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SUMMARY The urinary proteins from healthy adults were analyzed in different age groups, using gradient gel SDS-PAGE and electrophoretic blotting metho

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(1)

Vol.

30. No. 4. 1986 (257)

著 〕

加 齢 に よ る 正 常 尿 蛋 白 排 泄 動 態 の 変 化

成 田光陽, 小 山哲夫, 桜 井秀子,

須藤優子, 稲 毛博 実, 紅 露恒男,

東條 静夫

SUMMARY

The urinary proteins from healthy adults were analyzed in different age groups, using

gradient

gel SDS-PAGE

and electrophoretic

blotting methods.

The proportions

of low

molecular proteins increased as the age became elder, and this phenomenon began at fifties.

Electrophoretic

blotting analysis showed that the increased

proteins were identified

as

retinol-binding

protein, free-light

chain (monomer

and dimer),

which were defined as

tubular proteinuria.

From the above observations,

we speculated

that the increase

in excretion

of low

molecular weight proteins by ageing, are mainly due to tubulopathy.

This appear

predom-inantly at fifties and gradually progress during ageing.

Key words: ageing, tubular proteinuria, tubular dysfunction, SDS-PAGE, electrophoretic

blotting.

緒 言 近 年, 微 量 尿 蛋 白 の 分 析 は, cadmium や 水 銀 中 毒 な ど の い わ ゆ る 尿 細 管 性 蛋 白 尿 の 検 討1,2)ば か り で な く, 糖 尿 病 性 腎 症 に お け る初 期 病 変 の 反 映 と して の 尿 細 管 性 蛋 白尿, あ る い は 微 量 の 糸 球 体 性 蛋 白尿 の 検 討 に も応 用 され て きて い る3). ま た 一 方, こ の 対 照 と な る 正 常 人 の 蛋 白尿 に つ い て も, 今 日 ま で 少 な か ら ぬ 検 討 が な され て きて い る4). し か し な が ら, 加 齢 に よ る尿 蛋 白 の 組 成 の 変 化 に つ い て は 僅 か に Mitenyi ら5)の 乳 児 の 成 長 過 程 に お け る変 化 に つ い て の 報 告 が あ るの み で あ る. 筆 者 ら は 成 人 に お け る加 齢 に よ る尿 蛋 白組 成 の 変 化 を明 らか に す る た め, gradient gel SDS-PAGEを 用 い て 尿 蛋 白 を 分 子 量 別 に 展 開 し, さ ら に

electro-phoretic blotting を行 な い, 酵 素 抗 体 法 と AuroDye 染 色 法 に よ る 蛋 白 の 同 定 後, densitometory に よ り定 量 し, 年 齢 別 尿 蛋 白構 成 を検 討 した.

対 象 と方 法

尿 sample は77人 の 正 常 者 よ り集 め た. こ れ ら の sample は 少 な く と もN-multisticks (Ames Co.) を 用 い て も蛋 白, 潜 血, bilirubin, ketone 体 は検 出 され な か っ た. 年 齢 構成 と sample 数 は Table 1に 示 し た. 正 常 人 よ り得 た 尿 を4℃, 1,500回 転10分 間 遠 心 後, membrane filter (HAWPO4799, Wako Chemical Co.) を通 した. そ の 後, 塩 類 の 影 響 を除 く為 に4℃で 72時 間, 0.02M ammonium bicarbonate 中 に て透 析 し 凍 結 乾 燥 した. そ の 後, 蒸 留 水 で 蛋 白量 を5mg/mlの 濃 度 に 調 整 し た. 蛋 白 の 濃 度 は Folin-Ciocalteu 法 に

Effect of ageing on the constitution of urinary proteins in normal adults. Mitsuharu Narita, Akio Koyama, Hideko Sakurai, Yuko Sudou, Hiromi Inage, Tsuneo Koro and Shizuo Tojo

: 筑 波 大 学 臨 床 医 学 系 内 科

Correspondence address: Mitsuharu Narita, Institute of Clinical Medicine, University of Tsukuba, Niihari -gun, Ibaraki 305, Japan.

(2)

SDS-PAGE: 甘 ら の 方 法6)に 準 拠 し て, 4∼30% linear gradient gel plate を 作 製 し た. 蛋 白 を sample

buffer (2%のSDSと40% glycerol を 含 む0.02M

Tris-HCl buffer, pH6.8) と で1:1に 混 合 し て 試

料 と し て 使 用 し た. 即 ち, sample buffer 5μl中 に

12.5μgの 蛋 白 を 含 む 試 料 を triplicate に て sample

well に 入 れ20mAで1時 間 泳 動 し た. 泳 動 用 の buffer

は Tris-glycine buffer (6g Tris, 28g Glycine, 1

g SDS/l) を 使 用 し た. gel を 縦 に 半 切 し, 一 方 は

coomassie brilliant blue R-250 (1.15g/l) を 含 む5

%酢 酸, 25% ethanol 液 で 染 色 し, 5%の 酢 酸 を 含 む25

% ethanol で 脱 色 し た. 染 色 し た gel を572nmで

densitometer に て 半 定 量 的 に 測 定 し た.

分 子 量 の calibration proteins と し て Pharmacia のCALIBRATION KITS for MOLECULAR

WEIGHT DETERMINATIONを 使 用 し た.

尿 蛋 白 同 定 の standard sample と し てIgM,

α2-macroglobulin, IgA, IgG, tubular epithelial antigen

(TA), β2-microglobulin, albumin, transferrin な

ど を 使 用 し た.

triplicate の gel の 他 の 二 つ は electrophoretic

blotting に 使 用 し, 一 方 は AuroDye 染 色 を 行 な い, 他

方 は peroxidase で 標 識 し た 抗 体 で 染 色 し た.

Electrophoretic blotting: electrophoretic blotting

は Towbin ら の 方 法7)に 準 拠 し た. 即 ちSDS-PAGE

を 行 な っ た gel か ら nitrocellulose membrane (0.45

μm pore size, Millipore) に electrotransblot

apparatus を 用 い て30V定 電 圧, 2.5時 間 の 転 写 を 行 な

glycine, 0.02M Tris, 0.1%SDSを 含 む buffer を 使 用

し た. 泳 動 後30分 間, blocking buffer { 3% gelatin

を 含 む20mM Tris, 500mM NaCl, pH7.5 (TBS)}

中 で 振 と う さ せ た. 転 写 し た nitrocellulose 膜 を 振 と

う さ せ な が ら antibody buffer (1% gelatin TBS)

を 用 い て 第 一 抗 体 と 一 昼 夜 反 応 さ せ た 後, washing

buffer で15分 お き に4回 洗 浄 後, antibody buffer を

用 い て 第 二 抗 体 (peroxidase conjugated goat or

rabbit antibodies) と2時 間 反 応 さ せ た. 4回 洗 浄 後,

発 色 液 に て15∼30分 間 反 応 さ せ 水 洗 し た.

第 一 抗 体 と し て 以 下 の も の を 使 用 し た.

anti-human IgG, anti-human IgA, anti-human IgM,

anti-albumin, anti-transferrin,

anti-β2-micro-globulin, anti-Tamm-Horsfall mucoprotein,

anti-α2-microglobulin, anti-retinolbinding protein

(RBP), anti-α1-microglobulin, anti-lysozyme, anti-light chain, (κ, λ L-chain), anti-secretary component, anti-tubular epithelial antigens.

AuroDye 染 色 法: 蛋 白 を 転 写 し た nitrocellulose 膜

を0.3% Tween 20を 含 むPBSで37℃, 30分 間 洗 浄 し,

さ ら に 室 温 で15分 間, 6回 洗 浄 し た. 洗 浄 し た 膜 を

AuroDye (AuroDye Colloidal Gold, Janssen

Pharmaceutica, Belgium) で 染 色 し た.

nitrocel-lulose 膜 は 密 封 し た plastic bag に 入 れ 一 中 夜

incu-bate し 蒸 留 水 で 洗 浄 し乾 燥 さ せ た.

結 果

1) SDS-PAGE: 4-30% gradient gel SDS-PAGE

で は marker で あ る 種 々 の 分 子 量 の 蛋 白 とRmの 関

係 は semi-log plot で ほ ぼ 直 線 と な っ た (Fig. 1).

2) 各 年 齢 別 の 尿 蛋 白 分 画 はFig. 2に 示 し た よ う に, 年 齢 階 層 に よ り 僅 か な が ら 相 違 が 認 め ら れ, 年 齢 が 高 く な る に つ れ 低 分 子 量 の 蛋 白 が 増 加 す る 傾 向 が 認 め ら れ た. 40歳 以 降 の も の, 特 に70歳, 80歳 代 の も の は い わ ゆ る “尿 細 管 性 蛋 白 ”の pattern を と る こ と が 示 唆 さ れ た. 分 子 量 別 分 画 で み る と, Fig. 3に 示 し た よ う に, 高 齢 者 で は30,000以 下 の 分 子 量 の 蛋 白 の 割 合 が 増 加 し, 特 に20,100∼30,000と43,000∼67,000の も の は 年 齢 と と も に 増 加 す る 傾 向 が み ら れ た. 一 方, albumin と 分 子 量94,000∼220,000の 蛋 白 と の 比 率 は, 逆 に 加 齢 と 共 に 減 少 す る 傾 向 が 認 め ら れ た. こ れ ら の 尿 蛋 白 と 年 齢

(3)

Vol. 30. No. 4. 1986 (259)

Fig. 1.

Correlation

between Rm and molecular

weight.

(SDS-PAGE)

Fig. 2. The changes in proportions of each molecular weight proteins during ageing.

a) MW<14,400, b) 14,400≦MW<20,100, c) 20,100≦MW<30,000, d) 30,000≦MW<36,000, e) 36,000≦MW<43,000, f) 43,000≦MW<67,000, alb.=albumin, g) 67,000<MW<94,000, h) 94,000≦MW<220,000, i) MW≧220,000

(4)

Fig. 3. Correlation between age and molecular weight of urinary proteins.

(5)

Vol. 30. No. 4. 1986 (261)

との相 関 をみ る と, Fig. 4 (c, f, Albumin, h) に 示 した よ う に, 20,100∼30,000と43,000∼67,000の 分 子 量 の 蛋 白が 年 齢 と有 意 の 正 相 関 (20,100∼30,000; r=0.3879, P<0.01:43,000∼67,000; r=0.2228, P <0.05) を示 し, albumin と分 子 量94,000∼220,000の 蛋 白 は 年 齢 と逆 相 関 を示 し た (albumin r=-0.2589, P <0.02; r=-0.3028, P<0.01). 3) こ こ で, 若 年 者 と高 齢 者 の 尿 蛋 白 組 成 の 相 異 を代 表 例 に お い て 比 較 す る と, Fig. 5左 端 (control) に 示 す19歳 の 者 に 比 し78歳 の 者 (Fig. 5, a) で は, 低 分 子 蛋 白 の バ ン ドの 増 加 が 明 ら か に認 め られ た. こ れ ら の 増 加 し た 蛋 白 は β2-microglobulin, RBP, L-chain

(monomer, dimer) 及 びIgGの fragment で あ る こ

と が, immunoblotting に よ り nitrocellulose 膜 上 に

転 写 さ れ た 蛋 白 を 各 抗 体 に よ り染 色 す る こ と に よ り 同

定 し た. 一 方, 減 少 し た も の は, albumin, whole

molecular IgGで あ る こ と も, 同 様 の 方 法 に よ り 確 認

さ れ た (Fig. 5, b-f). Fig. 4. Correlation between age and amounts of urinary protein

excretion C (20,100≦MW<30,000) Y=4.48613+0.190787X R=0.387911 (p<0.01) Albumin Y=52.489-0.215797X R=-0.258937 (p<0.02) f (43,000≦MW<67,000) Y=5.62201+0.0736359X R=0.222772 (p<0.05) h (94,000≦MW<220,000) Y=14.428-0.0880601X R=-0.302803 (p<0.01)

(6)

考 案

微 量 尿 蛋 白 の 分 析, 初 期 糖 尿 病 や 重 金 属 中毒 の 尿 中 蛋 白の 分 析, 或 い は 今 後 微 量 糸 球 体 性 尿 蛋 白 の 検 討 を 行 な う う え に は, 予 め 年 齢 に よ る尿 蛋 白組 成 の 変 化 を 知 っ て お く必 要 が あ る. 筆 者 ら は こ の 目 的 の た め に, gradient gel SDS-PAGEと immunoelectrophoretic blotting 法 を用 い て, 加 齢 に よ る尿 蛋 白の 組 成 の 変 化 に つ い て 検 討 し た. そ の 結 果, 加 齢 と と も に増 加 す る 尿 蛋 白 は, β2-microglobulin, RBP, L-chain な ど の い わ ゆ る “尿 細 管 性 ”蛋 白 で あ っ た. そ して こ れ ら低 分 子 量 蛋 白 の 比 率 が 著 明 に 増加 しだ す の は, 40歳 代 以 降 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た. 近 年, 糖 尿 病 性 腎 症 の 初 期 変 化 と して 患 者 の 尿 中 に 微 量 の 低 分 子 蛋 白 が 出 現 す る こ と が 知 ら れ て お り, Virella ら2)は 腎 糸 球 体 の 基 底 膜 が 形 態 学 的 変 化 を生 ず る 前 に こ れ ち低 分 子 量 の 蛋 白の 排 泄 が 認 め ら れ る こ と を報 告 し て い る. こ の 尿 蛋 白排 泄 の 変 化 は 糖 尿 病 に よ る 糸 球 体 の hyperfiltration の 結 果 生 じ た 過 負 荷 の 結 果, も し くは, か な り早 期 か ら生 じ る糖 尿 病 性 細 動 脈 硬 化 に 由 来 す る も の と考 え られ て い る. しか し な が ら, 上 述 した よ う に 高 齢 者 に お け る 尿 蛋 白排 泄 の 変 化 を考 え る と, 糖 尿 病 者 は も とよ り, 各 種 の 腎障 害 の 尿 蛋 白分 析 に お い て は, 加 齢 に よ る影 響 を 必 ず 考 慮 し な け れ ば な らず, こ と に高 齢 者 に お い て 低 分 子 蛋 白 の 排 泄 増 加 が 認 め られ た 際 に は, そ れ が 病 的 蛋 白尿 で あ る か 否 か の 判 定 に は な お 慎 重 で な け れ ば な ら な い と考 え られ る. 次 に, 正 常 人 の 尿 中 に は L-chain が 検 出 され る こ と が 報 告 され て い るが8), 今 回 の 検 討 にお い て は, 高 齢 者 に お い て 尿 中 に L-chain の 排 泄 が 増 加 し て い る 傾 向 が 認 め られ た. 高 齢 者 (特 に70歳 以 上) に お い て は抗 体 産 生 系 の 異 常 に も とづ く immunoglobulins の 増 加 が 報 告 さ れ て お り9), 従 っ て 高 齢 者 で は 血 中 の free light chain が 増 加 し て い る 場 合 も考 慮 さ れ, こ れ が 尿 中 L-chain の 増 加 と し て 反 映 し て い る 可 能 性 も 考 え ら れ る. 加 齢 に よ る 腎 機 能 の 変 化 は, 一 般 に glomerular Fig. 5. Identification of increased proteins.

Control: A pattern of urinary protein excretion of 19 years old (SDS-PAGE). a-f: Patterns of urinary protein excretion of 78 Years old (a: SDS-PAGE

b-f: blotted proteins on nitrocellulose membrane)

b: ↑indicated increased bands of proteins. ←: band of albumin, c: α1-microglobulin,

d: pattern of anti-light chain staining, W: whole molecular IgG, D: light chain-dimer, M: light chain-monomer,

e: retinol binding-protein.

f: β2-microglobulin.

(7)

-16-Vol. 30. No. 4. 1986 (263)

filtration rate (GFR) の 低 下 に 加 え, renal plasma flow (RPF) が よ り低 下 す る と さ れ, そ の 結 果 fil-tration fraction (FF) が 上 昇 す る と され て い る. ま た, PSP試 験 や Fishburg 濃 縮 希 釈 試 験 等 の 尿 細 管 機 能 検 査 も30歳 代 よ り低 下 が 始 ま り, 加 齢 と共 に徐 々 に 進 行 す る と さ れ て い る10). こ の 事 は, 単 に 機 能 ne-phron population の 減 少 ば か りで は な く, 間 質 ・血 管 系 の 障 害, 特 に 細 動 脈 の 硬 化 が よ り強 く加 齢 と共 に進 行 す る こ と を 意 味 し て い る. 腎 の 形 態 学 的観 察 に よ る 変 化 で も global sclerosis や 尿 細 管 及 び 間 質 の 変 化, 特 に 細 動 脈 の 硬 化 も ま た 徐 々 に進 行 し, こ れ らは40歳 代 よ り顕 著 とな る こ とが 報 告 さ れ て い る11,12). 以 上 よ り, 加 齢 に よ る低 分 子 量 蛋 白の 増 加 も ま た, 主 に 近 位 尿 細 管 障 害 の 結 果 で あ る と考 え られ, そ の 一 部 は 加 齢 に よ る細 動 脈 の 硬 化 蛋 白代 謝 の 変 化 な ど に よ る もの で あ る と思 わ れ る. ま と め 正 常 尿 蛋 白構 成 に お よぼ す 加 齢 の 影 響 を検 討 す る為 に, 濃 度 勾 配SDSポ リア ク リル ア ミ ド電 気 泳 動 法 お よ び電 気 泳 動 法 に よ る転 写 法 を用 い て各 年 齢 正 常 人 よ り 集 め た 尿 を検 討 した. 加 齢 と共 に 増 加 す る蛋 白 は, 低 分 子 量 の もの が 主 で あ り, こ れ ら は, レチ ノ ー ル バ イ ン デ ン グ プ ロ テ イ ン, フ リー ラ イ トチ ェ イ ン な どで, こ れ らは 尿 細 管 性 蛋 白 尿 で あ る と さ れ て い る. 以 上 の 結 果 か ら, 加 齢 に よ り増 加 す る 蛋 白 の 由 来 は, 主 に 尿 細 管 障 害 に よ る と考 え られ, これ ら は50歳 代 に な る と顕 著 に な り, 加 齢 と共 に 徐 々 に進 行 す る も の と思 わ れ る. 謝 辞 本 研 究 の 一 部 は 、 厚 生 省 特 定 疾 患 [進行 性 腎 障 害 調 査 研 究 班]、 及 び 筑 波 大 学 [老 化 プ ロ ジ ェ ク ト] の 研 究 費 に よ っ た。

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Fig.  2.  The  changes  in  proportions  of  each  molecular  weight proteins  during  ageing.
Fig.  3.  Correlation  between  age  and  molecular  weight  of urinary  proteins.
Fig.  4.  Correlation  between  age  and  amounts  of  urinary  protein excretionC  (20,100≦MW&lt;30,000)Y=4.48613+0.190787XR=0.387911  (p&lt;0.01) Albumin Y=52.489‑0.215797X R=‑0.258937 (p&lt;0.02)f  (43,000≦MW&lt;67,000)Y=5.62201+0.0736359XR=0.222772 (p&

参照

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