Vol.
30. No. 4. 1986 (257)
〔
原
著 〕
加 齢 に よ る 正 常 尿 蛋 白 排 泄 動 態 の 変 化
成 田光陽, 小 山哲夫, 桜 井秀子,
須藤優子, 稲 毛博 実, 紅 露恒男,
東條 静夫
SUMMARY
The urinary proteins from healthy adults were analyzed in different age groups, using
gradient
gel SDS-PAGE
and electrophoretic
blotting methods.
The proportions
of low
molecular proteins increased as the age became elder, and this phenomenon began at fifties.
Electrophoretic
blotting analysis showed that the increased
proteins were identified
as
retinol-binding
protein, free-light
chain (monomer
and dimer),
which were defined as
tubular proteinuria.
From the above observations,
we speculated
that the increase
in excretion
of low
molecular weight proteins by ageing, are mainly due to tubulopathy.
This appear
predom-inantly at fifties and gradually progress during ageing.
Key words: ageing, tubular proteinuria, tubular dysfunction, SDS-PAGE, electrophoretic
blotting.
緒 言 近 年, 微 量 尿 蛋 白 の 分 析 は, cadmium や 水 銀 中 毒 な ど の い わ ゆ る 尿 細 管 性 蛋 白 尿 の 検 討1,2)ば か り で な く, 糖 尿 病 性 腎 症 に お け る初 期 病 変 の 反 映 と して の 尿 細 管 性 蛋 白尿, あ る い は 微 量 の 糸 球 体 性 蛋 白尿 の 検 討 に も応 用 され て きて い る3). ま た 一 方, こ の 対 照 と な る 正 常 人 の 蛋 白尿 に つ い て も, 今 日 ま で 少 な か ら ぬ 検 討 が な され て きて い る4). し か し な が ら, 加 齢 に よ る尿 蛋 白 の 組 成 の 変 化 に つ い て は 僅 か に Mitenyi ら5)の 乳 児 の 成 長 過 程 に お け る変 化 に つ い て の 報 告 が あ るの み で あ る. 筆 者 ら は 成 人 に お け る加 齢 に よ る尿 蛋 白組 成 の 変 化 を明 らか に す る た め, gradient gel SDS-PAGEを 用 い て 尿 蛋 白 を 分 子 量 別 に 展 開 し, さ ら にelectro-phoretic blotting を行 な い, 酵 素 抗 体 法 と AuroDye 染 色 法 に よ る 蛋 白 の 同 定 後, densitometory に よ り定 量 し, 年 齢 別 尿 蛋 白構 成 を検 討 した.
対 象 と方 法
尿 sample は77人 の 正 常 者 よ り集 め た. こ れ ら の sample は 少 な く と もN-multisticks (Ames Co.) を 用 い て も蛋 白, 潜 血, bilirubin, ketone 体 は検 出 され な か っ た. 年 齢 構成 と sample 数 は Table 1に 示 し た. 正 常 人 よ り得 た 尿 を4℃, 1,500回 転10分 間 遠 心 後, membrane filter (HAWPO4799, Wako Chemical Co.) を通 した. そ の 後, 塩 類 の 影 響 を除 く為 に4℃で 72時 間, 0.02M ammonium bicarbonate 中 に て透 析 し 凍 結 乾 燥 した. そ の 後, 蒸 留 水 で 蛋 白量 を5mg/mlの 濃 度 に 調 整 し た. 蛋 白 の 濃 度 は Folin-Ciocalteu 法 に
Effect of ageing on the constitution of urinary proteins in normal adults. Mitsuharu Narita, Akio Koyama, Hideko Sakurai, Yuko Sudou, Hiromi Inage, Tsuneo Koro and Shizuo Tojo
: 筑 波 大 学 臨 床 医 学 系 内 科
Correspondence address: Mitsuharu Narita, Institute of Clinical Medicine, University of Tsukuba, Niihari -gun, Ibaraki 305, Japan.
SDS-PAGE: 甘 ら の 方 法6)に 準 拠 し て, 4∼30% linear gradient gel plate を 作 製 し た. 蛋 白 を sample
buffer (2%のSDSと40% glycerol を 含 む0.02M
Tris-HCl buffer, pH6.8) と で1:1に 混 合 し て 試
料 と し て 使 用 し た. 即 ち, sample buffer 5μl中 に
12.5μgの 蛋 白 を 含 む 試 料 を triplicate に て sample
well に 入 れ20mAで1時 間 泳 動 し た. 泳 動 用 の buffer
は Tris-glycine buffer (6g Tris, 28g Glycine, 1
g SDS/l) を 使 用 し た. gel を 縦 に 半 切 し, 一 方 は
coomassie brilliant blue R-250 (1.15g/l) を 含 む5
%酢 酸, 25% ethanol 液 で 染 色 し, 5%の 酢 酸 を 含 む25
% ethanol で 脱 色 し た. 染 色 し た gel を572nmで
densitometer に て 半 定 量 的 に 測 定 し た.
分 子 量 の calibration proteins と し て Pharmacia のCALIBRATION KITS for MOLECULAR
WEIGHT DETERMINATIONを 使 用 し た.
尿 蛋 白 同 定 の standard sample と し てIgM,
α2-macroglobulin, IgA, IgG, tubular epithelial antigen
(TA), β2-microglobulin, albumin, transferrin な
ど を 使 用 し た.
triplicate の gel の 他 の 二 つ は electrophoretic
blotting に 使 用 し, 一 方 は AuroDye 染 色 を 行 な い, 他
方 は peroxidase で 標 識 し た 抗 体 で 染 色 し た.
Electrophoretic blotting: electrophoretic blotting
は Towbin ら の 方 法7)に 準 拠 し た. 即 ちSDS-PAGE
を 行 な っ た gel か ら nitrocellulose membrane (0.45
μm pore size, Millipore) に electrotransblot
apparatus を 用 い て30V定 電 圧, 2.5時 間 の 転 写 を 行 な
glycine, 0.02M Tris, 0.1%SDSを 含 む buffer を 使 用
し た. 泳 動 後30分 間, blocking buffer { 3% gelatin
を 含 む20mM Tris, 500mM NaCl, pH7.5 (TBS)}
中 で 振 と う さ せ た. 転 写 し た nitrocellulose 膜 を 振 と
う さ せ な が ら antibody buffer (1% gelatin TBS)
を 用 い て 第 一 抗 体 と 一 昼 夜 反 応 さ せ た 後, washing
buffer で15分 お き に4回 洗 浄 後, antibody buffer を
用 い て 第 二 抗 体 (peroxidase conjugated goat or
rabbit antibodies) と2時 間 反 応 さ せ た. 4回 洗 浄 後,
発 色 液 に て15∼30分 間 反 応 さ せ 水 洗 し た.
第 一 抗 体 と し て 以 下 の も の を 使 用 し た.
anti-human IgG, anti-human IgA, anti-human IgM,
anti-albumin, anti-transferrin,
anti-β2-micro-globulin, anti-Tamm-Horsfall mucoprotein,
anti-α2-microglobulin, anti-retinolbinding protein
(RBP), anti-α1-microglobulin, anti-lysozyme, anti-light chain, (κ, λ L-chain), anti-secretary component, anti-tubular epithelial antigens.
AuroDye 染 色 法: 蛋 白 を 転 写 し た nitrocellulose 膜
を0.3% Tween 20を 含 むPBSで37℃, 30分 間 洗 浄 し,
さ ら に 室 温 で15分 間, 6回 洗 浄 し た. 洗 浄 し た 膜 を
AuroDye (AuroDye Colloidal Gold, Janssen
Pharmaceutica, Belgium) で 染 色 し た.
nitrocel-lulose 膜 は 密 封 し た plastic bag に 入 れ 一 中 夜
incu-bate し 蒸 留 水 で 洗 浄 し乾 燥 さ せ た.
結 果
1) SDS-PAGE: 4-30% gradient gel SDS-PAGE
で は marker で あ る 種 々 の 分 子 量 の 蛋 白 とRmの 関
係 は semi-log plot で ほ ぼ 直 線 と な っ た (Fig. 1).
2) 各 年 齢 別 の 尿 蛋 白 分 画 はFig. 2に 示 し た よ う に, 年 齢 階 層 に よ り 僅 か な が ら 相 違 が 認 め ら れ, 年 齢 が 高 く な る に つ れ 低 分 子 量 の 蛋 白 が 増 加 す る 傾 向 が 認 め ら れ た. 40歳 以 降 の も の, 特 に70歳, 80歳 代 の も の は い わ ゆ る “尿 細 管 性 蛋 白 ”の pattern を と る こ と が 示 唆 さ れ た. 分 子 量 別 分 画 で み る と, Fig. 3に 示 し た よ う に, 高 齢 者 で は30,000以 下 の 分 子 量 の 蛋 白 の 割 合 が 増 加 し, 特 に20,100∼30,000と43,000∼67,000の も の は 年 齢 と と も に 増 加 す る 傾 向 が み ら れ た. 一 方, albumin と 分 子 量94,000∼220,000の 蛋 白 と の 比 率 は, 逆 に 加 齢 と 共 に 減 少 す る 傾 向 が 認 め ら れ た. こ れ ら の 尿 蛋 白 と 年 齢
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Fig. 1.
Correlation
between Rm and molecular
weight.
(SDS-PAGE)
Fig. 2. The changes in proportions of each molecular weight proteins during ageing.
a) MW<14,400, b) 14,400≦MW<20,100, c) 20,100≦MW<30,000, d) 30,000≦MW<36,000, e) 36,000≦MW<43,000, f) 43,000≦MW<67,000, alb.=albumin, g) 67,000<MW<94,000, h) 94,000≦MW<220,000, i) MW≧220,000
Fig. 3. Correlation between age and molecular weight of urinary proteins.
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との相 関 をみ る と, Fig. 4 (c, f, Albumin, h) に 示 した よ う に, 20,100∼30,000と43,000∼67,000の 分 子 量 の 蛋 白が 年 齢 と有 意 の 正 相 関 (20,100∼30,000; r=0.3879, P<0.01:43,000∼67,000; r=0.2228, P <0.05) を示 し, albumin と分 子 量94,000∼220,000の 蛋 白 は 年 齢 と逆 相 関 を示 し た (albumin r=-0.2589, P <0.02; r=-0.3028, P<0.01). 3) こ こ で, 若 年 者 と高 齢 者 の 尿 蛋 白 組 成 の 相 異 を代 表 例 に お い て 比 較 す る と, Fig. 5左 端 (control) に 示 す19歳 の 者 に 比 し78歳 の 者 (Fig. 5, a) で は, 低 分 子 蛋 白 の バ ン ドの 増 加 が 明 ら か に認 め られ た. こ れ ら の 増 加 し た 蛋 白 は β2-microglobulin, RBP, L-chain(monomer, dimer) 及 びIgGの fragment で あ る こ
と が, immunoblotting に よ り nitrocellulose 膜 上 に
転 写 さ れ た 蛋 白 を 各 抗 体 に よ り染 色 す る こ と に よ り 同
定 し た. 一 方, 減 少 し た も の は, albumin, whole
molecular IgGで あ る こ と も, 同 様 の 方 法 に よ り 確 認
さ れ た (Fig. 5, b-f). Fig. 4. Correlation between age and amounts of urinary protein
excretion C (20,100≦MW<30,000) Y=4.48613+0.190787X R=0.387911 (p<0.01) Albumin Y=52.489-0.215797X R=-0.258937 (p<0.02) f (43,000≦MW<67,000) Y=5.62201+0.0736359X R=0.222772 (p<0.05) h (94,000≦MW<220,000) Y=14.428-0.0880601X R=-0.302803 (p<0.01)
考 案
微 量 尿 蛋 白 の 分 析, 初 期 糖 尿 病 や 重 金 属 中毒 の 尿 中 蛋 白の 分 析, 或 い は 今 後 微 量 糸 球 体 性 尿 蛋 白 の 検 討 を 行 な う う え に は, 予 め 年 齢 に よ る尿 蛋 白組 成 の 変 化 を 知 っ て お く必 要 が あ る. 筆 者 ら は こ の 目 的 の た め に, gradient gel SDS-PAGEと immunoelectrophoretic blotting 法 を用 い て, 加 齢 に よ る尿 蛋 白の 組 成 の 変 化 に つ い て 検 討 し た. そ の 結 果, 加 齢 と と も に増 加 す る 尿 蛋 白 は, β2-microglobulin, RBP, L-chain な ど の い わ ゆ る “尿 細 管 性 ”蛋 白 で あ っ た. そ して こ れ ら低 分 子 量 蛋 白 の 比 率 が 著 明 に 増加 しだ す の は, 40歳 代 以 降 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た. 近 年, 糖 尿 病 性 腎 症 の 初 期 変 化 と して 患 者 の 尿 中 に 微 量 の 低 分 子 蛋 白 が 出 現 す る こ と が 知 ら れ て お り, Virella ら2)は 腎 糸 球 体 の 基 底 膜 が 形 態 学 的 変 化 を生 ず る 前 に こ れ ち低 分 子 量 の 蛋 白の 排 泄 が 認 め ら れ る こ と を報 告 し て い る. こ の 尿 蛋 白排 泄 の 変 化 は 糖 尿 病 に よ る 糸 球 体 の hyperfiltration の 結 果 生 じ た 過 負 荷 の 結 果, も し くは, か な り早 期 か ら生 じ る糖 尿 病 性 細 動 脈 硬 化 に 由 来 す る も の と考 え られ て い る. しか し な が ら, 上 述 した よ う に 高 齢 者 に お け る 尿 蛋 白排 泄 の 変 化 を考 え る と, 糖 尿 病 者 は も とよ り, 各 種 の 腎障 害 の 尿 蛋 白分 析 に お い て は, 加 齢 に よ る影 響 を 必 ず 考 慮 し な け れ ば な らず, こ と に高 齢 者 に お い て 低 分 子 蛋 白 の 排 泄 増 加 が 認 め られ た 際 に は, そ れ が 病 的 蛋 白尿 で あ る か 否 か の 判 定 に は な お 慎 重 で な け れ ば な ら な い と考 え られ る. 次 に, 正 常 人 の 尿 中 に は L-chain が 検 出 され る こ と が 報 告 され て い るが8), 今 回 の 検 討 にお い て は, 高 齢 者 に お い て 尿 中 に L-chain の 排 泄 が 増 加 し て い る 傾 向 が 認 め られ た. 高 齢 者 (特 に70歳 以 上) に お い て は抗 体 産 生 系 の 異 常 に も とづ く immunoglobulins の 増 加 が 報 告 さ れ て お り9), 従 っ て 高 齢 者 で は 血 中 の free light chain が 増 加 し て い る 場 合 も考 慮 さ れ, こ れ が 尿 中 L-chain の 増 加 と し て 反 映 し て い る 可 能 性 も 考 え ら れ る. 加 齢 に よ る 腎 機 能 の 変 化 は, 一 般 に glomerular Fig. 5. Identification of increased proteins.
Control: A pattern of urinary protein excretion of 19 years old (SDS-PAGE). a-f: Patterns of urinary protein excretion of 78 Years old (a: SDS-PAGE
b-f: blotted proteins on nitrocellulose membrane)
b: ↑indicated increased bands of proteins. ←: band of albumin, c: α1-microglobulin,
d: pattern of anti-light chain staining, W: whole molecular IgG, D: light chain-dimer, M: light chain-monomer,
e: retinol binding-protein.
f: β2-microglobulin.
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filtration rate (GFR) の 低 下 に 加 え, renal plasma flow (RPF) が よ り低 下 す る と さ れ, そ の 結 果 fil-tration fraction (FF) が 上 昇 す る と され て い る. ま た, PSP試 験 や Fishburg 濃 縮 希 釈 試 験 等 の 尿 細 管 機 能 検 査 も30歳 代 よ り低 下 が 始 ま り, 加 齢 と共 に徐 々 に 進 行 す る と さ れ て い る10). こ の 事 は, 単 に 機 能 ne-phron population の 減 少 ば か りで は な く, 間 質 ・血 管 系 の 障 害, 特 に 細 動 脈 の 硬 化 が よ り強 く加 齢 と共 に進 行 す る こ と を 意 味 し て い る. 腎 の 形 態 学 的観 察 に よ る 変 化 で も global sclerosis や 尿 細 管 及 び 間 質 の 変 化, 特 に 細 動 脈 の 硬 化 も ま た 徐 々 に進 行 し, こ れ らは40歳 代 よ り顕 著 とな る こ とが 報 告 さ れ て い る11,12). 以 上 よ り, 加 齢 に よ る低 分 子 量 蛋 白の 増 加 も ま た, 主 に 近 位 尿 細 管 障 害 の 結 果 で あ る と考 え られ, そ の 一 部 は 加 齢 に よ る細 動 脈 の 硬 化 蛋 白代 謝 の 変 化 な ど に よ る もの で あ る と思 わ れ る. ま と め 正 常 尿 蛋 白構 成 に お よぼ す 加 齢 の 影 響 を検 討 す る為 に, 濃 度 勾 配SDSポ リア ク リル ア ミ ド電 気 泳 動 法 お よ び電 気 泳 動 法 に よ る転 写 法 を用 い て各 年 齢 正 常 人 よ り 集 め た 尿 を検 討 した. 加 齢 と共 に 増 加 す る蛋 白 は, 低 分 子 量 の もの が 主 で あ り, こ れ ら は, レチ ノ ー ル バ イ ン デ ン グ プ ロ テ イ ン, フ リー ラ イ トチ ェ イ ン な どで, こ れ らは 尿 細 管 性 蛋 白 尿 で あ る と さ れ て い る. 以 上 の 結 果 か ら, 加 齢 に よ り増 加 す る 蛋 白 の 由 来 は, 主 に 尿 細 管 障 害 に よ る と考 え られ, これ ら は50歳 代 に な る と顕 著 に な り, 加 齢 と共 に 徐 々 に進 行 す る も の と思 わ れ る. 謝 辞 本 研 究 の 一 部 は 、 厚 生 省 特 定 疾 患 [進行 性 腎 障 害 調 査 研 究 班]、 及 び 筑 波 大 学 [老 化 プ ロ ジ ェ ク ト] の 研 究 費 に よ っ た。