Title
Studies on Identification of Cross-reactive Antigens between
Neospora caninum and Toxoplasma gondii and Development of
Immunodiagnostic Test for N.caninum Infection( 内容の要旨
(Summary) )
Author(s)
廖, 敏
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(獣医学) 甲第217号
Issue Date
2007-03-13
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/21400
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏 名(国籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 研究科及び専攻 研究指導を受けた大学 学 位 論 文 題 目 審 査 委 員 (13) 慶 敏(中華人民共和国) 博士(獣医) 獣医博甲第217号 平成19年3月13日 学位規則第3条第1項該当 連合獣医学研究科 獣医学専攻 帯広畜産大学
Studies onIdentification of Cross-reaCtive
Antigens between胞ospora caDIDELm and 7bxqpla甜∂ goDdlland Development ofImmunodiagnostic Test for N caDIDLJmInfection (ネオスポラ原虫とトキソプラズマ原虫の交差抗原の解 析とネオスポラ原虫感染症の免疫診断法の開発に関する 研究) 主査 帯広畜産大学 副査 帯広畜産大学 副査 岩 手 大 学 副査 東京農工大学 副査 岐 阜 大 学 副査 鹿児島大学 志 佳 汎郎也蔵 宏 基 幹 利 克 幸 木藤川崎頭崎 鈴 佐 品 岩 鬼 藤 授 授 授授授授 教教教教教教 論 文 の 内 容 の 要 旨 胸0即CmCaDibLmおよび7bxqDlas2Zu2gu7dIlは,いずれもアピコンプレクサApicomplexaに属す る原虫で,さまざまな脊椎動物に感染する｡エ餅肌滋ノは人獣共通感染症の病原体であり,〟c朗血皿 はウシの流･死産を引き起こす病原体であることが知られており,両原虫によるネオスポラ症およ びトキソプラズマ症は,畜産業において世界的に重要視されている｡したがって,〟ca打力泌およ びエg∽滋ノの交差抗原を同定することは,これら原虫の制圧法の開発だけでなく,宿主細胞への 接着および侵入メカニズムの解明において重要であると考えられる｡これまでに多くのγ押出 由来タンパクの特性は解明されているため,ヱ脚滋ブおよび〟`諸肌血畑の交差抗原を探索するこ とにより,〟毘〃元皿由来の新規タンパクを同定し,その機能解析が可能になるものと考えられる｡ また,これまでに〟ca加ゎ皿に対する血清学的診断法が存在するものの,イムノクロマトグラフ ィー(ICT)のような簡易迅速診断法はまだ開発されていない｡ 第1章では,〟ca〃血皿およびr脚揖の交差抗原を同定するために,〟■a訂止別戯タキゾイト に対するマウスモノクローナル抗体(血b)を作製した｡交差抗原を認識する10種の血払が得られ,
ー209-それらは間接蛍光抗体法(ImT)およびウエスタンプロット法での反応性に基づき,6つのグルー プに分類された｡グループ1に分類された3一種のmAbは,原虫表面に局在する分子量28∼76kDa の抗原を認識した｡グループ2に分類された1種の血払は,細胞内小器官に局在する分子量50kDa の抗原を認識した｡グルーナ3に分類された1種の血bは,細胞内小器官に局在する分子量35お よび14kDaの抗原を認識した｡グループ4に分類された3種のmAbは,細胞内小器官に局在する 分子量64姐aの抗原を認識した｡グループ5に分類された1種の舶bは,原虫表面に局在する分 子量未知の抗原を認識した｡グループ6に分類された1種の■舶bは,原虫の先端部に局在する分子 量未知の抗原を認識した｡グループ1,2,3,および5に分類された血bは,濃度依存的に〟c飢血皿 およびエg打出上の加ゎ加増殖抑制効果を示した｡グループ2,3,および4に分類された舶bを 用いて,〟c郡元皿タキゾイトの劇帆から作製したc洲Aライブラリーのイムノスクリーニングを 行ったところ,prOtein disulfideisomerase(PDI),heat-Shock protein70(HSP70),および
ribosomalproteinl(RPl)がそれぞれ同定された｡本研究では,PDIの特性を解明したが,HSP70 および肝1だけでなく他のいくつかの舶bで認識された表面抗原についてもさらなる研究が必要で あり,これらの交差抗原は抗原虫薬およびワクチン開発に有用であると考えられた｡ 第2章では,N caninLm由来推定PDIをコードする遺伝子の完全長配列を得た｡NcPDI遺伝子の 0肝は1416bpで,その推定産物は24アミノ酸のシグナノ媚己列を有する471アミノ酸残基から構成 され,推定分子量は50kDaであった｡NcPDI遺伝子の推定アミノ酸配列は,7:goDdIIPDIと94% の相同性を示した｡シグナ/増己列を含まないNcPDI遺伝子のDNA断片を発現ベクターに組み込み, 大腸菌発現系でGST融合タンパクとして組換えNcPDIを作製した｡1次元 2次元電気泳動および イムノブロット法により,N caninLnWタキゾイトのライセートおよびexcretory-SeCretOry(ES)産 物から内在性NcPDIが検出され,その推定分子量は50kDaであった｡また､ウシ涙液中のIgA抗 体は,GSTを除去した組換えNcPDIおよびN caninLmタキゾイトライセート中の内在性タンパク 奮を認識した(58.鴎)｡このことは,PDI特異的抗体が原虫に対する防廟応答に関わる可能性を示 唆する｡さらに,PDI特異的阻害剤zincbacitracin,tOCinoicacid,およびNcPDI抗血清は,N caninLLmタキゾイトの増殖抑制効果を示した｡一方,精製した組換えNcPDIは,還元型RNase A の触媒作用およびリフォールディング,未変性リゾチームの復元に関わる分子であることが加 T4,tmにおいて示された｡これらの所見は,NcPDIがPDI特異的酵素活性を有し,ネオスポラ症の 化学療法のターゲット分子になりうることを示唆する｡ 第3章では,ウシ血清中の抗〟caか加皿抗体の迅速な検出法としてICTを開発した｡大脇菌発現 系で組換えN can加Lm表面抗原1(NcSAGlt)を作製し,その精製タンパクを金コロイドに結合さ せ,ニトロセルロース膜上に固定した｡このⅠ口を用いて,〟 c由加皿実験感染マウスおよびイ ヌのすべての血清中から特異抗体が検出されたが,非感染マウス,イヌおよびr g00正ノ実験感染 マウスからは全く検出されなかった｡また,ICTでは,ImT陽性ウシ血清およびIm陰性ウシ血 清を区別することができた｡中国(延辺)のウシから回収した血清検体についてICTを行ったとこ ろ,96検体のうち,23検体(24.0%)がICT陽性であり,19検体(19.8%)が以前開発されたELISA で陽性であった｡ELISA陽性19検体のうち18検体は,ICTにおいても陽性であった｡ICTおよび ELISAの結果は良好な相関を示したことから(KappavalueO.99),組換えNcSAGlを用いたICTは, ウシ血清中の抗〟■a訂豆肌瓜抗体を検出するうえで非常に有用な方法であることが示唆された｡ 本研究では,〟c飢血皿およびr卯ガノに対する血bを用いて,それらの原虫の交差抗原をス クリーニングし,〟c郡元皿およびヱ脚滋ノの新規交差抗原(PDI,肝1,およびHSP70)を同定 した｡また,〟･C都血皿由来交差抗原NcPDIは,寄生虫一宿主間相互作用および粘膜免疫に関わる ことが示された｡さらに,本研究は,ウシ血清中の抗〟‥G訂豆肌皿抗体を検出するための,迅速･ 簡便で,信頼でき,かつ実用的な免疫診断法Ⅰ打を開発した最初の報告である｡
審 査 結 果 の 要 旨 〟わ即Or∂C∂刀上月〟および乃ズ叩ノ∂∫必∂gO刀〟ノ感染症は,世界的に重要視されてお り,両原虫の交差抗原を同定することは,これら原虫の制圧法の開発に寄与すると 考えられる｡これまで,多くの r g∂刀〟ノ由来タンパクの特性が報告されているこ とから,エgoβ〟ノおよびル:c眉丑力兄偶の交差抗原を探索することにより,〟二ca仇わ几Ⅶ 由来の新規タンパクの同定,機能解析が可鹿と考えられる｡また,〟二c且仇わ沌Ⅶの簡 易迅速診断法は開発されていない｡ 〟(諸肌玩皿およびr goβdノブの交差抗原を同定するため,〟二 ca仇わ㍑旭タキゾイト に対するモノクローナル抗体(mAb)を作製したところ,合計10種のmAbを得た｡ これらのmAbの幾つかは,濃度依存的に〟 c∂刀上月潤およびr goβdノブの元仁山五和 増殖を抑制した｡さらに,これらのmAbを用いてN caDIDumタキゾイトcDNAライ ブラリーのイムノスクリーニングを行ったところ,PrOtein disulfideisomerase (PDI),heat-Shock pr`otein70およびribpsomalproteinlを同定した｡ N canlnLLm由来PDIl･遺伝子のORFは1416bpで,その推定産物は471アミノ酸残 基から構成され,r gO月揖ノPDIと94%の相同性を示した｡ウシ涙液中のIgA抗体 は,組換えおよび内在性NcPDIを認識したことから,PDI特異的抗体が原虫に対す る防御応答に関わると考えられた｡さらに,PDI阻害剤およびNcPDI抗血清は,N c∂扇β〟瓜タキゾイトの増殖抑制効果を示した｡ 組換えN caDIDLLm表面抗原1(NcSAGlt)を用いたICTは,N caDIDumB染マウ スおよびイヌ血清中から特異抗体を検出した｡また,中国のウシ由畢血清では,24% がICT陽性であり,20%が既存のELISA陽性であった｡ICTおよびELISAの結果は 良好な相関を示したことから(K値=0.99),本ICTは,ウシ血清中の抗〟二ca仇わ㍑Ⅶ 抗体の検出に非常に有用であると考えられた｡ 本研究では,〟二 c混丑わ沌Ⅶおよびエ goβdノブに対するmAbを用いて,それらの原虫 の交差抗原をスクリーニングし,3種の新規交差抗原を同定した｡また,〟c∂刀ノ刀〟劇 由来交差抗原NcPDIは,寄生虫一宿主間相互作用に関わることを示した｡さらに, ウシ血清中の抗〟c∂βノ刀〟必抗体を検出するための,迅速･簡便で,かつ実用的な免
疫診断法ICTを開発した｡
以上について,審査委員全員一敦で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の 学位論文として十分価値があると認めた｡ 基礎となる学術論文 1)題 目:Identificationandcharacterizationofcross-reaCtiveantigensfrom 〃eo岬OrαCα〝ブ〝〟椚and7b叩〆α∫椚α卵〃dfブ 著 者 名:Liao,M.,Xuan,X.,Huang,X.,Shirafuji,H.,Fukumoto,S., Hirata,H.,Suzuki,H.andF両isaki,K. 学術雑誌名:Parasitology 巻･号･頁･発行年:130:481-488,2005-211-2)題 目‥Developmentofrapidimmunochromatographictestwithrecombinant NcSAGlfbrdetectionofantibodiestoNeo岬OraCaninumincattle 著 者 名‥Liao,M･,Zhang,S･,Xuan,X･,Zhang,G,Huang,X., Igarashi,Ⅰ.andFujisaki,K. 学術雑誌名:ClinicalandDiagnosticLaboratoryImmunology 巻･号･頁･発行年:12(7):8$5一宮$7,2005 3)題 目‥IdentificationofaproteindisulfideisomeraseofNeo3POraCaninumin
excretory-SeCretOry PrOducts anditsIgA binding and enzymatic activities 著 者 名‥Liao,.M･,Ma,L･,Bannai,H･,Lee,E･G･,Xie,X.,｢hng,X., Zhang,H.,Xuan,X.andFujisaki,K. 学術雑誌名:VeterinaryParasitology 巻･号･貢･発行年:139(■1-3):47-56,2006 既発表学術論文 1)題 目:DetectionofantibodiestoNeo平OraCaninumincattle
by enzyme-1inkedimmunosorbent assay with truncated NcSRS2 expressedinEscherichiacoli 著 者 名:Gaturaga,Ⅰ.,Chahan,B.,Xuan,X.,Huang,X.,Liao,M., Fukumoto,S.,Hirata,H.,Nishikawa,Y.,Takashima,Y,Suzuki, H･,Fltjisaki,K.andSuglmOtO,C. 学術雑誌名:JournalofParasitology 巻･号･頁･発行年:91(1):19卜192,2005 2)題 目:Identi丘cationofafo11istatin-relatedprotein丘omthetick memqpわ′SalislongicornisanditsefftctontickovIPOSition 著 者 名:Zhou,J.,Liao,M.,Hatta,T.,Tanaka,M.,Xuan,X.and F可isaki,K. 学術雑誌名:Gene 巻･号･頁･発行年:10(372):19卜19S,2006 3)題 目:Identificationandcharacterisationofaleucineaminopeptidasefrom thehardtickHaemqphysalislong7COrnis 著 者 名:Hatta,T.,Kazama,K.,Miyoshi,T.,Umemiya,R.,Liao,M., Inoue,N.,Xuan,X.,Tsuji,N.andFltiisaki,K. 学術雑誌名:InternationalJournalfbrParasitology 巻･号･責･発行年:36:1123-1132,2006 4)題 目:Haemqp7u}Salislongicornis:Molecularcharacterizationofa
hQmOlogue oftbemacrophage mlgrationinhibitory factorfromthe Partiallyftdticks
著 者 名:Umemiya,R.,Hatta,T.,Liao,M.,Tanaka,M.,Zhou,J.,Inoue, N.andFljisaki,K.
学術雑誌名:ExperimentalParasitoIogy 巻･号･頁･発行年:115(2):135-142,2006
5)題 目:RNAinterftrenceofcytosolicleucineaminopeptidasereduces ftcunditylnthehardtick,Haemqphysalislongicornis 著 者 名:Hatta,T.,Umemiya,R.,Liao,M･,Gong,H･,Harnnoi,T･, Tanak.a,M.,Miyoshi,T･,Boldbaatar,D･,Battsetseg,B･, Zhou,J.,Xuan,X.,T5uji,N.,Taylor,D.andFltiisaki,K･ 学術雑誌名:ParasitologyResearch 巻･号･貢･発行年:Inpress
