別紙様式1
修 士 学 位 論 文
訟百冊 文 題 名
マ ウス胚性幹細胞 に対 す るアル コール の影響
Effectsofalcoholonmouseembryonicstemcellderivedneuralstemcells
平 成24年1月6日 提 出
首 都 大 学 東 京 大 学 院
人 間健 康 科 学研 究 科 博 士 前 期 課、程 人 間健 康 科 学 専 攻 フ ロ ンテ ィ ア ヘル スサ イ エ ンス学 域 学 修 番 号:10898604
氏 名:小 松 城 光
(指 導 教 員 名:井 上 順 雄)
[要旨】
脳 神 経 系 が 正 常 に 発 達 し て い く 上 で 、 神 経 幹 細 胞 の 増 殖 と分 化 が 正 常 に 進 め られ て い く こ とが 、 正 常 な 中 枢 神 経 系 が 構 築 さ れ る た め に 極 め て 重 要 で あ る 。 発 達 期 の 脳 内 に は 、 増 殖 能 と 分 化 能 を 有 して い る 神 経 幹 細 胞 が 存 在 して い る 。 こ の 神 経 幹 細 胞 が 神 経 細 胞 や ア ス ト ロサ イ トな ど の 中 枢 神 経 系 を構 成 す る 細 胞 を 産 生 して い る こ と か ら、 神 経 幹 細 胞 へ の 悪 影 響 は 、 出 生 後 の 脳 の 構 築 異 常 や 障 害 を 引 き 起 こす 原 因 と な る こ とが 考 え られ る 。 一 般 的 に 飲 用 に 用 い られ て い る ア ル コー ル は 、 母 体 を通 じ て 胎 児 に影 響 を与 え る こ と に よ っ て 、 小 頭 症 や 胎 児 性 ア ル コ ー ル 症 候 群 な ど の 発 達 神 経 毒 性 を 示 す 。 特 に 、 胎 児 性 ア ル コ ー ル 症 候 群 に お い て は 、胎 児 期 に 母 体 の 飲 酒 に よ りア ル コ ー ル に 曝 露 す る こ と に よ る 、顔 面 異 常 ・ 中 枢 神 経 機 能 障 害 ・発 育 遅 延 の 症 状 が み られ る 。 これ らよ り、 ア ル コ ー ル は 胎 生 期 の 神 経 幹 細 胞 の 増 殖 や 分 化 な ど に 重 大 な 影 響 を 与 え る と考 え られ る が 、 これ ま で 十 分 な 研 究 は 行 わ れ て い な い 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 、 マ ウ ス 胚 性 幹 細 胞(ES細 胞)か らNeuralstem sphere(NSS)法 に よ って 調 整 し た 均 質 な 神 経 幹 細 胞 を用 い て 、神 経 幹 細 胞 に 対 す る エ タ ノー ル の 影 響 を検 討 し た 。
ま ず 、培 養 液 中 に 最 終 濃 度1,3,10,30,55,100mMの エ タ ノー ル を 添 加 し 、5日 間 培 養 す る 事 に よ っ て 、 神 経 幹 細 胞 に 対 す る エ タ ノー ル の 影 響 を確 認 し 、 増 殖 曲 線 の 作 成 と 形 態 の確 認 を 行 っ た 。そ の 結 果 、30mM以 下 の 濃 度 で は 無 添 加 の 細 胞 と増 殖 速 度 は 同 じで あ っ た が 、 55mM,100mMで は 増 殖 速 度 が 低 下 した 。ま た 細 胞 の 形 態 も突 起 が 長 く伸 び た 細 胞 へ と変 化 した 。 次 に エ タ ノ ー ル の 暴 露 時 間 の 違 い に よ る 影 響 を検 討 した 。 最 終 濃 度100mMの エ タ ノ ー ル を1時 間 添 加 す る と、 無 添 加 の 細 胞 に 比 べ て 緩 や か で は あ る が 細 胞 増 殖 が 認 め られ た 。 しか し、3時 間 以 上 添 加 す る と細 胞 の 増 殖 が 強 く抑 え られ 、そ れ 以 上 の 添 加 時 間 で も増 殖 曲 線 に 変 化 は な か っ た 。
これ ら の 結 果 か ら、 神 経 幹 細 胞 へ の エ タ ノー ル 添 加 に よ っ て 、 あ る 一 定 の 濃 度 や 暴 露 時 間 を 超 え る と細 胞 の 増 殖 が 抑 え られ る こ と が 明 らか に な っ た 。 ま た 神 経 幹 細 胞 の 形 態 変 化 か ら、 正 常 な 神 経 幹 細 胞 が 維 持 さ れ な い こ と が 判 明 し た 。 これ ら の 結 果 よ り、 妊 娠 時 に お け る あ る 一 定 の 濃 度 を超 え る ア ル コ ー ル の 摂 取 は 、 神 経 幹 細 胞 に 強 い 悪 影 響 を 与 え 、 胎 児 へ の 神 経 系 の 悪 影 響 を 引 き起 こす 一 因 に な る 可 能 性 が あ る 。
キ ー ワー ド:胚 性 幹 細 胞 、 神 経 幹 細 胞 、 ア ル コー ル 、 細 胞 増 殖
[Abstract]
When cerebral nerve system develops normally, it is extremely important that an increase and the differentiation of the nerve trunk cell are pushed forward normally so that the normal central nervous system is built. The alcohol used for drinking generally shows the development neurotoxicity such as microcephalia or the fetal alcohol syndrome (FAS) by affecting a fetus through a mother's body. It is thought that the alcohol has a serious influence on an increase or the differentiation of the nerve trunk cell of the developing in the womb period than these, but it is not studied enough till now. Therefore, in this study, I used the homogeneous nerve trunk cell which adjusted it by Neural stem sphere (NSS) method from a mouse embryonic stem cell (an embryonic
stem cell) and examined influence of the alcohol for the nerve trunk cell.
At first, I added ethanol of final concentration 1,3,10,30,55,100mM in culture fluid and confirmed influence of the ethanol on nerve trunk cell by culturing it five days and confirmed making and the form of the increase curve. As a result, the increase speed was the same as an additive-free cell by the density less than 30mM, but increase speed deteriorated in 55mM,100mM. In addition, the form of the cell changed to the cell that a projection was prolonged for a long time. I examined influence by the difference of the revelation time for alcohol next. It was gentle, but cell proliferation was accepted in comparison with the additive-free cell when I added ethanol of final concentration 100mM for one hour. However, the increase of the cell was strongly suppressed when I added it more than three hours, and shaved it, and there was not the change in an increase curve even in addition time more than it.
Key words: Embryonic stem cells, Neural stem cells, Alcohol, Cell proliferation
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[緒言]
ア ル コ ー ル は 最 も 身 近 な 毒 物 の ひ とつ で あ る 。 ア ル コ ー ル は 広 く一 般 に 飲 用 さ れ て お り、
世 の 中 に な くて は な らな い存 在 で あ る 。 そ の 一 方 で 、 妊 娠 中 の 女 性 が ア ル コ ー ル を摂 取 す る こ と は 胎 児 に と っ て 非 常 に危 険 な こ と と さ れ て い る 。 こ の こ と は ほ と ん ど の 酒 類 に 記 載 され て い る こ と だ が 、 ど の よ う に し て ア ル コ ー ル が 胎 児 へ 悪 影 響 を 与 え る か は 現 在 の と こ ろ詳 し く分 か っ て は い な い 。 妊 娠 中 の ア ル コ ー ル 摂 取 に よ っ て 、 胎 児 が 小 頭 症 や 胎 児 性 ア ル コ ー ル 症 候 群 な ど を 引 き 起 こす こ とが 広 く知 られ て い る 。 胎 児 は ア ル コー ル を 分 解 す る 能 力 を も た ず 、 母 体 が ア ル コ ー ル を 摂 取 す る こ と で 、 胎 盤 を通 じ て ア ル コー ル に さ らさ れ る こ と に な る 。 ま た 、 胎 生 期 に は 脳 内 で 神 経 幹 細 胞 を は じ め と した 神 経 系 の 細 胞 が 活 発 に 増 殖 す る 。 この 神 経 系 細 胞 の 増 殖 を アル コ ー ル が 阻 害 し、 小 頭 症 や 胎 児 性 ア ル コー ル 症 候 群1)な ど の 発 達 神 経 障 害 を 引 き 起 こす の で は な い か と考 え られ て い る 。発 達 期 の 脳 内 で の 神 経 系 細 胞 へ の ア ル コ ー ル の 影 響 は 、 マ ウ ス へ の 経 口 投 与 に よ る 胎 児 へ の 影 響 を検 討 した も
の2)や 細 胞 周 期 に対 し て 影 響 を 与 え る 報 告3)な どが あ る 。 し か し、神 経 幹 細 胞 が ア ル コ ー ル に よ っ て ど の よ うな 影 響 を 受 け る か と い う報 告 は 数 少 な い 。 こ れ は 、 生 体 か ら神 経 幹 細 胞 を 単 離 し て 取 り出 す こ と が 難 し い た め で あ り、 取 り 出す こ と が で き た と して も 神 経 幹 細 胞 と し て の 性 質 を維 持 させ る こ とが 難 し か っ た とい う 背 景 が あ る 。 そ こで 、invitroで の 研 究 を 可 能 に す る た め に 、 井 上 ら に よ っ て 様 々 な 神 経 幹 細 胞 の培 養 法 や 分 化 誘 導 法 が 開 発4)‑9) さ れ た 。そ の 一 つ で あ るNSS法 を 用 い て 胚 性 幹 細 胞(ES細 胞)か ら神 経 幹 細 胞 の み を単 離 し て 研 究 を行 う こ と が 可 能 に な っ た 。
本 研 究 で は,ア ル コ ー ル の 毒 性 を培 養 神 経 系 細 胞 の レベ ル で 検 討 す る た め に,マ ウ スES 細 胞 か らNSS法 に よ っ て 分 化 誘 導 ・調 製 した 均 質 な 神 経 幹 細 胞 の 増 殖 に対 す る エ タ ノー ル
の 影 響 を 検 討 す る 。 エ タ ノ ー ル の 濃 度 変 化 に よ っ て 細 胞 増 殖 に 影 響 が 出 る の か 、 ま た エ タ ノー ル に 曝 露 す る 時 間 に よ っ て も 細 胞 増 殖 に 影 響 が 出 る の か に つ い て 検 討 を 行 う。 前 者 に は 、 エ タ ノ ー ル の濃 度 に よ っ て 神 経 幹 細 胞 へ どの よ う な 影 響 の 違 い が 確 認 さ れ る か を調 べ る 目的 が あ る 。 この 実 験 は 、 例 え ば 妊 娠 し て い る女 性 が エ タ ノー ル を 摂 取 す る と、 濃 度 依 存 的 に胎 児 へ の 影 響 が 出 る か を 調 べ る た め の 基 礎 を 目指 し て い る 。 後 者 に は 、 高 い エ タ ノ ー ル 濃 度 を 添 加 し、 時 間依 存 的 に神 経幹 細胞 へ 与 え る影 響 が どのよ うに変化 す るか を調 べ る と い う 目 的 が あ る 。
[方 法 】 1.試 薬 の 調 製
1.1.マ ウ ス 胚 性 線 維 芽 細 胞(mouseembryonicfibroblast;MEF)用 培 養 液 ダ ル ベ ッ コ 変 法 イ ー グ ル 培 地(Dulbecco'smodifiedEaglemedium;DMEM)(lnvitrogen,
11965・092)に,ウ シ 胎 仔 血 清(Fetalbovineserum;FBS)(第 一・化 学 薬 品)を10%,ペ ニ シ リ ン ス ト レ プ ト マ イ シ ン(Penicilin・streptomycin;PC‑ST)(100×)(Sigma)を1%
の 濃 度 で 添 加 し,4℃ で 保 存 し た 。MEF用 培 養 液500ml調 製 の た め,DMEM450mlに,
FBSを50ml,PC・STを5ml添 加 し た 。
1.2.リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水(phosphate‑bufferedsaline;PBS)(一)(10×)(Ca2+,Mg2・free)
リ ン1'カ リ ウ ム1.Og,リ ン 酸 ニ ナ ト リ ウ ム 十 二 水 和 物14.5g,塩 化 カ リ ウ ム1.Og, 塩 化 ナ ト リ ウ ム40.09(和 光 純 薬 工 業)を,滅 菌 超 純 水500mlに 溶 解 し,撹 搾 機 で 撹 搾
後,オ ー ト ク レ ー プ 滅 菌 し た 。 オ ー トク レ ー プ 滅 菌 後 は,室 温 で 保 存 し た 。 使 用 す る 際 に は,滅 菌 超 純 水 で10倍 に 希 釈 し て 使 用 し た 。
1.3.0.25%Trypsin/0.02%EDTA溶 液
2.5%Trypsin(10×)liquid(Invitrogen)をPBS(一)で10倍 に 希 釈 し,Trypsinの 濃 度 を0.25%と し た 。 こ の 溶 液 に2%EDTA・2Na(同 仁 化 学 研 究 所)溶 液 を1/100量 添 加 し
(最 終 濃 度0.02%),4℃ で 保 存 し た 。
1.4.1mg/mlマ イ ト マ イ シ ンC(MitomycinC)溶 液
MitomycinC(和 光 純 薬 工 業)10mgを,滅 菌 超 純 水10mlに 溶 解 し(最 終 濃 度1mg/ml), 0.22ｵmフ ィ ル タ ー(Millipore)で 濾 過 滅 菌 し,分 注 し て ・80℃ で 凍 結 保 存 し た 。
1.5.0.1%ゼ ラ チ ン(Gelatin)溶 液
Gelatin(Sigma)100mgを,超 純 水100mlと 混 合 し,オ ー ト ク レ ー プ で 滅 菌 溶 解 さ せ た 。 溶 解 後 は,室 温 で 保 存 し た 。
1.6.100mM2・ メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル(2・mercaptoethanol;2・ME)溶 液
14.3mM2‑ME(Sigma)70ｵ1を 滅 菌 超 純 水10mlに 溶 解 し,0.22ｵmフ ィ ル タ ー で 濾 過 滅 菌 し,分 注 し て ・80℃ で 凍 結 保 存 し た 。
1.7.マ ウ ス 胚 性 幹 細 胞(ES細 胞)用 培 養 液
DMEM(Invitrogen,11995‑065)に,白 血 病 阻 害 因 子(Leukemiainhibitoryfactor;HF;
ESGROTM)(ChemiconInternational)を1000U/ml,KSR(KnockoutSerum
Replacement)(Invitrogen)を15%,NEAA(Nonessentialaminoacid)(100×)(Sigma)
を1%,2・ME(Sigma)を100μM,PC‑ST(100×)を1%の 濃 度 で 添 加 し,4℃ で 保 存
し た 。ES細 胞 用 培 養 液 調 製 の た め,DMEM85mlにLIF(1×105U)を100ｵ1,KSRを 4
15m1,NEAAを1ml,100mM2・MEを100ｵ1,PC‑ST(100×)を1ml添 加 し た 。 1.8.20ｵg/ml塩 基 性 線 維 芽 細 胞 増 殖 因 子(basicfibroblastgrowthfactor;bFGF)(FGF‑2)
溶 液
Leiboviz'sL‑15medium(Invitrogen)に,ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン(Bovineserumalbumin;
BSA)(Albumin,Bovine,Fractionv,powder)(生 化 学 工 業)を 加 え,1mg/mlBSA Leiboviz'sL・15mediumを 調 製 し,0.22ｵmフ ィ ル タ ー で 濾 過 滅 菌 し た 。こ の 溶 液 に,FGF‑2
(Recombinant且umanFGFbasic;157aa)(R&DSYSTEMS)を 添 加 し 濃 度20ｵg/mlと し,分 注 し て 一80℃ で 凍 結 保 存 し た 。
1.9.マ ウ スES細 胞 由 来 神 経 幹 細 胞 用 培 養 液
Neurobasalmedium(Invitrogen,21103・049)に,B・27supPlement(Invitrogen)を
2%,L・Glutamine(Sigma)を2mM,PC‑ST(100×)を1%添 加 し た(NeurobasalB・27)。
培 養 液 と し て 使 用 す る 際 に,20ｵg/mlFGF‑2を 添 加 し て,濃 度20ng/mlと し て 使 用 し た 。 神 経 幹 細 胞 培 養 液100ml調 製 の た め,Neurobasalmedium100mlにB・27supPlementを
2ml,L‑Glutamineを1ml,PC‑ST(100×)を1ml添 加 し た 。
1.10.99.5%エ タ ノ ー ル(和 光 純 薬 工 業) 開 封 後1mlず つ 分 注 し 、 保 存 。
2.細 胞 培 養
2.1.マ ウ ス 胚 性 線 維 芽 細 胞(MEF)の 調 製 とFeeder細 胞 の 調 製 2.1.1マ ウ ス 胚 性 線 維 芽 細 胞(MEF)の 調 製
13〜14日 目 の 妊 娠 マ ウ ス(C57BL/6マ ウ ス)を 解 剖 し,無 菌 的 に 子 宮 か ら胎 仔 を 取 り 出 し た 。 ガ ラ ス シ ャ ー レ の 上 で 胎 仔 の 頭 部,四 肢,尾 及 び 臓 器 を 除 去 し,体 幹 部 を 細 か く 組 織 片 と し て,0.25%Trypsin溶 液 で 処 理 しMEFを 調 製 し た 。 調 製 し たMEFは,MEF用
培 養 液 で 分 散 し,100mm細 胞 培 養 デ ィ ッ シ ュ(Falcon)に 播 種 し,2日 に 一 度MEF培 養 液 の 交 換 を し,コ ン フ ル エ ン ト(2〜3×106cells/dish)ま で 増 殖 さ せ た 。
2.1.2Feeder細 胞 の 調 製(MitomycinC処 理)
コ ン フ ル エ ン ト に 増 殖 し た 細 胞 培 養 デ ィ ッ シ ュ のMEF培 養 液 に,1mg/mlMitomycinC
を 最 終 濃 度10ｵg/mlと な る よ う に50ｵ1添 加 し,CO2イ ン キ ュ ベ ー タ で37℃,90分 間 処 理 し た 。MitomycinC処 理 後,0.25%Trypsin/0.02%EDTA溶 液 で 処 理 し 細 胞 を 剥 離 し て,
‑80℃ で 凍 結 保 存 し た。
2.2.マ ウ スES細 胞 由 来 神 経 幹 細 胞 の 調 製
NeuralStemSphere(NSS)法 に よ り マ ウ スES細 胞 か ら 神 経 系 細 胞 へ 分 化 誘 導 し 神 経 幹 細 胞 を 調 製 し た 。
2.2.1.マ ウ スES細 胞 の 培 養
60mm細 胞 培 養 デ ィ ッ シ ュ(Falcon)に0.1%Gelatin溶 液 を 入 れ,CO2イ ン キ ュ ベ ー タ で37℃,約30分 間 処 理 し ゼ ラ チ ン コ ー ト し た 。MitomycinC処 理 し 凍 結 保 存 し て お い たMEFをMEF培 養 液 で 分 散 し,Feeder細 胞 と し て1.0×106cells/dishで 播 種 し た 。 翌 日,MEF培 養 液 を 除 き マ ウ スES細 胞 用 培 養 液 を 入 れ,MEF細 胞 の 上 に マ ウ スES細 胞 (129/SV系 統 マ ウ ス 由 来)を1×103cells/dishで 播 種 し た 。Feeder細 胞 上 のES細 胞 は 増 殖 し,ES細 胞 の コ ロ ニ ー の 直 径 が300〜500ｵmに な る ま で7〜9日 間 培 養 し た 。
2.2.2.ES細 胞 コ ロ ニ ー か らNSSの 形 成
ガ ス バ ー ナ ー で 先 端 を 尖 ら せ た ガ ラ ス キ ャ ピ ラ リ ー を 用 い て,実 体 顕 微 鏡NK・541 (Nikon)下 で 培 養 デ ィ ッ シ ュ か ら 形 成 し たES細 胞 の コ ロ ニ ー を 剥 離 し た 。 剥 離 し たES 細 胞 の コ ロ ニ ー を35mm浮 遊 細 胞 培 養 デ ィ ッ シ ュ(住 友 ベ ー ク ラ イ ト)へ 移 し,ア ス ト ロ サ イ ト条 件 培 地 中(Astrocyte・conditionedmedium,ACM)(住 友 ベ ー ク ラ イ ト)で4日 間 浮 遊 培 養 し た 。4日 後,神 経 幹 細 胞 を 含 む 細 胞 集 合 球 体NeuralStemSphere(NSS)が 形 成 し た 。
22.3.NSSか ら の 神 経 幹 細 胞 の 遊 走 と 神 経 幹 細 胞 の 調 製
35mm細 胞 培 養 デ ィ ッ シ ュ(Falcon)に マ ト リ ゲ ル マ ト リ ク ス(BDBiosciences)を 入 れ て,CO2イ ン キ ュ ベ ー タ で37℃,約60分 間 処 理 し マ ト リ ゲ ル コ ー ト し た 。 マ ト リ ゲ ル コ ー ト し た 培 養 デ ィ ッ シ ュ にNSSを 実 体 顕 微 鏡 下 で 移 し,神 経 幹 細 胞 用 培 養 液(20ng/ml FGF‑2を 含 む)中 で5日 間 接 着 培 養 し,NSSの 周 囲 か ら神 経 幹 細 胞 を 遊 走 さ せ た 。そ の 後, ガ ラ ス キ ャ ピ ラ リ ー を 用 い てNSSを 細 胞 培 養 デ ィ ッ シ ュ か ら 除 去 し,神 経 幹 細 胞 を0.25%
Trypsin/0.02%EDTAに よ り 処 理 し 剥 離 し,‑80℃ で 凍 結 保 存 し た 。
2.3.神 経 幹 細 胞 の 培 養 2.3.1.神 経 幹 細 胞 の 増 殖
35mm細 胞 培 養 デ ィ ッ シ ュ をCO2イ ン キ ュ ベ ー タ で37℃,約60分 間 処 理 し マ ト リ ゲ ル コ ー ト し,NSS法 で 分 化 誘 導 し た マ ウ スES細 胞 由 来 神 経 幹 細 胞 を2.0×103cells/cm2の 濃 度 で 播 種 し 、神 経 幹 細 胞 用 培 養 液 中 で 単 層 培 養 し た 。播 種 の1日 後 か ら 本 実 験 に 使 用 し た 。
2.3.2.神 経 幹 細 胞 に 対 す る 濃 度 別 エ タ ノ ー ル 添 加
条 件 は,対 照 群(Control群)と エ タ ノ ー ル 濃 度 を 変 化 さ せ そ れ ぞ れ 最 終 濃 度 が1mM, 3mM,10mM,30mM,55mM,100mMに な る よ う に 添 加 し た 。 エ タ ノ ー ル は 、CO2イ ン キ ュ ベ ー タ で37℃,1日 間 お い た 神 経 幹 細 胞 用 培 養 液 に 添 加 し 、 最 終 濃 度 が そ れ ぞ れ の 条 件 に な る よ う に 調 整 し た 。 デ ィ ッ シ ュ の 液 体 培 地 を 添 加 済 み の も の と 交 換 し 、 エ タ ノ ー ル を 神 経 幹 細 胞 に 与 え た 。 エ タ ノ ー ル の 蒸 発 を 防 ぐ た め 、 パ ラ フ ィ ル ム(AmericanNational Can)で デ ィ ッ シ ュ を 密 閉 し 、 デ ィ ッ シ ュ 内 の 濃 度 変 化 が 起 こ ら な い よ う に し た(図1)。 ま
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た2日 後 に も 同 様 の 作 業 を行 っ た 。
2.3.3神 経 幹 細 胞 に対 す る 時 間 別 エ タ ノ ー ル 添 加
条 件 は,対 照 群(Control群)と エ タ ノー ル 濃 度100mMを1時 間 、3時 間 、6時 間 、12 時 間 、24時 間添 加 す る も の と した 。2.3.1で 培 養 した 神 経 幹 細 胞 に 、CO2イ ンキ ュベ ー タ で37℃,1日 間 お い た 神 経 幹 細 胞 用 培 養 液 に エ タ ノー ル を 添 加 し、最 終 濃 度 が100mMに な る よ う に 調 整 した 。 デ ィ ッ シ ュ の培 養 液 を エ タ ノー ル 添 加 済 み の 培 養 液 と交 換 し、 エ タ
ノー ル の 蒸 発 を 防 ぐた め にパ ラ フ ィ ル ム で デ ィ ッ シ ュ を 密 閉 し た 。 そ れ ぞ れ 規 程 の 時 間 が 経 過 し た ら、 エ タ ノ ー ル 入 り の培 養 液 を エ タ ノ ー ル の 入 っ て い な い 培 養 液 と交 換 し 、4日 間 培 養 を 行 っ た 。
3.細 胞 の 形 態 観 察 と細 胞 数 の 計 測
Control群 お よ び 濃 度 別 、 時 間別 に エ タ ノ ー ル に 曝 露 さ せ た 神 経 幹 細 胞 を,位 相 差 顕 微 鏡 ECHPSETE300(Nikon)で1日 目か ら5日 目 ま で 毎 日観 察 し,細 胞 培 養 デ ィ ッ シ ュ毎 に 無 作 為 に 選 択 し た5点 をデ ジ タ ル カ メ ラ(FUJIFILM)で 写 真 撮 影 した 。 撮 影 した 写 真 上 の 細 胞 数 を 計 測 し,細 胞 数 の 平 均 値 を 求 め た 。 ま た,血 球 計 算 盤(Erma)の 写 真 か ら撮 影 し た 写 真1枚 あ た りの 面 積 を 算 出 し,そ の 面 積 よ り1cm2あ た りの 細 胞 数(cells/cm2)を 算 出 し た 。1条 件 に つ き3枚 の 細 胞 培 養 デ ィ ッ シ ュ で 影 響 を 検 討 し,各 細 胞 培 養 デ ィ ッ シ ュ
の 平 均 値 お よ び 標 準 偏 差(SD)を 算 出 した 。
[結果]
1細 胞 の 形 態 観 察
Control群 お よ び 濃 度 別 、時 間 別 にエ タ ノー ル を添 加 した 神 経 幹 細 胞 に つ い て 、位 相 差 顕 微 鏡 に よ っ て1日 目か ら5日 目 ま で 形 態 観 察 を 行 っ た 。Control群 お よ び30mM以 下 の濃 度 群 の 神 経 幹 細 胞 は 短 い複 数 の 突 起 を 持 つ 多 角 形 の 細 胞 体 で あ る 神 経 幹 細 胞 の 形 態 的 特 徴 を維 持 して い た 。 しか し 、55mM、100mMの 濃 度 群 で は 細 胞 の 突 起 が 二 方 向 に 長 く伸 び た 形 態 を示 し た(図2)。 ま た 時 間 群 で も1時 間 以 上 工 タ ノ ー ル に曝 露 さ せ た 神 経 幹 細 胞 は 同 様 に突 起 が 二 方 向 に 長 く 伸 び た 形 態 を 示 し た(図3)。
2細 胞 数 の 計 測
横 軸 を 培 養 日数 、 縦 軸 を単 位 面 積 辺 りの 細 胞 数(cells/cm2)を 対 数 に と っ て 細 胞 数 の 変 化 を増 殖 曲 線 で 示 し た 。Control群 お よ り濃 度 群 の1mM,3mM,10mM,30mMに お い て 、神 経 幹 細 胞 数 は 直 線 的 に 増 加 した 。55mMで は死 細 胞 が 多 く見 られ る よ う に な り 、細 胞 増 殖 が そ れ 以 下 の 濃 度 の も の に 比 べ て 緩 や か に な っ た 。100mMで は さ ら に死 細 胞 が 増 え 、細 胞 増 殖 は 抑 制 さ れ た(図4)。 時 間 群 で は1時 間 曝 露 させ た もの は 、 死 細 胞 が 見 られ る よ う に な り、細 胞 増 殖 がControl群 に 比 べ て 緩 や か に な っ た 。3時 間 以 上 曝 露 さ せ た も の は 死 細 胞 が さ ら に増 え 、 細 胞 増 殖 も抑 制 さ れ た 。(図5)
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[考察]
本 研 究 に お い て 、 エ タ ノー ル 添 加 濃 度 が30mM以 下 の 神 経 幹 細 胞 は 、 エ タ ノ ー ル の影 響 を受 け る こ とな く 、5日 目 ま で 安 定 して 増 殖 した 。55mM,100mMの 濃 度 で は エ タ ノー ル の 影 響 を 受 け て 死 細 胞 が 増 え 細 胞 増 殖 が 抑 制 さ れ 、 細 胞 の 形 態 が 変 化 した 。 こ の こ とか らエ タ ノ ー ル は あ る濃 度 ま で は 神 経 幹 細 胞 に 影 響 を 与 え な い が 、 一 定 の 濃 度 を超 え る と神 経 幹 細 胞 に 悪 影 響 を 与 え る こ とが 分 か っ た 。 しか し 、 細 胞 の 形 態 や 増 殖 速 度 が 変 化 し な い 低 濃 度 の エ タ ノー ル 曝 露 で も 、 細 胞 に全 く影 響 が 無 い か は 現 時 点 で は 分 か らな い 。 遺 伝 子 発 現 が 変 化 して 別 の 細 胞 に な っ て い る 可 能 性 も考 え られ る 。
ま た100mMの エ タ ノー ル を1時 間 添 加 した 細 胞 は 、Control群 よ り も細 胞 増 殖 が 抑 制 さ れ 、 死 細 胞 が み られ る よ う に な り、3時 間 以 上 曝 露 した 細 胞 は 、 よ り細 胞 増 殖 の 抑 制 と死 細 胞 の 増 加 が み られ た 。 こ の こ と か ら、 高 濃 度 の エ タ ノ ー ル は 短 時 間 の 曝 露 で も 神 経 幹 細 胞 に 影 響 を 与 え 、 そ の 後 エ タ ノ ー ル を 取 り除 い て も 神 経 幹 細 胞 は 添 加 前 と 同 じ状 態 に は 戻 ら な い こ とが わ か り、 高 濃 度 の ア ル コ ー ル が 曝 露 時 間 に 関 わ らず 神 経 幹 細 胞 に影 響 を 与 え る こ と が 示 唆 さ れ た 。
今 後 の課 題 と し て は 、 遺 伝 子 発 現 解 析 や 蛍 光 免 疫 染 色 な ど の 解 析 を 行 い 、 エ タ ノー ル に 曝 露 さ れ た 神 経 幹 細 胞 が そ の 性 質 を 保 って い る の か 、 ま た は 違 う細 胞 に 変 化 して い る の か を 検 討 す る こ と が 必 要 と な る 。 ま た 細 胞 死 と細 胞 抑 制 が ど の よ う に行 わ れ て い る か も 明 らか にす る 必 要 が あ る 。 エ タ ノー ル の 他 に も、 エ タ ノ ー ル の 代 謝 物 で あ る ア セ トア ル デ ヒ ドに よ る神 経 幹 細 胞 へ の 影 響 を 検 討 す る 必 要 が あ る 。 エ タ ノー ル だ け で は な く ア セ トア ル デ ヒ ドも 、 胎 盤 を 通 じて 母 体 か ら胎 児 へ 影 響 を 与 え る こ と が 分 か っ て い る か らで あ る 。 ま た 本 研 究 で は 、 マ ウ ス に 対 し て ア ル コ ー ル の 影 響 を検 討 し た が 、 霊 長 類 で も検 討 す る こ とが 、 ア ル コ ー ル が 胎 児 に 与 え る影 響 を研 究 して い く 上 で 重 要 に な る と考 え る 。ヒ トES細 胞 由 来 の 細 胞 を用 い て こ の 実 験 を す る こ と は倫 理 的 に 難 し い が 、 ヒ トips細 胞 に よ る 神 経 幹 細 胞 へ の 一 方 向 的 な 分 化 が 安 定 して 可 能 に な れ ば 、 今 回 私 が 使 用 し た マ ウ ス の細 胞 の 実 験 系 を 用 い て ヒ ト神 経 幹 細 胞 に対 す る ア ル コ ー ル の 影 響 を 検 討 す る こ と が で き る よ う に な る 。
[-X[X]
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10
098765432101
(誤)運騨ミー＼然H
0 6 12
時 間(h)
18 24
口→一 エ タ ノ ー ル 濃 度
図1.10%エ タ ノ ー ル を純 水 に 溶 か して デ ィ ッシ ュ に 入 れ 、37℃CO2イ ン キ ュベ ー タ で 静 置 した 。 測 定 に は ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー を 用 い た 。 エ タ ノ ー ル の 蒸 発 に よ る濃 度 変 化 を 防 ぐ た め 、 パ ラ フ ィル ム に よ っ て デ ィ ッ シ ュ を密 閉 して 神 経 幹 細 胞 へ の エ タ ノ ー ル 添 加 実 験 を 行 っ た 。
11
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■
図2,コ ン トロ ー ル,55mM,100mMの 神 経 幹 細 胞 。55mMと100mMに は 死 細 胞 と 形 態 異 常 の 細 胞 が 目 立 ち 、 細 胞 増 殖 が 抑 制 さ れ て い る こ と が 分 か る 。
12
図3,100mMの エ タ ノ ー ル を 添 加 し 、5日 間 培 養 した 神 経 幹 細 胞 。細 胞 の 突 起 が 長 く 二 方 向 に伸 び 、 死 細 胞 が 多 く発 生 し細 胞 増 殖 が 抑 え られ て い る 。
100000
00001
(斜目ミω口8)無紹累
1000
0 1
T i1/
234
培 養 日数
5 6
一→一 開 放(OmM) 一■‑OmM
‑f‑1mM 一員一3mM
→(‑10mM
■●‑30mM 一 圏一55mM
‑‑100mM
図4.添 加 す るエ タ ノ ー ル 濃 度 を 変 化 させ た 神 経 幹 細 胞 の 増 殖 曲線 。30mM以 下 の 濃 度 で は 細 胞 増 殖 に 影 響 は な い が 、55mMで は 細 胞 増 殖 が 少 し抑 制 され 、100mMで は 細 胞 増 殖 が 強 く 抑 制 され て い る こ とが わ か る。
14
100000
(讐O＼ω一一ΦO)無塁田粟
10000
一 ●‑Oh
■→‑1h 劇引 一3h
■唾一6h
→(‑12h
→ ←24h
1000
0 1 234
培 養 日数
5 6
図5,エ タ ノー ル 添 加 時 間 を 変 化 させ た 神 経 幹 細 胞 の増 殖 曲線 。1時 間 添 加 し た細 胞 の 増 殖 が コ ン トロー ル に比 べ て 抑 制 され 、3時 間 以 上 添 加 し た 細 胞 で は ほ とん ど細 胞 増 殖 が 進 ま な か っ た。
[謝辞]二 年 問 懇 切 丁 寧 な ご指 導 を して い た だ き ま した 井 上 順 雄 教 授 に は 大 変 感 謝 を して お り ます 。 笠 井 久 隆 名 誉 教 授 に は 、 研 究 をす る 上 で の 適 切 な ア ドバ イ ス を い た だ き ま し た こ と を 大 変 感 謝 して お り ます 。 杏 林 大 学 医 学 部 大 津 昌 弘 助 教 授 に は 、 実 験 に 関 す る 多 く の ご指 導 を い た だ き ま した こ と を 大 変 感 謝 して お りま す 。
前 年 度 修 了 生 の 上 田 理 沙 さ ん と新 屋 冬 美 さ ん 、 客 員 研 究 員 の 村 上 拡 治 さ ん 、 博 士 後 期 課 程 の 西 尾 里 志 さ ん と大 森 啓 之 さ ん と磯 野 真 由 さ ん 、 博 士 前 期 課 程 の 吉 江 拓 也 さ ん と 鈴 木 さ ん と 小 野 瀬 敦 子 さ ん と箆 慎 吾 さ ん に は 様 々 な 手 助 け を し て い た だ き ま した 。 心 よ り感 謝 を
申 し上 げ ま す 。
私 の 研 究 成 果 が 微 力 な が らで も社 会 に貢 献 で き る こ と を 祈 りつ つ 、 こ の 論 文 を 締 め た い と思 い ます 。
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