胃 内 酸 度 の 変 化 を 緩 衝 す る と, cimetidineお よ びranitidineの み で, UDP-Gal-T活 性 の 低 下 が み ら
Fig. 1 Changes of intragastric pH and UDP-Gal-T activities in rat gastric mucosa after in vivo administration of acid-secretion blockers. Values are expressed as means•}SD of six rats. *, P<0.05; **, P<0.01 vs. control. •œ, pH; •¡, UDP-Gal-T activity.
Fig. 2 Changes of intragastric pH and UDP-Gal-T activities in rat gastric mucosa after in vivo administration of acid-secretion blockers and citrate phosphate buffer (pH 2).
Cim, cimetidine; fam, famotidine; ran, ranitidine; rox, roxatidine; ome, omeprazole; cont, control; Bf(pH 2), citrate phosphate buffer (pH 2). Values are expressed as means•}SD of six rats. *, P<0.01 vs. control. •œ, pH; •¡, UDP-Gal-T activity.
142 木 原 康 裕 れ,こ れ ら 薬 剤 に はUDP-Gal-T活 性 に 及 ぼ す 直 接 作 用 が あ る も の と 推 測 さ れ た.こ の こ と は, in vitroに お い て, cimetidineとranitidineを 酵 素 検 体 溶 液 に 直 接 作 用 さ せ た 場 合 に も確 認 さ れ た.一 方, famotidine, roxatidine お よ びomeprazoleに は, UDP-Gal-T活 性 に 及 ぼ す 直 接 作 用 は 認 め ら れ な か っ た. 我 々 は,以 前 よ り本 酵 素 活 性 測 定 に よ る粘 液 糖 蛋 白 生 合 成 の 検 討 が 胃 粘 液 生 合 成 の 分 析 に 有 用 で あ る こ と を 報 告 し5,6),今 回 使 用 し た 各 種 酸 分 泌 抑 制 剤 の う ち, cimetidine, omeprazoleが, UDP-Gal-T活 性 を 低 下 さ
せ る こ と を 報 告 し て き た4).今 回 の 検 討 で は, cimetidine に よ る 本 酵 素 活 性 の 低 下 は,胃 内 酸 度 の 上 昇 に よ る 二 次 的 変 化 に 加 え,薬 剤 の 直 接 作 用 に よ る も の と 考 え ら れ, omeprazoleに よ る 変 化 と異 な る 機 序 が 存 在 す る こ とが 判 明 し た. こ の 薬 剤 自 体 に よ る 酵 素 活 性 低 下 機 序 に つ い て は,ヒ ス タ ミ ン がH2受 容 体 を 介 して 粘 液 糖 タ ンパ ク質 合 成 を 増 加 さ せ る と い う報 告7,8)も あ り, H2 RAがH2受 容 体 を 阻 害 す る こ と に よ り 生 じ る 可 能 性 が 考 え ら れ る.し か し, 本 実 験 で は,同 じH2 RAで も そ れ ぞ れ 酸 分 泌 を 同 程 度 に 抑 制 可 能 な 用 量 に お い て,本 酵 素 活 性 に 対 す る 作 用 に 差 が 認 め ら れ た こ と か ら, H2受 容 体 を 介 し な い 機 序 が 存 在 す る こ と が 推 測 さ れ た. 今 回 検 討 し たH2 RAの う ち で は, cimetidineお よ び ranitidineの み にUDP-Gal-T活 性 阻 害 の 直 接 作 用 が 認 め ら れ た.こ の2剤 に は 胃 のalcohol dehydrogenase9,10) や,肝cytochrome P-450酵 素 な ど11-14)他 の 酵 素 の 抑 制 作 用 も 報 告 さ れ て い る.そ し て,こ の よ う な 酵 素 活 性 に 対 す る 各 種H2 RAの 作 用 の 差 は, cimetidineの イ ミダ ゾ ー ル 環, ranitidineの フ ラ ン 環, famotidineの チ ア ゾ ー ル 環, roxatidineの 六 員 環 な ど 各 薬 剤 の 構 造 上 の 違 い (Figure 4)に よ る も の で は な い か と 考 え ら れ て い る9,10,12,13,15).今回 使 用 し た 各 薬 剤 に お け るUDP-Gal-T 活 性 に 対 す る 抑 制 作 用 の 違 い も 同 様 に,構 造 上 の 違 い か ら 生 じ る も の で は な い か と推 測 さ れ た. 今 回 の 検 討 に よ り 各 種 酸 分 泌 抑 制 剤 に は 胃 粘 液 糖 蛋 白 質 合 成 に 及 ぼ す 影 響 に 差 が 認 め ら れ る こ とが 明 ら か と な り,消 炎 鎮 痛 剤 服 用 者 や 高 齢 者 な ど,胃 粘 膜 防 御 機 構 の 低 下 が 予 想 さ れ る よ う な 患 者 で は,胃 粘 液 合 成 に 影 響 の 少 な い 酸 分 泌 抑 制 剤 を使 用 す る な ど,今 後 臨 床 上 薬 剤 を 選 択 す る 際 に 参 考 に な る 知 見 と 考 え ら れ た. 結 論 各 種 酸 分 泌 抑 制 剤 は,い ず れ も 胃 内pHの 増 加 に と も な い 糖 蛋 白 生 合 成 酵 素 活 性 を低 下 さ せ た.そ の 機 序 に は, 酸 分 泌 抑 制 に と も な う 二 次 的 な 作 用 と,酵 素 活 性 に 対 す る 薬 剤 自体 の 直 接 作 用 が あ る こ と,ま た,薬 剤 の 直 接 作 用 は,各 種 酸 分 泌 抑 制 剤 に よ り差 が あ る こ と を 明 ら か に し た. 謝 辞 稿 を終 え るに あ た り,ご懇切 な指 導 と こ校 閲 を賜 っ た恩 師 岡 山 大 学大 学 院 医 歯 学総 合 研 究科 消 化 器 ・肝 臓 ・感 染症 内科 学 教 室 辻 孝夫 教 授, 水 野 元夫 助 教 授,ま た,本 研 究 の 実施,検 討 に ご援 助 頂
Fig. 3 Direct effects of acid-secretion blockers on UDP-Gal-T activity in homogenates of rat gastric mucosa.
Values are expressed as percentages to the control value and presented as means •} SD of 5 samples. *, P<0.05 and **,
P<0.01 vs. control.
いた教 室 員 の 方 々 に深 謝 い た し ます.
文
献
1) Werther JL: The gastric mucosal barrier. Mt Sinai J Med
(2000) 67, 41-53.
2) Allen A and Garner A: Mucus and bicarbonate
secretion
in the stomach and their possible role in mucosal protec
tion. Gut (1980) 21, 249-262.
3) Strous GJ and Kramer
MF: Glycoprotein
synthesis
in
gastric epithelial cells of the rat. Properties of microsomal
glycoprotein glycosyltransferases.
Biochim Biophys Acta
(1976) 451, 201-211.
4) Hongo T, Tomoda J, Mizuno M, Maga T and Tsuji T:
Analysis of galactosyltransferase
activity in rat gastric
mucosa using crude mucosal
homogenate.
Acta Med
Okayama
(1991) 45, 301-308.
5) Maga T, Mizuno M, Tanaka S, Yoshinaga F, Mikami Y,
Kihara Y, Kiso T, Tomoda J, Okada H and Tsuji T:
Assessment of UDP-galactosyl-transferase
activity in gas
tric mucosa of patients with chronic liver disease using an
enzyme-linked
peanut agglutinin binding assay. Digestion
(1997) 58, 389-395.
6) Mikami Y, Mizuno M, Maga T, Kihara Y, Yoshinaga F,
Tanaka S, Yunoki N, Kawahara
T, Okada H and Tsuji
T: Geranylgeranylacetone
and cetraxate
hydrochloride
increase UDP-galactosyltransferase
activity in rat gastric
mucosa. Acta Med Okayama
(1997) 51, 245-249.
7) Heim HK, Oestmann A and Sewing KF: Effects of his
tamine on protein and glycoprotein production of isolated
pig gastric mucosal cells. Pharmacology
(1990) 40, 265
-270.
8) Scheiman JM, Kraus ER and Boland CR: Regulation of
canine gastric mucin synthesis and phospholipid secretion
by acid secretagogues.
Gastroenterology
(1992) 103, 1842
-1850 .
9) Caballeria J, Baraona E, Deulofeu R, Hernandez-Munoz
R, Rodes J and Lieber CS: Effects of H2-receptor
antago
nists on gastric alcohol dehydrogenase
activity.
Dig Dis
Sci (1991) 36, 1673-1679.
10) Pozzato G, Stebel M, Lunazzi G, Moretti M and Franzin
F: Influence of acid-secretion
blockers
on gastric
and
hepatic alcohol dehydrogenase
in rat.
Scand J Clin Lab
Invest (1992) 52, 747-752.
11) Pelkonen O and Puurunen J: The effect of cimetidine on in
vitro and in vivo microsomal drug metabolism
in the rat.
Biochem Pharmacol
(1980) 29, 3075-3080.
12) Rendic S,
Kajfez F and Ruf HH: Characterization
of
cimetidine,
ranitidine,
and related structures'
interaction
with cytochrome P-450. Drug Metab Dispos (1983) 11, 137
-142
.
13) Pasanen M, Arvela P, Pelkonen O, Sotaniemi E and Klotz
U: Effect of five structurally
diverse H2-receptor
antago
nists on drug metabolism.
Biochem Pharmacol
(1986) 35,
4457-4461.
14) Orishiki M, Matsuo Y, Nishioka M and Ichikawa Y: In
vivo administration
of H2 blockers,
cimetidine
and
ranitidine,
reduced the contents of the cytochrome
P450
IID (CYP 2D) subfamily and their activities in rat liver
microsomes.
Int J Biochem (1994) 26, 751-758.
15) Morita K,
Konishi H,
Ono T and Shimakawa
H: A
comparison of the inhibitory effects of roxatidine
acetate
hydrochloride
and
cimetidine
on cytochrome
P-450
- mediated drug-metabolism
in mouse hepatic microsomes
and in man in vivo. J Pharmacobiodyn
(1987) 10, 287
144 木 原 康 裕
