I s o l a t i o n and C h a r a c t e r i z a t i o n o f a f l l n g u s from a d i o x i n ‑ c o n t a m i n a t e d s o i l

(1)

静岡理工科大学紀要

5 1

ダイオキシン類汚染土壌から分離された微生物の特徴について

I s o l a t i o n and C h a r a c t e r i z a t i o n o f a f l l n g u s from a d i o x i n ‑ c o n t a m i n a t e d s o i l

惣田呈夫へ今井絵理奈州、古市徹 * 枇

IkuoSOUTA

へ

E r i n a

恥

Wand T h o r u FURUICHI*

A b s t r a c t

A f l l n g a l i s o l a t e from a d i o x i n ‑ c o n t a m i n a t e d s o i l sample was c h a r a c t e r i z e d f o r i t s a b i l i t y t o d e g r a d e t h e d i o x i n ‑ l i l

王

ec o m p o l l n d 3 C I ‑DD and l i g n i n . The f o l l o w i n g became c l e a r . 1 ) L i g n i n was d e c o l o r i z e d by 90% a f t e r 3 days o f c u l t u r e . 2 ) Based on t h e a n a l y s i s o f 288 rDNA

，

t h e fungus was i d e n t i f i e d a s A

伊

e l i g i l l u s f a . ponik a . . 3 ) D l l r i n g t h e same t i m e p e r i o d ， t h e 五 mgali s o l a t e was a b l e t o d e g r a d e 20% o f t h e 1 0 0 ppm 3CI‑DD p r e s e n t i n t h e c u l t u r e medium.

1 .

はじめに

ダイオキシン類は、ポリ塩化ジベンゾーパラージオキシン

( P C D D )

とポリ塩化ジベンゾフラン

( P C D F )

に加え、コプラナーポリ塩化ビフェニノレ

( C o ‑ P C B s )

の三種類の化合物の総称である。異性体が多く、そのうち毒性のあるものは

PCDD

では

7 5

種類中

7

種類、

PCDF

は

1 3 5

種類中

1 0

種類、

PCB209

種類中

Co‑PCB

は

1 3

種類とされている。最も毒性の強し、異性体は、

2

，

3

，

7

，

8‑TCDDである。ダイオキシン類は、

量的に少ない量で急性毒性を示し、長期摂取により発ガン、

成長抑制、生殖毒性などの慢性毒性も示す特異的な化学物質

1 )

である。

ダイオキシン類の主な発生源は、有機塩素系農薬等の製造過程や、塩素漂白や塩素殺菌の過程、廃棄物の焼却燃焼過程、過去に生産された化学物質である。中でもゴミ焼却による発生が多いとされ、現在では排出抑制基準が設けられ発生量は減少し大気中のダイオキシン濃度は低くなっているが、解体された焼却場の適正な処理が行われなかったこと等により、これらのダイオキシン汚染土壌等の無害化処理は現在でも課題となっている。

2010

年

3

月

5

日受理

* 理工学部物質生命科学科制理工学部物質生命科学科卒業生州*北海道大学大学院工学研究科

本研究では、厚木飛行場周辺の焼却施設から排出されたダイオキシン類により汚染された土壌のバイオレメディエーションの実験を行い、ダイオキシン類が減少しているライシメータ

‑2)

から、ダイオキシン分解薗の分離を試みた。

リグニン分解菌はダイオキシン類を分解

3

，

4

，

5

，

ω

するという報告があることから、分離した薗がリグニンと三塩素化ダイオキシンである

3

，

7‑threechlor

吋

ibenzo‑p‑Dioxin ( 3 C l ‑ D D )

の分解の特徴を調べた。また分離した分離菌の薗種の同定も行った。

2 実験方法

2 . 1

ダイオキシン分解菌の分離と培養条件

厚木飛行場周辺のダイオキシン汚染土壌を用いバイオレメディエーションの実験を行いダイオキシン類の減少が認められた土壌

19

を生理食塩水

9ml

に溶かし、その上清

1ml

をリグニン培地

20ml

の入った

50ml

の遠沈管に入れ、室温で

1

週間、

150rpm

で援とう培養した。

1

週間後、

ジグニン脱色が確認されたサンプルから

1mlをどフェニ

ール

200ppmの入った LB

平板培地に入れ

30

⁰

C

で培養した。ピフェニールが分解され黄色くなった培地に生育した菌をリグニン培地

20ml

に一白金耳植薗し、同じく室温で

1

週間，

150rpm

で振とう培養した。リグニンの脱色を確認された培地をダイオキシン分解薗とした。リグニン培地組

(2)

5 2

成は、リグニン

O .1 9

、グルコース1.

0g

、

K2HP04 O . l g

、

(NH4) 804 0 . 2 g

、

Mg804'7H20 O . l g

、

NaCIO.2g

、

CaC03 0 . 2 g

，微量塩類溶液

0.lm

l(

Fe804

・

7H20O . O l g

，

MnCb

・

4H20 0 . 0 1 g

，

Zn804

・

7H20 0.01g/100m

l)である。

2 . 2

リグニン脱色と菌数の測定

リグニン培地

20ml

を

50ml

遠沈管に入れ培養し、その 1.

0ml

をマイクロチューブに取り、

12000rpm

で

1 5

分間遠心分離した。上清

0.5ml

は、

4

倍稀釈した後

480nm

で透過率を測定し、リグ、ニンの脱色の変化を測定した。また、

混釈法により菌数を測定した。シャーレに稀釈水

l m l

とツアベックドックス寒天培地を加え、

3 0

⁰

C

で

1

週間培養した。

培養後コロニー数をカウントし、菌数を求めた。

2 . 3

ダイオキシン類分解試験

本分解試験では

3CI‑DD

を使用した。リグ、ニンの脱色試験で脱色が確認できたサンフ。ルから

1ml

をリグニン培地に入れ再度

4‑6

日間前培養した。リグ、ニンを除いたリグ、ニン培地

25ml

の入った遠沈管に各々

5ml

ずつ分注した。この遠沈管の最終濃度が各々

1ppm

、

10ppm

、

100ppm

となるよう

3CI‑DD

を添加し、

3

種類の試料を作成し、

3

日間

25

⁰

C

，

150rpm

で援とう培養した。

2

.4抽出方法

2

.4

. 1

分解代謝物の抽出

7

、

8 )

培養後、培地液を

50ml

共栓試験管に移し、塩酸を加え

pH2

とした。この試料を酸性抽出画分とした。抽出は、

酢酸エチノレ

10ml

を入れ約

5

分間接とう後、軽く遠心し、

酢酸エチル層を分取した。これを

2

回繰り返した。次に分取した酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、

1 ml

以下に濃縮した。

2

.4

. 2

ダイオキシン類抽出

9

、

1 0 )

酢酸エチルで抽出した後の培地を水酸化ナトリウムで中性に戻し、中性抽出面分とした。抽出は、トルエン

10ml

を入れ約

5

分間振とうし、トルエン層を分取した。これを

2回繰り返した。次に有機物の分配のため、硫酸を用いて

トルエン層を洗浄した。この洗浄は、硫酸層の黄色の着色が呂で確認できなくなるまで、行った。硫酸処理したトルヱン層は蒸留水で

2

回洗浄した。さらに無水硫酸ナトリウム

Vo

1.1

8 . 2 0 1 0

で脱水後、濃縮し

1ml

に定量した。

2

.4

. 3

回収率の測定

権菌していない水

20ml

およびリグニン培地

20ml

よりダイオキシン類の抽出を行った。

3CI‑DD

分解試験においても培養後の培地に内部標準物質として

1 3 C

でラベルした

2

，

3

，

7 ・ 3CI‑DD

を添加し、回収率を求めた。

2 . 5

分析条件

GC‑M8

分析言十島津製

QP‑5050A

型を用いて分析した。

分析条件は以下の通りである。

カラム

DB‑5 (0.22mm x 30m)

キャリアガス

He

1.

3m

l/

min

インターフェイス:

250

⁰

C 3CI‑DD

代謝物分析の

GC

条件:

昇温条件:

100 ^o C

，

1 min h o l d

、

1 0 0 ' " " ' ‑ ' 2 5 0

⁰

C/10 ^o C/min

、

250

⁰

C 5min h o l d

測定モード:

Scan

3CI‑DD

定量分析の

GC

条件昇温条件:

1 0 0

⁰

C

、

1min h o l d

、

1 0 0 ' " " ' ‑ ' 250

⁰

C

lO

^o C/min 250

⁰

C 5min h o l d

測定モード:

SIM

測定イオン:

2 8 6 . 9 5 2 9 8 . 0 0

2 . 6 8DS‑PAGE

法

1 1 、 1 2 ) 2 . 6 . 1

酵素の抽出

培養

8

日目の培地液

20ml;

を

2000rpm

で

1 0

分間違心分離し、上清と沈殿物に分けた。上清は、使搾型ウルトラホルダーで、

5ml

以下になるまで濃縮した。

沈殿した菌体は、ピーだピーターで

1 0

分間破砕した後メンブレンフィルター

( 0

.4

5μm)

付きマイクロチューブを用いて

10000rpm

、

1 0

分間遠心を行い、溶液を濃縮した。

2 . 6 . 2 SDS‑PAGE

の作成

BIO‑RAD

製を使用し、以下の組成で

γ

ノレを作製し、

50

(3)

静岡理工科大学紀要

m A

で電気泳動し、染色、脱色を行なったc

11%

アクリルアミドゲ、ルの組成は以下の通りである。

アクリルアミド

3 . 7 m l

L5M

トリス

2.5ml

10%8D8 O . l m l

イオン交換水

4

.4

ml

テトラメチルメチレンジアミン

0.012ml

AP8 O.lml

2 . 7

^{分解菌の同定}

¹ ³

^、

¹ ⁴ ⁾

2 . 7 . 1

光学顕微鏡による形態観察

ダイオキシン分解酵素を出すカビをツアベックドックス液体培地にて、

150rpm

で

3

日間振とう培養し、ベレツト状の菌体をプレパラートに乗せ、光学顕微鏡により観察した。

2 . 7 . 2 SEM

による形態観察

ダイオキシン分解酵素を出すカビをツアベックドックス平板培地で

30

⁰

C

、

1

週間ほど培養し、

8EM(J8M'5400

、

日本電子)により観察した。

観察試料は、真銭試料台に培養したカビを両面テープで目占り、

FINE COAT (JFC'

1l

00E

、日本電子) で

5

分間金蒸着した。

2 . 7 . 3 DNA

^{解析}

¹ ⁵ ⁾

ポテトデキストロース寒天培地「ダイゴ

J

(日本製薬、

東京)で

25

⁰

C

、

3

日間培養した菌株を用いて

DNeasyp l a n t Mini Ki t(Q1AGEN

，

Hilden

，

Germany)

により

DNA

を調整

し，これをテンプテートとしてプライマ‑

NLl

，

NL2

，

NL3

及び

NL4(Donnell

，

1 9 9 3 )

で

PCR

を行った。

AB1 PRI8M3100 G e n e t i c Analyzer 8ystem

でシークエンス

を行い、国際塩基性配列データベースで相向性検索を行った。

3 .

実験結果

3 . 1

リグ、ニン分解菌の分離

リク^cニン分解用培地にダイオキシン類含有土壌サンプルを入れ培養したところ、リグ、ニンが分解され脱色が確認

5 3

されたc この試料を

3

回ほど集積培養し、その中から

1

種類の、リグニンを分解する菌が分離され、

8 I ' 2 0 0 0

とした。

3 . 2

リグニン脱色と菌増殖の測定

リグニン脱色と菌増殖の測定結果を図 lに示した。図 1 より菌数は、培養開始から 3日間で

1 0 ⁸

を越え、定常期となった。リグニンの脱色は菌の増殖からやや遅れて 3~6

日目に活性が高くなった。リクマニン脱色率は、

8R

で

90%

となった。培養8日後の脱色の写真を図 2に示した。

1

問「

きl.

E+08 3

色ふ

百

主l.

E+07 E e

i

~ t

，

E+06 S

O

S

.l

E+05

0

2

3 4

5

6 7

80 $

i ‑ l j ^D

8

図 l リグニンの脱色率と菌増殖の関係

.Lignin degradated rate.Bacteria numbe l ' s

8

日間培養後

図

2 8

日後の

81.2000

株によるリグニンの脱色

3 . 3

ダイオキシン類分解試験

3 . 3 . 1

好気的分解試験

8 1 ' 2 0 0 0

を用いて、

1

，

1 0

，

100ppm

の

3

種類入った

3Cl.DD

分解試験を行った。分解能力の検定を行うため

3日間測定

した結果を図

3

に示した。

3Cl.DD

濃度が

1ppm(5μg

含有)の場合，

3

日目で

GCM8

の

T1C

の

3Cl.DD

のピークが検出されなくなった。

10ppm(

同

50μg)

で、は約

70%(35μg)

、

(4)

5 4

100ppm

では約

20%

の減少率

(100μg)

で、あった。

100 ま 80

)

活

ω 60

、ー

c o

5 4 0

山幸

0

2

・ ? 20

。

d a y s

図

3 3 CI‑DD

の濃度の違いによる分解の経時変化

3 . 3 . 2

回収率測定

ダイオキシン類抽出におけるロスを換算するため、回収率の測定を行った。植菌していない水

20ml

およびリグニン培地

20ml

よりダイオキシン類の抽出を行った結果、水からはほぼ

100%

、リグニン培地からは

90%

回収できた。

また、

3CI‑DD

分解試験においても培養後の培地に内部標準物質として

1 3 C

でラベルした

2

，

3 . 7 ‑ 3 C I ‑ D D

を添加したところ、約

80%

の回収率であった。

Vo 1 . 1 8

，

2 0 1 0

いるリグニンベルオキ乙ダゼは

22kDa

、

PheB

は

35kDa

、ラッカーゼは

53kDa

と判明しているc これらの位置にバンドが認められたQ

3 . 5

分解菌の同定

3 . 5 . 1

顕微鏡観察

1 5 )

光学顕微鏡で観察した菌の写真を図

5

に示したコまた、

8EM

で撮影した菌全体の写真を図

6

に示した。

図

5

顕微鏡による

8 1 ‑ 2 0 0 0

図

6

電子顕微鏡による菌糸と胞子

顕微鏡による観察で菌糸が、

8EM

では菌体の長さ約

250 3 . 4

リグ、ニン分解酵素の

8 D 8 ‑ P A G E I 6 . 1 7 )

μm 、胞子は 3~4μm と確認された。また、胞子は突起状

リグニンの脱色を行う菌の酵素を確認するための球形をしていた。

8D8‑PAGE

を図

4

示した。細胞内と細胞外濃縮液を泳動

3 ‑ 5 . 2 DNA

解析及び系統樹

1 5

、

1 6 )

した。細胞内濃縮液に

20

近くのバンドが確認された。こ

288R‑DNA

の解析を行った。解析した結果、

A s p e r i g i l u s

のうち

22kDa

，

35kDa

、

53kDa

、

57kDa

，

90kDa

の位置 ]apOnlCa 近縁種の糸状菌であった。その系統樹を図

7

ににバンドが確認された。リグ、ニン分解酵素として知られて示した。

図

4 8 1 ‑ 2 0 0 0

の酵素の

8DS‑PAGE

4 .

考察

分離菌のリグニン分解試験の結果では、

1 0

日間でリグ、ニンの茶褐色を分解・脱色することがわかった。

リグ、ニンの濃度が

100ppm

程度に下がると、肉眼ではほぼリグニンの茶褐色の色は確認できなくなるが、実験開始時リグニンの濃度が

1000ppm

の培地が、

1 0

日後には

123.8ppm

まで低下し、脱色がはっきりと目視された

c

この結果から菌数の増加は早く、リグ、ニン脱色は遅れている

ことから、脱色するのは菌の生成した酵素、リグニンペルオキシダ ← ゼ等

1 2 )

による分解であると推測された

c

8DS‑PAGE

でも

22kDa

の位置に酵素の存在が認められて

(5)

静悶理工科大学紀要

いる。

リグPニンは製紙・パルプ工業における廃液に多く含まれ、

河川の泥濁を引き起こし問題となっている。今回分離した菌種はリク、、ニンを効率よく分解することから、本菌を利用するならリグニン廃液を効率よく分解処理

1 2 )

出来るのではないかと思っている。

3CI‑DD

の各濃度の分解試験では、濃度によって分解率が異なっている。一般に化学物質の分解は存在する酵素量に比例することから

3CI‑DD

の分解量は菌が生産した酵素量によって決定される。培地中の含有濃度が

500μg

(100ppm)

と多いほど分解率は

20%

と低いが分解量は

100μg

と多い。高濃度の方が菌の活性を高め分解酵素生産量を多くしているようである。

トーーー→

0 . 0 0 5

A s p e r g l l l u s a c u J e a l l l s U28829 A s p e r g i l l l l s ; a p o n i c u s U28823 2 1 I A s p e r g

伽

J

叩

a pan

削，町叩e

A s p e r g l f l u s j a p o n i c

口U$

U28826 6 2 JAsP 吋 H

町中

o n i c u sU2

回

2 5 Asperg

iIJ

l l s j a p o n i c

lt.

s U28828

65L A s p e r g i l i l l s j a p o l l i c u s U28827

A s p e r g i l l l l s c o r b o n a r i u s AF459732 A s p e r g i / l u s c o r b o n a r i u s AF459734

A s p e r g i l l l l s j 1 a v i p e s A Y216668 A s p e r g i l l u s

f1

o ¥ '

U$

AF454160

図

7 A s p e r i g i l u s j a p o n i c a S I ‑ 2 0 0 0

の系統樹

菌の活性は、添加された化学物質の量や毒性によっても異なる。本菌株を有効利用する場合、酵素の活性化条件は重要となる。コンカイ}

8D8‑PAGE

は

8

日目の分解終了時の培養液の泳動であることから確認されたバンドが薄いものとなっている。今後さらに検討し、酵素類の解析を進めた

5 5

いと考えている。

また、一般にダイオキシン類の分解では中間代謝物

10 ， 17 ， 1 8 )

が生成する。

GC‑M8

で

3CI‑DD

分解と分解代謝物を調べたが、予想される開環前の中間代謝物は確認されなかった。そのため本分解菌による分解代謝経路を確定できなかった。しかし、リグニンベルオキシダーゼやラッカーゼ等の酵素を含む培養液によるダイオキシン類を分解した報告

6 ， 1 2 )

によると関環前の分解物がわずかながら検出されることや本試験でも開環後の代謝物と思われるベンゼン化合物が確認されたことから、本菌株による

3CI‑DD

の分解が行われたものと推測している。

菌種の同定では、光学顕微鏡による形態観察で糸状菌と確認された。糸状菌は、カピと呼ばれ糸状の菌糸を伸ばして生育し、胞子を形成する。

8EM

写真では萄糸と胞子嚢、胞子が確認され、顕微鏡では菌糸などが見られた。これらの結果から糸状菌と確認された。また、本菌株の

288 r ‑ DNA

の解析と系統樹作成により Aξ

p e l i g i r u s j a p o n I k a

の近縁穏と判明してし、る。本菌株は有害性の少ない菌種であると考えている。

5 ̲

まとめ

ダイオキシン汚染土壌からダイオキシン分解菌として分離した分解菌

8 1 ‑ 2 0 0 0

の特徴を調べた。以下のことが明らかとなった。

1

)分離菌

8 1 ‑ 2 0 0 0

によりリグニン分解が確認された。

2 ) 8 1 ‑ 2 0 0 0

株による

3

塩素化ダイオキシンの分解が確認された。

3)培養液中からリグニン及びダイオキシン分解酵素として知られているリグニンベルオキシゲ、ナーゼとラッカ

ーゼのバンドが認められた。

4 ) 8 1 ‑ 2 0 0 0

株は、

288r‑DNA

の解析から

A 申 e l i g i r u s j a p o n I k a

の近縁種の糸状菌と同定された。

6̲

謝辞

本研究は平成

1 7

年度環境省廃棄物処理等科学研究費の援助で実施した。また遺伝子の解析で(株)テクノスルガ (静岡市清水区)の援助をいただいた。併せて感謝します。

(6)

5 6

7.

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R

り

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J.

B i o s c i . B i o e n g .

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Noboru Tomizuka

，

and A k i r a Kamibayashi: M e t a b o l i c Breakdown o f K a n e c l o r s ( P o l y c h l o r o b i p h e n y l s ) and T h e i r P r o d u c t s by A c i n e t o b a c t e r s p . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o ， l 46

，

140 ・ 1 4 5 ( 1 9 8 3 )

9 ) R o l i f ‑ M i c h a e l W i t t i c h e t a l : D e g r a d a t i o n o f d i o x i n ‑ l i k e

∞

mpounds by m i c r o o r g a n i s m s

，

A p p l . En

凶

r o n . M i c r o b i o l A

，

49

，

489 ・ 499

，

( 1 9 9 8 )

1 0 ) Kunichika Nakamiya

，

Tohru F u r u i c h i : I s o l a t i o n o f a fungus

企

omd e n i t r i f y i n g a c t i v a t e d s l u d g e t h a t d e g r a d e s h i g h l y c h l o r i n a t e d d i o x i n s

、

J Mater Cy

cJ

e s

~均ste

Manage

，

4

，

1 2 7 ・ 1 3 4 ( 2 0 0 2 )

1 1 )

井本泰治著:蛋白質工学研究法、生物化学実験法

40

、学会出版センター

( 2 0 0 2 )

1 2 )

金山望他

:A

ξ

p e r g i l l u sten

・

' e u s LD‑l

の生産する

Vo 1 . 1 8

，

2 0 1 0

アルカリ性リグ、ニンベルオキシダーゼの精製と詩性質、環境技術、

31

，

644‑65

1(

2 0 0 2 )

1 3 )

山崎省二編:カラーアトラス環境微生物、オーム社

( 2 0 0 2 )

1 4 )

山田英智編:微生物学における電子顕微鏡技術、医学・生物学のための電子顧微鏡実験法

4

、学会出版センター

( 1 9 9 5 )

1 5 )

久米田裕子カビ同定法の簡易、迅速化一分子生物学的手法を中心に一，防菌防微誌，

33

，

5 6 9 ‑ 5 7 6 ( 2 0 0 5 ) 1 6 )

鈴木健一郎編微生物の分類・同定実験法、シュプリンガー・フェアラーク東京

( 2 0 0 2 )

1 7 ) R o l i f ‑

Mi

c h a e l W i t t i c e t a l : Metabolism o f D i b e z o

・

p ‑D i o x i n by Sphingomonas s p . S t r a i n RW1

，

Appl En

ば

r o n .M i c r o b i o l

，

58

，

1 0 0 5

・

1 0 1 0 ( 1 9 9 2 )

1 8 ) S a t o s h i Takada e t a l : D e g r a d a t i o n o f P o l y c h l o r i n a t e d

Dibenzo

71‑

D i o x i n s and P o l y c h l o r i n a t e d D i b e n z o f u r a n s

by t h e White

Ro

t Fungus P h a n e r o c h a e t e s o r i d i d a

YK‑624

，

Appl En

ば

r o n .

Mi

・ C r o b i o l .

，

62

，

I s o l a t i o n and C h a r a c t e r i z a t i o n o f a f l l n g u s from a d i o x i n ‑ c o n t a m i n a t e d s o i l

5 1

I s o l a t i o n and C h a r a c t e r i z a t i o n o f a f l l n g u s from a d i o x i n ‑ c o n t a m i n a t e d s o i l

IkuoSOUTA

E r i n a

W**and T h o r u FURUICHI***

A b s t r a c t

A f l l n g a l i s o l a t e from a d i o x i n ‑ c o n t a m i n a t e d s o i l sample was c h a r a c t e r i z e d f o r i t s a b i l i t y t o d e g r a d e t h e d i o x i n ‑ l i l

ec o m p o l l n d 3 C I ‑DD and l i g n i n . The f o l l o w i n g became c l e a r . 1 ) L i g n i n was d e c o l o r i z e d by 90% a f t e r 3 days o f c u l t u r e . 2 ) Based on t h e a n a l y s i s o f 288 rDNA

t h e fungus was i d e n t i f i e d a s A

e l i g i l l u s f a . ponik a . . 3 ) D l l r i n g t h e same t i m e p e r i o d ， t h e 五 mgali s o l a t e was a b l e t o d e g r a d e 20% o f t h e 1 0 0 ppm 3CI‑DD p r e s e n t i n t h e c u l t u r e medium.

1 .

( P C D D )

( P C D F )

( C o ‑ P C B s )

PCDD

7 5

7

PCDF

1 3 5

1 0

PCB209

Co‑PCB

1 3

2

3

7

8‑TCDDである。ダイオキシン類は、

1 )

2010

3

5

‑2)

3

4

5

ω

3

7‑threechlor

ibenzo‑p‑Dioxin ( 3 C l ‑ D D )

2 実験方法

2 . 1

19

9ml

1ml

20ml

50ml

1

150rpm

1

1mlをどフェニ

200ppmの入った LB

30

C

20ml

1

150rpm

5 2

O .1 9

0g

K2HP04 O . l g

(NH4) 804 0 . 2 g

Mg804'7H20 O . l g

NaCIO.2g

CaC03 0 . 2 g

0.lm

Fe804

7H20O . O l g

MnCb

4H20 0 . 0 1 g

Zn804

7H20 0.01g/100m

2 . 2

20ml

50ml

0ml

12000rpm

1 5

0.5ml

4

Wand T h o r u FURUICHI*

100 ^o C

C/10 ^o C/min