495
原
著
肺 癌 に対 す るモ ノク ロナ ール 抗体 の 作 製
Human
Lung
Cancer
Monoclonal
Antibodies
矢 野 平 一
要 旨=ヌ ー ドマ ウ ス に移 植 され た ヒ ト肺 癌 組 織 の 膜粗 分 画 で マ ウ ス を免 疫 し肺 癌 と高 率 に 反 応 す る2つ の モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体(MHPC-1,MHPC-2)を 作 製 した .い ず れ の 抗 体 もIgM, κで 抗 原 決 定 基 と して 糖 鎖 を 認 識 し て い る と推 定 さ れ た .免 疫 組 織 化 学 的 に検 討 した 結 果,MHPC-1ほ 主 に非 小 細 胞 癌 と反 応 し典 型 的 な燕 麦 細 胞 型 の 癌 細 胞 と は 反 応 し な か っ た.MHPC-2は 小 細 胞 癌,非 小 細 胞 癌 双 方 と反 応 し た .い ず れ の 抗 体 も正 常 組 織 の 一 部 と反 応 し,特 にMHPC-2は 多核 白 血 球,神 経 組 織 との 反 応 が み られ た . 〔肺癌25(4):495∼502,1985〕Key words: Monoclonal antibody, Lung cancer, Carbohydrate chain.
緒 言 KoehlerとMilstein1)に よ り モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 作 製 技 術 が 確 立 さ れ て 以 来,現 在 ま で に 肺 癌2),3)をは じ め と し て 種 々 の 癌 の 腫 瘍 関 連 抗 原 に 対 す る モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 が 作 製 さ れ,既 に 血 清 診 断,4),5)画像 診 断9L7)治 療8)な ど へ の 臨 床 応 用 が 始 ま っ て い る.癌 と の み 反 応 し正 常 組 織 と は 全 く反 応 し な い モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 が 理 想 的 で は あ る が,正 常 組 織 と の 反 応 を 調 べ れ ば 調 べ る ほ どcrossreactionが 明 ら か に な る 傾 向9)が あ り,真 に 癌 特 異 的 な モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 の 作 製 は 相 当 の 困 難 を伴 う も の と 思 わ れ る.一 部 の 正 常 組 織 とcrossreactionは あ っ て も癌 と 高 率 に 反 応 し,組 織 診 断,臨 床 診 断 に 役 立 つ よ う な モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 を得 る こ と を 目 的 に 以 下 の 実 験 を 行 な い 肺 癌 に 対 す る モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 を作 製 し た. 材 料 お よ び 方 法 1.細 胞 膜 粗 分 画 ヌ ー ドマ ウ ス に 継 代 維 持 さ れ て い る 巨 細 胞 癌 (Lu-65),10)腺 癌(L27)よ り 細 胞 膜 粗 分 画 を Veltriら の 方 法11)に 従 っ て 採 取 し た. 摘 出 さ れ た 腫 瘍 をHanks'balancedsalt solution(pH6.6)中 で 細 切 し,Polytron homogenizerで ホ モ ゲ ナ イ ズ(30秒)し た 後,遠 沈(8,000×g,4.C,15分)し た.沈 渣 の 重 量 を 測 定 し こ れ を0.005MTris-0.002MEDTA buffer(pH7.2)に 対 し20%weight-volumeの 浮 遊 液 と し た.こ の 浮 遊 液 を 再 度 ホ モ ゲ ナ イ ズ(30 秒)し た 後 遠 沈(8,000×g,4℃,15分)し,そ の 上 清 を 超 遠 心(100,000×g)し て 得 た 沈 渣 を 細 胞 膜 粗 分 画 と し た. 2.免 疫 細 胞 膜 粗 分 画300μgを 生 理 的 食 塩 水 に 浮 遊 し, BALB/C,nu/+マ ウ ス(日 本 ク レ ア)に2週 間 隔 で4回 免 疫 し た.1回 目 はFreund'scomplete adjuvant,2,3回 目 はFreund'sincomplete adjuvantを 用 い 腹 腔 内 に 投 与 し た.4回 目(最 終 免 疫)は 細 胞 膜 粗 分 画30μgを 静 注 し た. 3.細 胞 融 合12) 最 終 免 疫 後3日 目 に 脾 細 胞 を 採 取 し,マ ウ ス
国 立 が ん セ ン ター 研 究 所 病 理 部
国 立 療 養 所 松 戸 病 院呼 吸 器 科
496 肺 癌 に 対 す るモ ノ ク ロナ ー ル抗 体 の 作 製 ミ エ ロ ー マ 細 胞(P3U1株)と45%ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル(分 子 量4,000,Merk)を 用 い て 融 合 を 行 な っ た.脾 細 胞 とP3U1の 比 は3:1と し た. 4.ハ イ ブ リ ドー マ の 選 択,維 持 細 胞 融 合 の 翌 日又 は 翌 々 日か らHypoxanthine-Aminopterine-Thymidine(HAT)培 地 を 用 い て ハ イ ブ リ ドー マ を選 択 し た .feedercellと し て BALB/C,nu/+マ ウ ス の 胸 腺 細 胞 を 加 え96 wellplateに 分 注 し た. 約10日 か ら2週 間 後,コ ン トロ ー ル のP3U、 細 胞 が 死 滅 し て い る の を 確 認 し た 上 で 数 日 間 Hypoxanthine-Thymidine(HT)培 地 に 変 更 し, 以 後 は10%ウ シ 胎 児 血 清 を 含 むRPMI-1640に て 維 持 し た. 5.ス ク リ ー ニ ン グ 96wellplateに ハ イ ブ リ ドー マ が 充 分 増 殖 し た 段 階 で,そ の 各wellの 培 養 上 清 を 採 取 し,抗 体 活 性 をAvidin-Biotin-PeroxidaseComplexを 用 い る 酸 素 抗 体 法13)で 検 出 し た.酸 素 抗 体 法 の 対 象 に は1)Lu-65か ら樹 立 し た 培 養 細 胞 を96 wellplateに 増 殖 さ せ,4%paraformaldehyde で 固 定 し た も の,2)Lu-65の 由 来 し た 患 者 リ ン パ 節 転 移 巣,あ る い はL-27の 由 来 し た 患 者 原 発 巣 の パ ラ フ ィ ン 切 片,そ し て3)各 種 正 常 組 織 (肝,腎,大 腸,小 腸,胃,膵 臓,脾 臓,甲 状 腺,心,舌,脊 髄)を 含 む パ ラ フ ィ ン 切 片 を 用 い た. 6.ク ロ ー ニ ン グ ス ク リー ニ ン グ で 選 択 さ れ た ハ イ ブ リ ドー マ を 肺 癌,各 種 正 常 組 織 と の 反 応 か ら 分 類 し そ れ ぞ れ を 限 界 希 釈 法 に て ク ロ ー ニ ン グ し た.す な わ ち96wellplateに0.6個/wellと な る よ う に ハ イ ブ リ ド ー マ を 分 注 し,feedercellと し て BALB/C,nu/+マ ウ ス の 胸 腺 細 胞 を 加 え た. ク ロ ー ン 化 さ れ た ハ イ ブ リ ドー マ 細 胞(1× 107個)を プ リ ス タ ン 処 理 し たBALB/C, nu/+マ ウ ス の 腹 腔 内 に 注 射 し,腹 水 よ り高 濃 度 の モ ノ ロ ナ ー ル 抗 体 を 得 た. 7.モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 のclass,及 びsubclass の 同 定14) ハ イ ブ リ ドー マ 培 養 上 清 に 同 量 の 飽 和 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム を加 え,4℃ で3時 間 静 置 し た 後 遠 沈 (10,000×g,4℃,10分)し,蒸 留 水 で20倍 ∼40 倍 に な る よ う に 溶 解 し た.各class,subclassに 特 異 的 な 抗 マ ウ ス 免 疫 グ ロ ブ リ ン ウ サ ギ 血 清 を 用 意 しOuchterlony法 を 行 な っ た. 8.抗 原 の 抽 出,同 定 腫 瘍(Lu-65,L-27)を5倍 量 の 生 理 的 食 塩 水 で ホ モ ゲ ナ イ ズ し た 後 遠 沈(800×g)し 上 清 を 得 た.こ の 上 清 の1部 を 等 量 の2M過 塩 素 酸 と 混 合 し 室 温 に て30分 掩 拝 し た 後 遠 沈(4,000× g)し そ の 上 清 を 流 水 中 で48時 間,更 に phosphatebufferedsaline中 で48時 間 透 析 す る こ と に よ り過 塩 素 酸 抽 出 物15)を 得 た.過 塩 素 酸 抽 出 前 及 び 抽 出 後 の 各 抗 原 と前 述 の 濃 縮 さ れ た モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 と の 反 応 をOuchterlony法 で 検 討 し た. 肺 癌 の パ ラ フ ィ ン 切 片 を 過 ヨ ウ 素 酸 処 理 (0.5%過 ヨ ウ 素 酸 を 切 片 上 に 添 加 し 室 温 で60分 イ ン キ ュ ベ ー トす る)し た 場 合 とneuraminidase 処 理(VibrioCholeraよ り抽 出 され たneuramini-dase, Behring InstituteをpH6.4のphosphate bufferで0.5単 位 と し た も の を 切 片 上 に 添 加 し37 .Cで2時 間 イ ン キ ュ ベ ー トす る)し た 場 合 の モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 と の 反 応 性 を 酸 素 抗 体 法 に て 検 討 し た. 9.肺 癌 各 組 織 型,正 常 組 織 他 臓 器 と の 反 応 性 手 術 に て 得 ら れ た 肺 癌 各 組 織 型(腺 癌19例,扁 平 上 皮 癌20例,大 細 胞 癌19例,燕 麦 細 胞 癌9例, 中 間 型 小 細 胞 癌9例)及 び 各 種 正 常 組 織(肺,肝, 腎,膵,副 腎,舌,胃,大 腸,小 腸,心,脊 髄, 脾)の パ ラ フ ィ ン 切 片 と モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 と の 反 応 性 をAvidin-Biotin-PeroxidaseComplex を 用 い た 酸 素 抗 体 法 に よ り免 疫 組 織 化 学 的 に 検 討 し た. 結 果 巨 細 胞 癌(L廿65)で 免 疫 し た 場 合,ハ イ ブ リ ドー マ の 出 現 率 は288well中288wel1で100%で あ っ た.固 定 さ れ たLu-65細 胞 と ハ イ ブ リ ドー マ 培 養 上 清 と の 反 応 は288well中85well (29.5%)に 陽 性 で,こ の 陽 性wel1の う ちLu-65の 由 来 し た 患 者 リ ン パ 節 転 移 巣 で 癌 と の み 反 応 し,
肺 癌.第25巻,4号1985年.6月 497
Fig. 1. Single precipitation line is formed between MHPC- 1 and Lu-65 saline and perchloric ac-id extract. リ ン パ 球,間 質 細 胞 と は 反 応 し な か っ た も の は 85well中20well(23.5%)で あ っ た.更 に こ の20 wellの 上 清 と 各 種 正 常 組 織 を 含 む 切 片 と の 反 応 の 結 果,3種 類 のwellを 選 び ク ロ ー ニ ン グ を 行 な っ た.う ち1種 類,MHPC-1(No.35)に つ い て 更 に 検 討 を 加 え た. 腺 癌(L-27)で 免 疫 し た 場 合,ハ イ ブ リ ドー マ の 出 現 率 は384wel沖349wellで91%で あ っ た. L-27患 者 原 発 巣 と の 反 応 は300well中25well (8.3%)に 陽 性 で あ っ た.こ の25wellと 各 種 正 常 組 織 の 切 片 と の 反 応 の 結 果6種 類 のweHを 選 び そ れ ぞ れ ク ロ ー ニ ン グ を 行 な っ た.う ち1種 類, MHPC-2(No.9)に つ い て 更 に 検 討 を 加 え た. 得 ら れ た モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体MHPC-1, MHPC-2はOuchterlony法 の 結 果,共 にIgM,κ で あ っ た. MHPC-1はLu-65の 腫 瘍 の 生 理 的 食 塩 水 抽 出 物 及 び 過 塩 素 酸 抽 出 物 と はOuchterlony法 で そ れ ぞ れ 沈 降 線 を 形 成 し た が(Fig.1),MHpc-2 はL-27と は 沈 降 線 を 形 成 し な か っ た .し か し MHPG2は 肺 腺 癌 症 例(72歳,男)の 胸 水 と は 沈 降 線 を 形 成 し,MHPC-2に こ の 胸 水 を 加 え て 酵 素 抗 体 法 を行 な う と癌 組 織 の 反 応 性 は 消 失 し た . MHPC-1,MHPC-2は と も に 切 片 の 過 ヨ ウ 素 酸 処 理 で 反 応 性 を 失 い,neuraminidase処 理 で は 反 応 性 に 変 化 は な か っ た. 肺 癌 各 組 織 型 と の 反 応
Fig. 2. Reactivity of monoclonal antibodies MHPC-1, MHPC-2 with human lung cancer tissues obtained at surgery.
■:Cases in whlch Iess than half of tumor cells were posltlve. ■:Cases in which more than half of tumor cells we,e p。sltlve.
(): Number of cases
* : Focal areas showing epithelial differentiation were positively stained in three cases of oat cell carcinoma .(See Fig. 5)
MHPC-1(No.35) MHPC-2(No.9) モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体MHPC-1,MHPC-2の 肺 癌 各 組 織 型 と の 反 応 性 の 結 果 はFig.2に 示 し た. MHpc-1は 主 に 非 小 細 胞 癌 と 反 応 し(Fig,3, 4),小 細 胞 癌 と は 反 応 が 弱 か っ た .特 に 燕 麦 細 胞 癌 の 場 合,上 皮 様 分 化 を 示 し た 部 位,即 ち 管 腔 様 構 造 を 呈 し た 部 位 あ る い は 細 胞 質 の 豊 富 な 細 胞 の み が 反 応 し(Fig.5),典 型 的 な 燕 麦 細 胞 型 の 癌 細 胞 と は 全 く反 応 し な か っ た. こ れ に 対 しMHpc-2の 場 合,非 小 細 胞 癌(Fig. 6)小 細 胞 癌(Fig,7)双 方 と 反 応 し た. MHPC-2は 大 細 胞 癌,腺 癌,中 間 細 胞 型 の 小 細 胞 癌 と比 較 的 よ く反 応 し,扁 平 上 皮 癌 で は 主 に 角 化 の 著 明 な 部 分 に の み 反 応 し た. 正 常 組 織,他 臓 器 との 反 応(Table):MHPC-1は 気 管 支 上 皮,腺 と 反 応 し(Fig.8)他 臓 器 で は 腎 尿 細 管,膵 外 分 泌 腺 の1部,消 化 管 粘 膜 の1 部,舌 の 角 化 層 と反 応 し た.し か し い ず れ も 上 皮 成 分 に 限 ら れ て お り,多 核 白 血 球,赤 血 球, リ ン パ 球,間 質 細 胞 と は 反 応 し な か っ た . MHPC-2の 反 応 性 はMHPC-1と 似 て い た が,更 に 多 核 白 血 球,神 経 組 織(脊 髄)と も 反 応 し た .
498 肺 癌 に対 す る モ ノ ク ロナ ー ル 抗 体 の 作 製
Fig. 3. Large cell carcinoma immunohistochemical-ly stained with MHPC-1. Counterstained with hematoxylin. The cytoplasm of most tumor cells is positive.
Fig. 5. Oat cell carcinoma stained with MHPC- 1 and counterstained with hematoxylin. Positive immunostaining is limited to cells showing glandular differentiation.
Fig. 4. Squamous cell carcinoma stained with MHPC-1 and counterstained with hematox-ylin. Cell borders and cytoplasm of some tu-mor cells are stained.
Fig. 6. Adenocarcinoma stained with MHPC-2 showing strong reaction at cell borders. Counterstained with hematoxylin.
Fig. 7.
(a) Oat cell carcinoma stained with MHPC-2. Most of the tumor cells are positive.
(b) Serial section stained with culture supernatant of P3U1 as a negative control.
Counterstained with hematoxylin.
肺 癌:第25巻,4号1985年6月 499
Table Reactivity with normal human tissues.
Fig. 8. MHPC-1 stained mucous cells of bronchial gland. Counterstained with hematoxylin.
考 按 今 回 得 ら れ た2つ の モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 MHPC-1,MHPC-2は い ず れ も 肺 癌 と 高 率 に 反 応 し,正 常 組 織 と は1部 と し か 反 応 せ ず 肺 癌 の 腫 瘍 関 連 抗 原 を 認 識 し て い る と 考 え ら れ る . MHPC-1は 過 ヨ ウ 素 酸 で 処 理 さ れ た 切 片 と は 反 応 せ ず,Ouchterlony法 で 腫 瘍 の 生 理 的 食 塩 水 抽 出 物 の み な らず 過 塩 素 酸 抽 出 物 と も 同 様 に 反 応 す る こ と か ら抗 原 決 定 基 と し て 糖 に 富 む 糖 た ん ぱ く上 の 糖 鎖 を 認 識 し て い る と推 定 さ れ る.更 に,切 片 をneuraminidaseで 処 理 し て も 反 応 性 は 変 化 が な い こ と か ら 糖 た ん ぱ く上 の 糖 鎖 の 末 端 に は シ ア ー ル 酸 を持 た な い こ とが わ か っ た. MHPC-1は 各 種 肺 癌 と の 反 応 を 見 る と 主 に 非 小 細 胞 癌 と 反 応 し,小 細 胞 癌,特 に 燕 麦 細 胞 癌 と は 反 応 が 弱 く,小 数 の 反 応 し た 細 胞 は 細 胞 質 が 豊 富 ぞ あ っ た り管 腔 様 構 造 を 呈 し た 部 分 で あ り,,典 型 的 な 燕 麦 細 胞 型 の 癌 細 胞 と は 全 く 反 応 し な か っ た.こ の こ と は 肺 癌 の 組 織 発 生 を 考 え る 上 で 興 味 深 い と こ ろ で あ り,又,MHPC-1 は 燕 麦 細 胞 癌 と他 の 組 織 型 の 肺 癌 と を 鑑 別 す る の に 有 用 で あ ろ う. MHPC-2はMHPC-1と 同 様 に 過 ヨ ウ 素 酸 で 処 理 さ れ た 切 片 と は 反 応 せ ず,neuraminidase で 処 理 し た 場 合 は 反 応 性 が 保 た れ る こ と よ りや は り末 端 シ ア ー ル 酸 を 欠 く糖 鎖 を抗 原 決 定 基 と し て 認 識 し て い る と推 定 さ れ た. MHPC-2はMHPC-1と 異 な り非 小 細 胞 癌,小 細 胞 癌 双 方 と 反 応 す る.正 常 組 織 と の 反 応 は MHPC-1と ほ ぼ 同 様 で あ る が,更 に 多 核 白 血 球,神 経 組 織(脊 髄)と 反 応 す る の が 特 徴 で あ る. こ れ はSolterら のstage-specificmouse embryonalantigen(SSEA-1)16)∼18)に 対 す る モ
500 肺 癌 に対 す る モ ノ ク ロ ナ ー ル抗 体 の 作 製 ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 の 免 疫 組 織 化 学 的 反 応 性 に 非 常 に 良 く類 似 し て い る.SSEA-1の 抗 原 決 定 基 はLacto-N-fucopentaoselIIと い う 糖 鎖 で あ る こ とが 報 告 さ れ て い る16)が,MHPC-2の 反 応 す る 抗 原 決 定 基 に つ い て は 現 在 検 討 中 で あ る.も し 同 一 の 抗 原 決 定 基 を 認 識 し て い る と す る な ら ば,免 疫 に 用 い た 腫 瘍,免 疫 方 法,ス ク リー ニ ン グ 法 共 に 全 く異 な る プ ロ セ ス を 経 て 同 じ抗 体 が 得 ら れ た わ け で あ り,こ の 抗 原 決 定 基 の 免 疫 原 性 が 強 い こ と が 想 像 さ れ る. MHPC-2は 免 疫 に 用 い た 肺 癌L-27と は 酵 素 抗 体 法 で は 反 応 す る が,そ の 生 理 的 食 塩 水 抽 出 物 と は 沈 降 線 を 形 成 せ ず,L-27中 の 抗 原 決 定 基 は 水 に 不 溶 の 糖 脂 質 上 に 存 在 す る 可 能 性 が あ る. 一 方MHPC-2は 肺 腺 癌 患 者 か ら得 ら れ た 胸 水 とOuchterlony法 で 沈 降 線 を 形 成 し,又,こ の 胸 水 がMHPC-2の 抗 体 活 性 を 吸 収 す る こ と も 酵 素 抗 体 法 で 示 さ れ た.こ れ ら の こ とか ら こ の 肺 腺 癌 患 者 の 胸 水 中 にMHPC-2の 認 識 し て い る 抗 原 が 遊 出 し て い る と考 え ら れ 抗 原 決 定 基 が 糖 脂 質 の み で な く糖 た ん ぱ く抗 原 上 に も 存 在 す る と 推 定 さ れ た. MHPC-1,MHPC-2い ず れ の 抗 体 も肺 癌 と高 率 に 反 応 し,正 常 組 織 と は1部 と し か 反 応 せ ず 肺 癌 の 診 断,研 究 の 一 助 と な る で あ ろ う. MHPC-1は 典 型 的 な 燕 麦 細 胞 型 の 癌 細 胞 と は 反 応 せ ず 他 の 組 織 型 と の 鑑 別 に 役 立 つ 可 能 性 が あ り,一 方,MHPC-2は 胸 水 中 の 多 核 白 血 球 と の 反 応 が 見 ら れ る も の の,癌 細 胞 と 反 応 し 中 皮 細 胞 と は 反 応 せ ず 胸 水 細 胞 診 の 補 助 手 段 と し て 応 用 可 能 と 思 わ れ る. MHPC-1,MHPC-2は 共 に 他 臓 器 の 癌(胃 癌, 大 腸 癌,膵 癌,肝 癌,乳 癌)に 対 し て も反 応 が 見 ら れ,稿 を 改 め て 報 告 す る 予 定 で あ る. こ れ ら の 抗 体 の 臨 床 応 用,特 に 血 清 診 断,胸 水 細 胞 診 へ の 応 用 に つ い て 現 在 検 討 中 で あ る. 謝 辞 稿 を終 え る に あ た り御 校 閲 を賜 わ っ た東 京 医科 大 学 外科 学 教 室 早 田義 博教 授 に深 甚 な る謝 意 を表 します.直 接御 指 導,御 助 言 頂 い た国 立 が ん セ ンター 研 究 所病 理 部 室 長 広橋 説 雄博 士,病 理 部 長 下里 幸 雄 博士 に深 く感謝 い た し ます.又,標 本 作 製,細 胞培 養 に終 始御 協 力 頂 い た 猪 野 義典 氏,佐 藤 雄 一 氏,山 田哲 司 先生,渡 辺 昌彦 先生 ほ か 国立 が んセ ン ター 研 究 所 病 理 部 諸 氏 に感 謝 い た し ます. 本 論 文 の 要 旨 は昭 和58年10月 第24回 日本 肺 癌 学 会 総 会 に て発 表 した.
文
献
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502 肺癌 に対 す るモ ノ ク ロナ ー ル抗 体 の作 製
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Heiichi Yano
Pathology Division, National Cancer Center Research Institute and Department of Respiratory Disease, National Matsudo Hospital