Beta‑alanine and Doparnine in the Reddish B r : own Scales  of  R α . p i  1  i o   Butter ・ f H es

Se i .   R e p .  Kanazawa U n i v .   Vo l .   2 8  N  o .   2  p p .  59‑67  December 1 9 8 3  

Beta‑alanine and Doparnine in the Reddish B r : own Scales  of  R α . p i  1  i o   Butter ・ f H es

Yoshishige UMEBACHI and Yumi ISHIZAKI 

Department 0 1  B i o l o g y ，  F . αcu

i f Kanazawa  K .

a z

0 ， ( R e c e i v e d  Octob

r3 0 ，  1 9 8 3 )  

A b s t r a c t   ( 1 )   R e d d i s h  brow

s c a l e s  o f  t h e  a n a l

yes p o t  i n   t h e  h i n d ‑ w i n g s  o f   P. 

d e m o [ e u s   and  P .  m a c h a o

haveb e e n  ex

min

df o r β ‑ a l a n i n e  and dopamine 

( 2 )   The s c a l e s  were f r a c t i o n a t e d  i n t o  70% e t h

n o l ‑ s o l u b !

f r a c t i o n ， 4% HC1‑methanol 

‑ s o l u b l e  f r a c t i o n ，  and t h e  r e s i d u a l  s c a l e s ，  and t h e β ‑ a l a n i n ε c o n t e n t  o f  each f r a c t i o n  was  d e t e n n i n ε d .   Most o f  theβalanine p r e s e n t  i n   t h e  s c a l e s  h a s  b e e n  f o u n d  i n  t h e  r e s i d

a l   s c a l e s .   On a c i d  h y d r o l y s i s  o f  t h e  r

i d u a ls c a l e s ，  t h e β ‑ a l a n i n e  h a s  been r a t h e r  r a p i d l y   r e l e a s e d ，  and t h e  h y c l r o l y s a t e  h a s  c o n t a i n

da  l a r g e  amount o f  βalanine. 

( 3 )   Th

p r o t e i n ‑ b o l l n dbrown p i g r n e n t   ( I ‑ I C I ‑ p p t  f r a c t i o n ) ，  which was e x t r

t

dw i t h   J  N NaOH a n c l  p r

p i t

t

dby b e i n g  a c i c l i f i

dw i t h  HC I .   h a s  c o n t a i n e d

l a r g eamount o f   βalanine.  1 n  most  0

a t  l e a s t  somεof thεβalanine ，  t h e  N  H

‑ g r o u p  h a s  b e

np r o v e d  t o   be f r

E

( 4 )   1 4 C ‑ L a b e l l e d β ‑ a l a n i n

andl ' C ‑ d o p a m i n e ，  which w

ei n j e c t e d  a t  p r e p u p a l   or  p u p a l   s t a g e

have been i n c o r p o r a t e d  i n   t 1 1

h i g h e s td e g r

ei n t o   t h

r e s i d u a l s c a l e s .   And t h e  

14 

C  ha

b ε

nc o n f i r m e d  t o  be p r e s e n t  i n   t h e  HCI'ppt  占 I f a c t i o n

( 5 )   A I l   t h e s

r e s u l t s i n d i c a t ε t h a t  t h

plgm

n to f  t h e  r e d d i s h  brown s c a l e s  c o n t a i n s   β ‑ a i a n i n e  and d o p a m i n ι  

l i n t J C o d u c t . i on 

but 

nor ommochl ・ omes Papiliochromes

1

¥ 1

and  Chernical 

and the main paie 

have also been studied to some exten :   I and name c ]   1 9 7 9 ) .  

。

^{t 1 1 e}   reddish brown  i n   th

‑ 59‑

papers 

6 0   Y. UMEBACHI and  Y .   I S H I Z A K I  

(Umebachi

1 9 7 8

1 9 7 9

1 9 8 3 )   are as follows :  ( 1 )   The pigment contains  kynurenine and  βalanine. 

The pigment i s  extractedas a  protein‑bound form with 

N NaOH  from the  reddish brown s c a l e s  and p r e c i p i t a t e d  by H C   l . But

during t h i s  procedure

most of the  kynurenine i s  l o s t .   ( 3 )  The s o l u b i l i t y  of the pigment i s   similar to that of melanin but the  pigment i s  not melanin. 

The protein‑bound pigment does not contain copper.  And 

the absorption spectrum of the protein‑bound pigment does not have any peak and the  absorbance progressively increases from  8 0 0   to  2 3 0 n m .  

The present paper deals with more d e t a i l e d  i n v e s t i g a t i o n s  of β‑alanine i n  the reddish  brown s c a l e s  and moreover shows that the pigment contains a l s o  dopamine. 

Materials and Methods 

M a t e r i a l s  

R e d d i s h  brown s c a l e s  o f  t h e  a n a l  e y e  s p o t  i n  t h e  h i n d ‑ w i n g s  o f  Pa 〆 ， ^{l i od e m o l e u s}   and P a t i l i ・ o machaon  were u s e d .  

For t h e  i n c o r p o r a t i o n ‑ e x p e r i m e n t s  o f  1 . C ‑ l a b e l l e d  compounds ，  young l a r v a e  o f  P.  machaon were  c o l l e c t e d  i n  t h e  f i e l d  and r a i s e d  i n  t h e  l a b o r a t o r y .   P u p a l  s t a g e  was 1 0  t o  1 3  d a y s  

Ex

t r a c t i o n  and  j ト

c t i o n a t i o

S c a l e s  were f i r s t  e x t r a c t e d  w i t h  70% e t h a n o l  a t  room t e m p e r a t u r e  and 4 0 ・ Cs e v e r a l  t i m e s ，  and t h e   combined e x t r a c t  i s   c a l l

d70% EtOH f r a c t i o n .   The r e s i d u e  was t h e n  e x t r a c t e d  w i t h  4% HCl‑methanol  a t  room t e m p e r a t u r e  f i v e  t i m e s .   The combined e x t r a c t  i s  named 4% HCI‑MeOH f r a c t i o n ，  and t h e  r e s i d u e   i s   c a l l e d  r e s i d u a l  s c a l e s ，  which were s t i l l   d a r k  b r o w n .  

The r e s i d u a l  s c a l e s  were f u r t h

rt r e a t e d  w i t h  1  N NaOH a t  room t e m p e r a t u r e  e i g h t  t i m e s .   Most o f   t h e  d a r k  brown p i g m e n t  was

x t r a c t e dby t h i s  e x t r a c t i o n .   The combined e x t r a c t  i s  r e f e r r e d  t o  below a s   1  N NaOH‑soluble f r a c t i o n .   The f i n a l  r e s i d u e  was b r o w n i s h  y e l l o w  

When t h e  1  N NaOH‑soluble f r a c t i o n  was a c i d i f i e d  w i t h  c o n c .   HCl and k e p t  i n  t h e  c o l d ，  t h e  d a r k   brown p i g m e n t  p r e c i p i t a t e d .   A f t e r  c e n t r i f u g a t i o n ，  t h e  s u p e r n a t a n t  was a l m o s t  c o l o r l e s s .   The p r e c i p i t a t e   i s   c a l l e d  HCl‑ppt f r a c t i o n .  

め

d r o l y s ι s

The a b o v e ‑ m e n t i o n e d  f r a c t i o n s  ( 7 0 %  E t O H ‑ s o l u b l e

4% HCI‑MeOH‑soluble

r e s i d u a l  s c a l e s

and HCl  p p t )  a s  w

1 1a s  t h e  o r i g i n a l  s c a l e s  b e f o r e  f r a c t i o n a t i o n  were h y d r o l y z e d  i n  6  N HCl a t  1 0 0

C  f o r  2 4  h r .   I n   some c a s e s ，  t h e  h y d r o l y s a t e  was d i l u t e d  t o  1  N HCl w i t h  w a t e r  and a p p l i e d  t o  t h e  Dowex 50W  x  4 column  ( 1  x  1 3 c m ) .   A f t e r  b e i n g  washed w i t h  w a t e r ，  amino a c i d s  were e l u t e d  w i t h  2  N ammonia w a t e r  and  l y o p h i l y z e d .   I n  some o t h e r  c a s e s ，  t h e  h y d r o l y s a t e  was e v a p o r a t e d  t o  d r y n e s s  i n  a  r o t a r y  e v a p o r a t o r  a t  6 0 。

C ，  and t h e  r e s i d u e  was k e p t  o v e r  NaOH i n  a  vacuum d e s I C c a t o r .   The β ‑ a l a n i n e  c o n t e n t  o f  t h e  r e s i d u e   t h u s  o b t a i n e d  was d e t e r r n i n e d .  

I n  some c a s e s ，  t h e  t i m e  o f  h y d r o l y s i s  and t h e  c o n c e n t r a t i o n  o f  HCl were c h a n g e d .  

D e t e

n i n a t i o n0 1 β ‑ a l a n i n e  

T h i s  was p e r f o r m e d  by t h e  DNP‑method ( S a n g e r  and Thompson ，  1 9 5 3 ) .   The sample ( t h e   a b o v e  

‑ m e n t i o n e d  h y d r o l y s a t e )  was d i s s o l v e d  i n  O . l m l  o f  1% t r i m e t h y l a m i n e ，  and 0 . 2 m l  o f  5% FDNB ( l ‑ f l u o r o  

2 ，  4 ‑ d i n i t r o b e n z e n e )  i n  e t h a n o l  was a d d e d .   A f t e r  s t a n d i n g  f o r  2 h r  i n  t h e  d a r k ，  t h e  s o l u t i o n  was s u b m i t t e d  

B e t a ‑ a l a n i n e  and Dopamine i n  t h e  R e d d i s h  Br

S c a l e s 0 / んがJ め B u t t e J

l i e s 6 1  

t o  two‑dimensional t h i n ‑ l a y e r  chromatography w i t h  s i l i c a  g e l  s h e ε t  (M

r c k ， N  0

5 5 5 3 ) .   The s o l v

n tf o r  t h

f i r s t  d i r e c t i o n  was t h e  o r g a n i c  l a y e r  o f  t o l u

n e ， c h l o r o e t h a n o l ，  p y r i d i n ε ，  and 0 . 8  N ammonia water mixture  ( 5 :  3 ・ 1 . 5:  3 )   and I o r  t h e  second d i r

c t i o n ， a  mixture o f  chroloIorm ，  b e n z y l a l c o h o l ，  and a c e t i c  a c i d  ( 7 0  :  3 0  :  3 ) .   A f t e r  development ，  a b s o r b a n c e  o f  t h e  y e l l o w  s p o t  o f  DNPβalanine on t h e  chromatogram was  measured w i t h  a  Shimazu 9 2 0  TLC s c a n n e r ，  which c o u l d  p

rfonna  z i g ‑ z a g  s c a n  o v ε r  a  s p o t  and i n t e g r a t e   t h e  v a l u e s  o f  a b s o r b a n c e .  

Amino a c i d  a

a l y s e s

The r ε s i c 1 u a l  s c a l e s  and HC!‑ppt f r a c t i o n  from  P .  d e m o l e u s  were hydrolyzed a s  m e n t i o n e c l  above ，  and  amino a c i c 1 s  o f  t h e  h y d r o l y s a t e s  were a n a l y z e c 1   w i t h  a  Nihon‑D

n s h i200A amino a c i d  a n a l y z e r .  

D i n i t r o 戸 h e n y l a t i o n 0 /   t h e  HC1‑ptt メ l

c u o n

Th 日目 C I ‑ p p tf r a c t i o n  from  P .  d e m o l e u s  was d i s s o l v e c l  i n  1  N NaOH a n c l  a p p l i e c l  t o  t h

Dow

x50Wx 4 column ( 1  x  1 3 c m ) .   The column w

sw

s h e dw i t h  watεr ，  a n c l  t h e n  t h e  brown pigment was e l u t e d  w i t h  2  N ammonia wat

r(Umebachi ，  1 9 7 8 ，  1 9 7 9 ) .   The pigment was e l

d

hεado f

minoa c i c l  f r a c t i o n .   The  c l a r k  brown e f f l u e n t  was c o l l e c t e d  and I y o p h i l y z e d .   The r e s i d u e ，  which was t h e  p r o t e i n ‑ b o u n d  dark brown  pigment ，  was washe c 1   w i t h  wat

r ， d i s s o l v e c l  i n   1  N N  aOH ，  and p r e c i p i t a t e d  w i t h  c o n c .  HC .   I The d

r k brown p r e c i p i t a t e  was i u r t h e r  washed w i t h  water and d i s s o l v e d  i n   1ml o f  5%  1 ' 1   aHC0

，  a n c l  2ml o f  5% 

FDNB i n  e t h a n o l  w

sa d d e d .   A f t e r  s t a n d i n g  f o r  3 h r  i n  t h e  dark ，  t h e  solutionwas a c i d i f i e c 1   w i t h  t h r

d r o p s o f  c o n c .  HCl ョ n c lwashed w i t h  e t h y l  e t h e r .   A f t e r  b e i n g  f u r t h

rw a s h e c l  w i t h  w

t e r 、 a c e t o n e ， and e t h y l   e t h e r ，  t h e  p r

c i p i t a t ewas hy c 1 r o ! y z e d  i n  6  N HCl a t  1 0 5 > (  f o r  1 5 h r  i n

s e a l ε dt u b e .   Th

h y d r o l y s a t ewas  d i l u t e d  t o  1  N HCl with w

t e rand e x t r

c t

dw i t h  e t h y l  e t h e r  t h r e e  t i m e s .   The c o m b i n e c l  e t h

rl a y e r  was  evaporated t o  c l r y n e s s

d i s s o l v e c l  i n  a c e t o n e

nds u b m i t t e d  t o  t w o ‑ d i m e n s i o n a l  t h i n ‑ l a y e r  chromatography  i n   t h e  sam

v v a ya s  u s

c lI n  t h e  d

t e r m i n a t i o no f  s‑alanin

I n c 0 1 p o r a t i ω

o f  

C  ‑ l a b e t ! e d β a l a n i

eand d o 戸 amzne

Th

l a b e l l e d compounds u s e d  w

reβ‑alanin

[ 1 ‑1 4 C ]   (Nεw England N  u c l ε a r ;  s p e c i f i c   a c t i v i t y ，  5 4 .  7μCi p e r  1 1 1   mo l )  

n c 1dopami

[ s i d ec h a i n ‑ l ‑ " C]  (Amer

ham; s p e c i f i c  a c t i v i t y ，  56μCi p e r  m m o l ) .   Exp

r i m e n t

werea l l   p

r f o r m E

dw i t h   P 

a c h a o n .  The l a b e l l ε d  compounds were u s e d  a s  a  wat

rs o l

t i

1 ， r e s p e c t i v

l y ， and 0 . 0 2   t o  0 . 0 6 r

1 ( ( J . 6   t o  2 μ Ci)ぱ i t  was i n j e c t e d  a  t  t h

) ) r

p u p a ls t a g e  0

5‑7days a f t ε r   p u p a t i o n  

A f t e r  emergence o f  b u t t

r f l y ， a u t o r a c l i o g r a p h  o f  t h

wingswas t a k

l い ' N i t ha  Sakura Medical X  ‑ray  f i l m

t o ' p eA .   ' 1 ' 1 1

t i m e0 1  exposur

was1 4  t o  2 1   d a y s .   1 、 hen ， t h e  r e c l d i s h  b γ 。 l I ^{/ ns c a l}

^{s" V}

^{r es c r a p ε d  and} 

t r

a t e dw i ! h  7 0 ; : o

: h a n o la n c l  

1 ; ¥ ;   HCl‑methanol s u c c e s s i v e l y

smentioned a b o v e .  The 7 0 ' J " ;   1 よ tOHf r a c t i o n   and  ， 1% HCI‑MeOH f r a c t i o n  w

r ee v a p o r a t e d  t o  d r y n e s ョ i nc o u n t i n g  v i a l s ，  r

s p

c t i v e l y . Th

r e s i d u a l s c a l e s  were a l s o  t r a n s f c

eclωa c o u n t i n g  v i a l .   To t h e  d r y  sample i n   t h e  c o u n t i n g  v i a l   t h u s  o b t a i n e d ，  O

5mlo f  wat

dlml o f  t h e  s o l u b i l i z e r   ' ‑ 、 ， ( 1 TCSo I  A l n e r s h a l Y U  ¥ V ε r e  a c l d e c l .  A f t e r  t h e  sample was warmed  a t   50T f o r   ' o

v e r a lhO

r s .   0 . 0 3 m ]   o f   g l

c i a l a c

t i c a c i c 1   and 8m1 o f   s c i n t i l l a t i o n   c o c l : t a i l   (ACS  I I   o I   A m

r d l a l η i

τεadd

d . A f t e r  t h

C

u n t i n gv i a l  

o n t a i n i n g  l h e  

a r n p ] c  ¥ v a s  1 ; ; : ε p t   i n  t l J ε r ε f r i g e r a t o r  f o r  2  t o   6days

dp

1

仁、

mcasuredw i t h  a  Beckman  . L S‑900 り l i q u i d

c o u n t e r  

1 n  som

c a s e s t h er a d i o a c t i v e  r e d d i s h  b r : ywn s c a l ε S  " ¥ V e r

washedw i t h  7 0 : : 6

t h a n o l1

p e a t

dlyand t h e n  ¥ v e r

h y d r o l y z ε di n  6  N HCl a t  l O O o C  f o r  2 4  h r .   The h y d r o l y s a t e  was f i l t e r e d  t h r o u g h  C e n t r i f l o w  CF 

‑25 { / ¥ n u c o n J ，  and t h e  f i 1 t r

l : e¥ v a s  e v a p o r a t e d  t o  dryn

i na  r o t a r y  e v a p o r a t o

a t  6 0 " c '   A f t

rb e i n g  k e p t   0

ε r 、 J a O I ‑ I i n   a  VaC

1 1

c l e s i c c a t o r .   t h e  r e s i d u

s

i n  

nd s u b m i t t e d   : 1 0 o n c  

‑ d i r n e n s i o n a l  t h i n ‑ l a } .  

rc h r o r n a t o g l

phy0 1 1   a c e l l u l m

s h e e t  

N  o .   5 5 5 2 ) '

i t h   a mixt

r e   o f  

6 2  

U M E B A C H I  a n d  Y .  I S H I Z A K I  

‑ b u t a n o l ‑ a c e t i c  a c i d ‑ w a t e r   ( 1 2  :  3  :  5 ) .   R a d i o a c t i v i t y  o f  t h e  c h r o m a t o g r a m  was m e a s u r e d  w i t h  a  B e r t h o l d   r a d i o a c t i v e  c h r o m a t o g r a m  s c a n n e r .   The n i n h y d r i n  r e a c t i o n  was a l s o  c a r r i e d  o u t .  

I n  s o m e  o t h e r  c a s e s ，  t h e  r a d i o a c t i v e  r e d d i s h  b r o w n  s c a l e s  w e r e  t r e a t e d  w i t h   70%  e t h a n o l ，  4%  H C l   m e t h a n o l ，  a n d   1  N NaOH s u c c e s s i v e l y  a s  m e n t i o n e d  a b o v e .   The H C l ‑ p p t  f r a c t i o n  was p r e p a r e d  f r o m   t h e   1  N N a O H ‑ s o l u b l e  f r a c t i o n ，  a n d  i t s   r a d i o a c t i v i t y  was m e a s u r e d  w i t h  t h e  a b o v e ‑ m e n t i o n e d  l i q u i d  

s c i n t i l l a t i o n  c o u n t e r .  

R e s u l t s   l n c o r p o r a t i o n  0 1  1 4 C ̲ β ‑ a l a n i n e  

An a u t o r a d i o g r a p h  o f  t h e  wings from t h e  b u t t e r f l y   ( P .   m a c h a o n )   which was i n j e c t e d   with 14C‑β‑a l a n i n e   a t  t h e  p u p a l  s t a g e  i s   g i v e n  i n  F i g .  l a

which shows t h a t  t h e  1 4 C  was  i n c o r p o r a t e d  i n t o  n o t  o n l y  t h e  deep y e l l o w  s c a l e s  b u t  a l s o  t h e  r e d d i s h  brown s c a l e s  o f  t h e   a n a l   e y e   s p o t .   The b u t t e r f l y   which was i n j e c t e d   a t   t h e   p r e p u p a l   s t a g e   gave  a l s o   s u b s t a n t i a l l y  t h e  same a u t o r a d i o g r a p h .  

The r a d i o a c t i v e  r e d d i s h  brown s c a l e s  were s c r a p e d  and h y d r o l y z e d  i n  6  N  HCl

and t h e   h y d r o l y s a t e  was s u b m i t t e d  t o  o n e ‑ d i m e n s i o n a l  t h i n ‑ l a y e r  chromatography.  The r e s u l t  o f   r a d i o a c t i v i t y  s c a n n i n g  on t h e  chromatogram i s  g i v e n  i n  F i g .  2 ，  which shows t h a t  t h e  s c a l e s   i n c o r p o r a t e d  14Cβ‑alanine and t h a t  r a d i o a c t i v e  s u b s t a n c e  o t h e r  than 1 4 C ̲ β ‑ a l a n i n e  i s   a b s e n t  o r ，  i f   any p r e s e n t ，  i t   i s   o n l y  a l i t t l e .   Of c o u r s e ，  many n i n h y d r i n ‑ p o s i t i v e  c o l d  

F i g .   1 .   A u t o r a d i o g r a p h s  o f  t h e  w i n g s  o f   P .   machaon  w h i c h  was i n j e c t e d  w i t h  ( a )   1 4 C ‑

β a l a n i n e  o r  ( b )   1 4 C ‑ d o p a m i n e  a t  t h e  p u p a l  s t a g e .   R ，  r e d d i s h  b r o w n  p a r t .  

Beta~ala目t刀e

andDopami

ei n  t h e  R e d d i s h  Brow

S c a l e s 0 1   P a P i l i o  B u t t e 1 ブ ' Z i e s 6 3  

い 品 川 山 川 内 向 山 A h M

巳

;JEl

F i g .   2

R a d i o a c t i v i t y  s c a n n i n g  o f  

chromatogram o b t a i n ε d  w i t h   t h

h y d r o J y s a t

o f   ^{1 4 (} 二 一 β

r

d d i s h brown  s c a l e s   ( P .   machaon)

The chromatogram shows 

5 ，  s t a r t i n g  l i n e  ;  F ，  t h e   f r o n t  o r  s o l v

n t

T a b l

L D i s t r i b u t i o n   o f  r a d i o a c t i v i t y   i n   t h e  

r e d d i s h   brown s c a l e : o   (p

m . a c h a o n )   ( 1 "

r c e n t a g eo f  t h e  t o t a l  r a d i o a c t i v i t y )  

一

SUDsrancρs 

F r a c t i o n   R a c i i o a c t i v i t !   d u P l n l 1

/ 0  

7 0 ' l

o  EtOH  4% 

32  1 4 . 5   8 2 . 3  

amino a c i . ds ¥ N e r . e 

F ' r o r n

heradioac : t i v e   rεddish brown  HCI‑MeCiH  and r e s i d u a l   s c a l e s   were  prepared

and  o f

ach f r a c t i o n   was  measured.  The r e s u l t s  are  i n  Table 1   ， ' N h i c h  shows t h a t  most o f  t h e  1 4 C  i s   preSe i 1 t  i n  t h 日 : : ' e

duals c a l e s  

Moreovεr ，  the radioactive r e s i d u a l  s c a l e s  w

eextracted w ' I t h  1  N  and  t h e  

!lCJ‑pp : l γ e H : t i o n   from 

he    . 1 N '   N  aOH  ‑ ， ^{o o l u b l e   f r a c t i o n  was con l I nned t o  be} 

1' a仁~1()a('， C1V色。

' T . " J

b J e   B e t a ‑ a l

U 1 l r J ec o n t e n t s  i o   t h e  r ε c l d i

0 γ ¥ 1 ns c a l e s  o f   二 } T a t i ! i o( u g   p

r n g  d r y  ' v v e i g h t  0 1

c a l e s )

.

s p e c i e s   d e

w た US

β/uani

e

定

N l e a n 士 S . E o

1 " : '   " 1 ' 1 1

n U l n l

u f  d e t e n 1 1 ] n a b o

i s   shown i n  

J

n t h

B e t a ‑ t t l a η i

l e con l e f 1 . t s   s

，

t

u c h

6 1 . 9  ( 1 )  

fh

ピ reddish

d e ‑ n l o u : ; u s  and  j J .   F n a c l u l

J

¥ ^ l εre  a t  1 0 0 ' (

f o r24br

a n ( l  r h e  

Table  which 

t h a (  tbe 

eddish brown s c a l e s  contain about 6 0  

i n  6  ' r ， T  HCl 

m 

Y .  U M E B A C H I  a n d  Y .  I S H I Z A K I   6 4  

mg  d r y  w e i g h t  o f  s c a l e s .  

D i s t r i b u t i o n  0 1   β ‑ a l a n i n e  i n  t h e   s c a l e s  

The 70% EtOH f r a c t i o n ，  4% HCl‑MeOH f r a c t i o n ，  and r e s i d u a l   s c a l e s   from t h e   r e d d i s h  brown s c a l e s  were h y d r o l y z e d  i n   6  N HCl

and t h e i r  β ‑ a l a n i n e  c o n t e n t s  were 

D i s t r i b u t i o n   ofβalanine  i n   t h e   r e d d i s h   b r o w n   s c a l e s   ( P e r c e n t a g e  o f  t h e  t o t a l  β ‑ a l a n i n e )  

T a b l e   3 .  

m a c h a o n  

一

1 ・

d 1 i p b

d e m o l e u s  

/ 0 9 q u  

o ‑ ‑ Q

山

F r a c t i o n   7 0 %  EtOH  4% HCI‑MeOH  R e s i d u a l  

s c a l e s   S p e c i e s  

9 2 . 5  

d e t e r m i n e d .   The r e s u 1 t s  a r e  g i v e n  i n  Table 3

i n  which t h e  q u a n t i t y  ofβalanine i n  e a c h   f r a c t i o n  i s   g i v e n  a s  p e r c e n t a g e  o f  t h e  t o t a l  β ‑ a l a n i n e  c o n t e n t .   The t a b l e  shows t h a t  a b o u t   9 0  p e r  c e n t  o f  t h e  t o t a l  βalanine i s   i n s o l u b l e  i n   70% e t h a n o l  and 4% HCl‑methanol and  r e m a i n s  i n  t h e  r e s i d u a l  s c a l e s .  

8 6 . 2  

R e l e a s e  0 1   β a l a n i n e  b y  a c i d  h y d r o l y s i s  

The r e s i d u a l  s c a l e s  o f  P. demoleuswere h y d r o l y z e d  i n  6  N  HCl a t  1 0 0

C  f o r  2 . 5

5 . 5

1 1 .   5

and 2 4 h r ，  and β ‑ a l a n i n e  o f  t h e  h y d r o l y s a t e  was d e t e r m i n e d .   As s e e n  i n  F i g .  3 ， β ‑ a l a n i n e   i s   r a t h e r  r a p i d l y  r e l e a s e d  on a c i d  h y d r o l y s i s

t h o u g h  i t   t a k e s  2 4 h r  t o  r e l e a s e  t h e  t o t a l  β 

a l a n i n e .  

O 

0‑

100 

( ポ )

ω Z

E D

‑ ︽ ち Ehx

ω ω ロ ω

ω

16  24 

( h r )  

8 

Time 

R e l e a s e   o f   β a l a n i n e  f r o m  t h e   r e s i d u a l   s c a l e s   o f   P .   d e m o l e u s   b y   a c i d   h y d r o l y s i s   ( 6   N  H C l ，  1 0 0 ' C ) .  

F i g .   3 .  

B e t a ‑ a l a n i n e  a

dDopamine i n   t h e  R e d d i s h  Brown S c a l e s   0 /   P a p i l i o  B u t t e r f l i e s   6 5   T a b l e  4 .   M o l a r  r a t i o s  o f  a m i n o  a c i d s  i n  t h

h y d r o l y s a t e so f   t h e  r e s i d u a l  

s c a l e s  a n c l  H C l ‑ p p t  f r a c t i o n  f r o m  P .  d e m o l e u s  

Amino

c i d

Asp  Thr  S e l   G l u   Pro  G l y   A l a   Val  I l e   L e u   Tyr  Phe  βAla  Ky

L y s   H i s   Arg 

R e s i d u a l *   s c a l

S

3 . 3

3 1 . 8  1 6 . 4   3 1 . 5  5 7 . 6   5 7 . 1   1 0 0 . 0   1 0 2 . 1   5 8 . 7   3 3 . 1   4 7 . 0   3 2 . 0   8 . 9   2 8 5 . 0   4 . 9   1 3 . 0  2 3 . 9  

E x p e r i m e n t a l   N  0  2  R e s i d u a l * *  

s c a l

3 . 7   4 0 . 7   2 6 . 2   4 1 . 9  4 2 . 8   5 5 . 1   1 0 0 . 0   9 4 . 7   1 1 1 . 0   3 2 . 4   4 6 . 3   4 1 . 0 

9 . 5   1 9 7 . 8   1 2 . 3   1 5 . 5   2 7 . 5   2 1 . 7  

3  日 C l ‑ p p t

f r a c t i o n   2 7 . 6   3 6 . 6   2 3 . 0   3 1 . 1   8 8 . 0   4 4 . 4   1 0 0 . 0   7 2 . 0   8 4 . 4   3 7 . 7   5 3 . 0   2 3 . 0   1 9 . 5   4 9 8 . 1   T r a c ε  

2 0 . 2   6 4 . 6  

本

Theh y d r o l y s a t e  was d

s a l t e dt h r o u g h  t l 1 巴 Dowex5 0 ' 0 1   c o l u m n   T

h y d r o l y s a t e

v a s  e v a p o r a t e d  t o  d r y n e s s  i n   a  r o t a r y

v a p o r a t o r . T 乱 1 0 1 a r

t l O S

r

g I V

st h e  v a l u

f o r1 0 0  o f  g l y c i n e  

i . t   T h i s  i n c 1 u d e s  1 1 1

t h i o n i n

a n dm e t h i o n i n ε s u l f o x i d e .  

J ‑ l r n i n o  aad  t h e   r e s i d u a l  s c a l e s ω l d  HC1‑ T μ 

The r c s i d u a l  s c a l e s  o f   P .   d e r n o l e u s  were  i n   6  N HCl a t  1 0 0 ' (  f o r  24hr

and  was d e t e r r n i n e d  with t h e  amino ; : I c i d   1 、 her e s u l t s  a r e   g i v e n  i n   N  o s .   1  and 2  o f  Table 4

i n  which t h e  molarγatios o f  amino a c i d s   a r e  given a s  thεva!ues f o r  1 0 0  o f  g l y c i n e .   The Expermεntal N  o s

1  and 2  show t h a t  t h e   r e s i c 1 1 . l a l  s c a i ε s  contain much more  than o t h e r  a

i n o  a c i d s .  

Moreuver

t h e  HCI‑ppt f r a c t i o n   ・ I f om1

demol

1βV

} s h y d r o l y z e c l i

t h esame

vay a s  i n  th

r e s i d u a l an c 1   t h e  aminu a c i d  conwosition 

vas d e t e r m i n e d .   The r e s u l t  i s   glven 1 1 1  

a l s o  a  g r e a t  

ト J . 0

3  o f  Table 4

which s I 1 0ws t h a t  t h e  HCI‑p p t  f r a c t i o n  c o n t a i n s   o f  

t h e  HCI 一片i

The H 仁 1 ‑p p t  f r a c t i o n   f r o 1 1 1   P .   demoleuS¥NaS 

and submitted t o   t h i n ‑ l a y e r   a s  d e s c i r i b e d  i n   t h e  s e c t i o n  o f   methods.  Th

chromatogramc l e a r l y  showed t h e  

o f  D N P β t h e   s p o t  o f  w ア I 1 i c hwas  c 1 i s t i n c t  and p 1

dominant. Although DNP‑a‑alanlne a 口 d

も

verea 1 s o   t l l e l r  spotswere 

6 6   Y U ! v ! EBACHI  a n d  Y o  I S Hl Z A K l  

0/14C‑do 仰

mzne

An a u t o r a d i o g r a p h  o f  t h e  wings from t h e  b u t t e r f 1 y  which was i n j e c t e d   w i t h  1 4 C ‑ d o p a m i n e  a t  t h e  p u p a l  s t a g e

i s   g i v e n  i n   F i g o  I b

which shows t h a t  t h e  1 4 C  was  i n c o r p o r a t e d  i n t o  n o t  o n l y  t h e  

a n a l  e y e  s p o t .  

s c a l e s  b u t  a l s o  t h e  r e d d i s h  brown s c a l e s  o f  t h e  

T a b l e   5 0   D i s t r i b u t i o n   o f   r a d i o a c t i v i t y   i n   t h e   1 4 C ‑ d o p a m i n e ‑ i n c o r p o r a t

d r e d d i s h  b r o w n  s c a l

s (P machaon)  ( P e r c e n t a g e  o f  t h e  t o t a l  r a d i o a c t i v i t y )   F r a c t i o n  

R a d i o a c t i v i t y   dpm ，  % 

M

an+S .K

70% EtOH  7 0 6 十1. 0 *

( 3 )

4% HC1‑MeOH  1 1 . 3 寸 1 . 2

( 3 )  

付

Th

u m b e ro f  d e t e r m i n a t i o n  i s   s h o w n  i n   p a r e n t h e s i s o  

8 0 . 1 : t 1 . 5  ( 3 )  

From t h e  r a d i o a c t i v e  r e d d i s h  brown  t h e   EtOH

CI‑MeOH and r e s i d u a i  s c a l e s  were p r e p a r ε d

and t h e   o f  each f r a c t i o n  was  m e a s u r e c L   The r e s u l t s  a r e  g i v e n  i n  Table 5

which s h o ¥ ) ¥ l S  t h a t  most o f  t h e  1 4 C  i s   p r e s e n t   i n  t h e  r e s i d u a l  s c a l e s o  

The r a d i o a c t i v e  r e s i d u a l  s c a l e s  were e x t r a c t e d  w i t h   1  N  and t h e   HCl‑ppt  f r a c t i o n   from t h e  

N N  aOB  ‑ s o l u b l e  f r a c t i o n  was c o n f i r m e d  t o  be r a d i o a c t i v e .  

D i s C l 1 S

I l

I 1 l  

From t h e  r e s u l t s  o f  t h e   p a p e r s   1 9 8 3 )  and t I 1 e  p a p e r ，  t h e r e  i s   no d o u b t  t h a t  t h e  r e d d i s h  brown  o f   p ゆがめ ， i sn o t  ommochrome b u t   t h e   v l h i c h  i s   r e l a t e d  t o  k y n u r e n i n e

and  For t h i s  r e a S O

t h e   h a s  been named  R ，   Ford  b )   h a s  d i v i d e d  r e d   o f   t h e  P a p i l i o n i d a e  i n t o  two t y p e s  A and  R  The  o f  typεA i s   d i s t r i b u t e d   i n  

司

v v h i l et h e   o f  t y p e  

i s   f o u n d   i n  t h e  P a p i l i o n i d a e

and  BaUus 

R  o f  t h e  p r e s e n t  p a p e r  

: n   t o  t h e  r e d   o f  t y p e   R  E x a c t l y   t h e  c o l o r  o f  t h e   i s   n o t  r e d  b u t  r e d d i s h  b r o w n .   The p r e s e n t   p a p ε r  i n d i c a t e s  t h a t  t h e  HC1‑ppt f r a c t i o n  c o n t a i n s  a  g r e a t   o f   β t h a t   theβalanine 1 S   r e l e a s e d  on a c i d   t h a t  t h e  N H ₂ ‑group o f   most o r  a t  l e a s t  some o f  theβalanine i s   f r e e

and t h a t  t h e  1 4 C  βalanine  i n t o   t h e   can be r e c o v e r e d   a s   S L 1 c h o   The p r e s e n t   p a p e r   f u r t h e r m o r e   shows t h a t   i n t o  t h e   b u t  t h e  p r o p e r t y  o f   t h e   h a s   remained u n s e t t l e d o   The e i u c i d a t i o n   o f   t h e   s t r u c t u r e   o f   P a p i l i o c h r o m e   R  i s   r a t h e r   i s   e x t r a c t e d  a s  a  p r o t e i n ‑ b o u n d  form w i t h   1  N N  aOH and s i n c e   most o f  t h e   p r e s e n t  i n   t h e   i s   l o s t   t h e  e x t r a c t i o n  w i t h  

N : N  aO  I ‑ L 

from t h c  f a c t  t h a t   n  i s   o f ε a n d   N  t h e r e  i s   t h e   t h a t  P a p i i i o c h r o m e   R  i s   a  k i n d  o f   o f  : N  

一 β'U'VPCWUU''‑'

v ! i i t h  which someεcombines  and t h a t  s u c h   maybe 

bonded t o  t h e  s c a l e  

B e t a ‑ a l a n i n e   ω z d  1 ヌ o 戸 aminei n  t h e  R e d d i s h  Bmwn S c a l e s   0 1   P a p i l i o  B u t t e r f l i e s   6 7  

The reddish brown pigments of  P.  macmwn and  P.  demoleus seem to be substancially  the same.  But the reddish brown s c a l e s  of  P.  machaon contain small q u a n t i t i e s  of pale  ye l 1 0w  pigments (Papiliochrome I I   and I H )  i n   addition t o  Papiliochrome  R .   On  the other  hand

the reddish brown scales o f   P.  demoleus hardly contain thc pale yellow pigments  (Umebachi

1 9 7 7 b ) .   Therefore the reddish brown s c a l e s  o f   P

rnachaoni s   more browr 由 h than those o f   P . ι lemoleus 

F i g s .  l a  and l b  show that both 14Cβalanine and  are incorporated i n t o   not only the reddish brown scales but a l s o  the deep  s c a l e s .   In f a c t

the deep yellow  pigment I s  a l s o  r e l

tedto kyn l 1 renine

βι i 1 anine

and dopamine. Chemical properties of the  pigment w i l l  be  elsewherε. 

Acknowledgement 

We  a r e  r n u c h  i n d e b t e d  t o  D r .   l V I .   O s a n a i  and  D r .   Y .  Yonezawa o f  t h e  Tokyo  M e t r o p o l i t a n  I n s t i t u t e  o f  G e r o n t o l o g y  f o r  amino a c i d  a n a l y s e s  w i t h  t h e  a r n i n o  a c i d  a n a l y z e r .  

R

r

ces

Ford  E .   B .  ( 1 9 4 4 a )  S t u d i e s  on t h e  c h e m i s t r y  o f  pigm

n t si n  t 1 1 ε L e p i d o p t

r a ， w i t h  r

f e r e n c et o  t h e i r  b ε a r i n g   on s y s t e m a t i c s .  3 .   、 ' I h er ε d  p i g m e n t s  o f  t h e  P a p i l i o n i d a e .   P r o c .  R .  E n t .   S ， 口 c .Lo

d .( A )  1 9 ，  9 2 ‑ 1 0 6 .   Ford E .   B .   ( 1 9 4 4 b )  S t u d i e s  on t h e  c h

m i s t r yo f  p i g m e n t s  i n  t l 1 e  L e p i d o p t e r a ，  w i t h  r e f e r

n c

i ot l l e i r

b e a r i n g

on s y s t e m a t i c s .  4 .   The c l a s s i f i c a t i o n  o f   t h e   P a p i l i o n i d a e .   T r a n s .  R .  E n t .  S o ι Lond. 9 4

2 0 1 ‑ 2 2 3   Rembold H . ，  R a s c h e r   ] . ，   Eder  J . ，  and Umebachi Y .  ( 1 9 7 8 )  P a r t i a l  s t r u c t u r e  o f  P a p i l i o c h r o m ， 邑 t h e  y e l l o w  

wing pigm

n to f  t h e  p a p i l i o n i d  b u t t

r f l i ε S . Z .   N a t u l f o r s c h .  3 3 c ，  4 9 8 ‑ 5 0 3 .  

Rembold H .  and Um

b a c h iY .  ( 1 9 8 3 )  Th

s t r u c t u r eo f  P a p i l i o c h r o m e  I I ，  t h e  y e l l o w  wing pigm

n to f  t h e   p a p i l i o n i d  b u t t e r f l i e s .   1 n  I 1 z e   P r o c e e d u l g s   0 1   t h e  4 t h  l n l e r n a t i o n a l  M e e t i n g   0 1   T r y p f o l

hanM e t a b o l i s m   ( i n  p r

8 S ) .

Sanger F .   and Thompson K P .   O .  ( 1 9 5 3 )  Th

a m i n o ‑ a c i ds e q u e n c

i nt h e  g l y c y l  c h a i n  o f  i n s u l i n .   1 .   Th

i d e l

i f i c a t i o no f  l o w e r  p e p t i d

sflom p a r t i a l  h y d r o l y s a t e s .   B i o c h e r n .   1 .   5 3 ，  3 5 3 ‑ 3 6 6 .  

Umebachi Y .  ( 1 9 7 7 a )  Comparison between y e l l o w  p i g m e n t s  o f  t h e  w i n g s  o f  P a p i l i o   n z a c h a o

andt h o s e  o f   P .  x u t h u s .  S ' c i .   l ? ゆ RanazawaU n i v .  2 2 ，  9 1 ‑ 1 0 1  

Umebachi Y .  ( 1 9 7 7 b )  D i s t r i b u t i o n  o f  P a p i l i o c h r o m e  i n  p a p i l i o n i d  b u t t

r f l i e s . S c i .   R e t .   f( an

z a 加 。 U n i u . 2 2 . 1 8 7 ‑ 1 9 5  

Umebachi Y .  ( 1 9 7 8 )  Red pigm

n t so f  t h e   w i n g s  o f  p a p i l i o n i d  hu

r f l i e s .E x t γ a c t i o n  and p u r i f i c a t i o n .   S c i   R c p .  Kanazawa U n i v .  2 3 ，  1 1 9 ‑ 1 2 8  

LJm

b a c h iY .   ( 1 9 7 9 )  Compariso l 1   between t h e  t y p e  B p i g m e n t  and l n e l a n i n   o f   t h e  p a p i l i o n i d  b u t t ε r f l y ，  h l t i h : o  d e r n o l e u s .  S c i .   R e )

Ka η a z α

ι I n i o .2 4 ，  7 3 ‑ 7 9  

Umebachi Y .  ( 1 9 8 0 )  Wing‑pigments d e r i v

c lfrom t r y p t o p h

ni n  bu t 1 : e r f l i e s .   1 n  B i o c h e m i c a l  and M e d i c a l   Aspeas 0 /   7 ' r ) ' 1 ' l o 戸 han 1 1 . J e f a b o l i s r n   ( E d .  by H a y a i s h i  O .  e t  a l よ p p . 1 1 7 ‑ 1 2 4 . E l s e v i

r

Amst

rdam Umebachi Y .  ( 1 9 8 3 )  Somεprop

r t i e so f  t h e  k y n u r e n i n e  p r e s ε n t  i n  w i n g ‑ s c a l e s  o f  1 勺 戸 i l i ob u t t

r f l i e s . C 0 1

t .

B i o c f

: m .P h . ¥

l .75B ，  5 7 1 ‑ 5 7 4 .  

U r n e b a c h i  Y .  a n c l  Yamashita H .   ( 1 9 7 6 )  C l e a r  e v i d e n c e  f o r  t h e  p r e S e

C

o fβalanine a s  a  c o n s t i t u e n t  o f   P a p i l i o c h r o m e  I I .   Com 1 ' .   B i o c h e m .  P h y s i o l .  5 " A B ，  5 5 ‑ 6 2  

Umebachi Y .  and Yamashita H .  ( 1 9 7 7 )  B e t

‑ a l a n i n e  

S 

C

n s t i t u e n to f  t h 記 c 1 0pamined ε r i v

t t i

/ cSN‑1of 

P a t i l i o  x u t h z

Comt

B i o c h e m .   J ' h y s i o l .  5 ， f i s ，  5 . 8 .