表皮‒真皮接合部の基底膜におけるヘパラナーゼの

表 皮 基 底 膜 に お け る ヘ パ ラ ナ ー ゼ の

機 能 的 役 割 に 関 す る 研 究

St u d i e s o n t h e f u n c t i o n a l ro l e o f h e p a ra n a s e

i n t h e e p i d re ma l b a s e me n t me mb r a n e

目 次 緒 言 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 第 1 章 紫 外 線 暴 露 で の 急 性 的 な 皮 膚 障 害 に お け る 表 皮 基 底 膜 機 能 へ の ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 影 響 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･6 1 . 1 序 章 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 6 1 . 2 実 験 材 料 と 方 法 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 7 1 . 2 . 1 実 験 材 料 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 7 1 . 2 . 2 紫 外 線 を 照 射 し た ヒ ト 皮 膚 組 織 の 採 取 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 8 1 . 2 . 3 免 疫 組 織 染 色 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 9 1 . 2 . 4 サ イ ト カ イ ン の ビ オ チ ン 化 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 9 1 . 2 . 5 I n s i t u b i n d i n g a s s a y ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 0 1 . 2 . 6 細 胞 の 培 養 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 0 1 . 2 . 7 ヘ パ ラ ナ ー ゼ ア ッ セ イ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 0 1 . 2 . 7 . 1 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の ビ オ チ ン 化 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 0 1 . 2 . 7 . 2 過 ヨ ウ 素 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 の 調 製 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 1 1 . 2 . 7 . 3 9 6 ウ ェ ル プ レ ー ト へ の ビ オ チ ン 化 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 固 定 ･ 1 1 1 . 2 . 7 . 4 細 胞 抽 出 液 の 調 製 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 1 1 . 2 . 7 . 5 ヘ パ ラ ナ ー ゼ ア ッ セ イ お よ び 検 出 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 2 1 . 2 . 8 ヘ パ ラ ナ ー ゼ の We s t e r n b l o t t i n g ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 2 1 . 2 . 9 擬 似 基 底 膜 を 用 い た V E G F - A 透 過 性 評 価 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 2 1 . 2 . 1 0 E L I S A 法 に よ る V E G F - A 定 量 解 析 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 3 1 . 2 . 11 血 管 新 生 キ ッ ト を 用 い た 透 過 V E G F - A に よ る 血 管 新 生 評 価 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･1 3 1 . 2 . 1 2 統 計 解 析 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 3 1 . 3 結 果 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 4 1 . 3 . 1 紫 外 線 照 射 に よ る 表 皮 細 胞 中 に お け る ヘ パ ラ ナ ー ゼ の

発 現 増 加 、 お よ び 活 性 化 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･1 4 1 . 3 . 2 紫 外 線 照 射 ヒ ト 皮 膚 の 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 減 少 ･ ･ ･ ･ ･ 1 4 1 . 3 . 3 紫 外 線 照 射 ヒ ト 皮 膚 の 表 皮 基 底 膜 に お け る サ イ ト カ イ ン の 結 合 量 低 下 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･1 5 1 . 3 . 4 ヘ パ ラ ン 硫 酸 減 少 に よ る V E G F - A 透 過 亢 進 に 伴 う 血 管 新 生 の 誘 導 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 1 5 1 . 4 考 察 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 1 1 . 5 ま と め ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 4 第 2 章 慢 性 的 な 皮 膚 障 害 に 基 因 す る 老 徴 現 象 に お け る 表 皮 基 底 膜 機 能 へ の ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 影 響 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･2 5 2 . 1 序 論 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 5 2 . 2 実 験 材 料 と 方 法 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 6 2 . 2 . 1 実 験 材 料 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 6 2 . 2 . 2 各 年 齢 の 露 光 部 お よ び 非 露 光 部 ヒ ト 皮 膚 組 織 の 採 取 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 6 2 . 2 . 3 シ ミ 組 織 の 取 得 と O C T 包 埋 に よ る 凍 結 組 織 作 製 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 7 2 . 2 . 4 角 層 バ リ ア 破 壊 マ ウ ス の 作 製 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 7 2 . 2 . 5 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 阻 害 剤 に よ る シ ワ 抑 制 効 果 の 検 証 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 8 2 . 2 . 6 皮 膚 組 織 か ら 遺 伝 子 の 抽 出 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 8 2 . 2 . 7 RT- P C R 解 析 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 8 2 . 2 . 8 免 疫 組 織 染 色 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 9 2 . 2 . 9 組 織 染 色 画 像 を 用 い た 統 計 解 析 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 2 9 2 . 2 . 1 0 I n s i t u b i n d i n g a s s a y ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 3 0 2 . 2 . 1 1 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 阻 害 剤 の 合 成 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 3 0 2 . 2 . 1 2 統 計 解 析 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 3 0 2 . 3 結 果 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 3 1 2 . 3 . 1 慢 性 的 に 紫 外 線 を 浴 び て い る 露 光 部 皮 膚 に お け る 加 齢 変 化 に 伴 う 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 構 造 的 、機 能 的 な 低 下 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･3 1

2 . 3 . 2 老 人 性 色 素 斑 皮 膚 に お け る 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 減 少 ･ 3 1 2 . 3 . 3 老 人 性 色 素 斑 皮 膚 に お け る 血 管 の 拡 張 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 3 2 2 . 3 . 4 角 層 バ リ ア 破 壊 刺 激 に 伴 う シ ワ 形 成 時 の ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 発 現 増 加 お よ び 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 減 少 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･3 2 2 . 3 . 5 I n s i t u b i n d i n g a s s a y に よ る ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 機 能 解 析 ･ ･ ･ ･ ･ 3 3 2 . 3 . 6 角 層 バ リ ア 破 壊 刺 激 に よ る 血 管 へ の 影 響 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 3 3 2 . 3 . 7 角 層 バ リ ア 破 壊 刺 激 に 伴 う リ ン パ 管 の 分 布 変 化 の 解 析 ･ ･ ･ ･ ･ 3 4 2 . 3 . 8 合 成 化 合 物 に よ る ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 の 阻 害 効 果 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 3 4 2 . 3 . 9 角 層 バ リ ア 破 壊 に よ る シ ワ 形 成 に お け る ヘ パ ラ ナ ー ゼ 阻 害 の 効 果 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 3 5 2 . 4 考 察 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 4 8 2 . 5 ま と め ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 2 第 3 章 表 皮 基 底 膜 機 能 低 下 に よ っ て 亢 進 さ れ る 皮 膚 老 化 を 改 善 す る 方 法 の 検 討 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･5 3 3 . 1 序 章 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 3 3 . 2 実 験 材 料 お よ び 方 法 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 5 3 . 2 . 1 実 験 材 料 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 5 3 . 2 . 2 紫 外 線 照 射 皮 膚 の 取 得 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 5 3 . 2 . 3 皮 膚 モ デ ル の 培 養 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 5 3 . 2 . 4 メ ラ ノ サ イ ト を 含 む 皮 膚 モ デ ル の 培 養 と A m e X ブ ロ ッ ク の 作 製 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･5 6 3 . 2 . 5 遺 伝 子 抽 出 と マ イ ク ロ ア レ イ 反 応 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 6 3 . 2 . 6 G e n e S p r i n g 解 析 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 7 3 . 2 . 7 RT- P C R 解 析 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 7 3 . 2 . 8 免 疫 組 織 染 色 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 7 3 . 2 . 9 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 8 3 . 2 . 1 0 E L I S A キ ッ ト を 用 い た 培 養 上 清 中 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 測 定 ･ 5 8

3 . 2 . 1 1 染 色 画 像 を 用 い た 統 計 解 析 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 8 3 . 2 . 1 2 透 過 型 電 子 顕 微 鏡 観 察 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 9 3 . 2 . 1 3 表 皮 中 の メ ラ ニ ン 量 測 定 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 9 3 . 2 . 1 4 統 計 解 析 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 5 9 3 . 3 結 果 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 6 0 3 . 3 . 1 皮 膚 モ デ ル に お け る 表 皮 分 化 状 態 、ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 に 関 す る 検 討 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 6 0 3 . 3 . 2 活 性 化 ヘ パ ラ ナ ー ゼ に よ る 皮 膚 モ デ ル 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 分 解 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 6 1 3 . 3 . 3 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 阻 害 剤 に よ る 表 皮 分 化 状 態 の 改 善 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 6 1 3 . 3 . 4 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 阻 害 剤 に よ る 表 皮 細 胞 の 増 殖 状 態 の 改 善 ･ ･ ･ ･ ･ 6 1 3 . 3 . 5 皮 膚 モ デ ル 表 皮 の 遺 伝 子 発 現 パ タ ー ン ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 6 2 3 . 3 . 6 皮 膚 モ デ ル の 表 皮 基 底 膜 に 対 す る M M P 阻 害 剤 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 阻 害 剤 に よ る 効 果 の 検 討 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 6 2 3 . 3 . 7 表 皮 基 底 膜 の 微 細 構 造 に 対 す る M M P 阻 害 剤 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 阻 害 剤 に よ る 効 果 の 検 討 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 6 3 3 . 3 . 8 ヘ ミ デ ス モ ゾ ー ム 形 成 に 対 す る M M P 阻 害 剤 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 阻 害 剤 の 効 果 検 討 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 6 3 3 . 3 . 9 メ ラ ノ サ イ ト を 含 む 皮 膚 モ デ ル の 表 皮 基 底 膜 に 対 す る ヘ パ ラ ナ ー ゼ 阻 害 剤 の 効 果 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 6 4 3 . 3 . 1 0 メ ラ ノ サ イ ト を 含 む 皮 膚 モ デ ル の 黒 化 に 対 す る ヘ パ ラ ナ ー ゼ 阻 害 剤 の 効 果 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 6 5 3 . 4 考 察 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 7 8 3 . 5 ま と め ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 8 3 総 括 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･8 4 要 旨 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･9 0 謝 辞 ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･9 2

略 語 一 覧 B I P B I P U : 1 - [ 4 ( 1 H - b e n z o i m i d a z o l - 2 - y l ) p h e n y l ] - 3 - [ 4 ( 1 H - b e n z o i m i d a z o l - 2 - y l ) - p h e n y l ] u r e a b - F G F : b a s i c - F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r C G S 2 7 0 2 3 A : N - h y d r o x y - 2 ( R ) - [ [ ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) s u l p h o n y l ] ( 3 - p i c o l y l ) - a m i n o ] - 3 - m e t h y l b u t a n a m i d e h y d r o c h l o r i d e D A B : 3 , 3 ’ - d i a m i n o b e n z i d i n e t e t r a h y d r o c h l o r i d e D M E M : D u l b e c c o ’s m o d i f i e d E a g l e M e d i u m D M S O : D i m e t h y l s u l f o x i d e F B S : F e t a l b o v i n e s e r u m F G F - 2 : F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r - 2 F i s h e r ’ s P L S D : F i s h e r ’ s p r o t e c t e d l e a s t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e G 3 P D H : g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e G M - S C F : G r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r H G F : H e p a t o c y t e g r o w t h f a c t o r H S P G : H e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n H R P : H o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e LY V E - 1 : Ly m p h a t i c Ve s s e l E n d o t h e l i a l R e c e p t o r 1 L I F : L e u k e m i a I n h i b i t o r y F a c t o r M M P s : M a t r i x M e t a l l o p r o t e i n a s e s M E D : M i n i m a l e r y t h e m a d o s e N M F : N a t u r a l M o i s t u r i z i n g F a c t o r PA S : P e r i o d i c a c i d S c h i f f P B S : P h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e S C F : S t e m C e l l F a c t o r T E W L : T r a n - s e p i d e r m a l Wa t e r L o s s T S A : T y r a m i d e S i g n a l A m p l i f i c a t i o n T M B : 3 , 3 ' , 5 , 5 ' - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e

T S P - 1 : T h r o m b o s p o n d i n 1 u P A : u r o k i n a s e - t y p e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r U V B : U l t r a v i o l e t B V E G F - A : Va s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r - A V E G F R - 3 : V E G F R e c e p t o r - 3 v W F : v o n - W i l l e b r a n d f a c t o r

遺 伝 子 シ ン ボ ル 一 覧 C O L 4 A 1 : c o l l a g e n , t y p e I V, a l p h a 1 ( h u m a n ) C O L 7 A 1 : c o l l a g e n , t y p e V I I , a l p h a 1 ( h u m a n ) G 3 p d h : g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( m o u s e ) H p s e : H e p a r a n a s e ( m o u s e ) L A M B 3 : L a m i n i n b e t a 3 ( h u m a n ) M M P 9 : M a t r i x M e t a l l o p r o t e i n a s e - 9 ( h u m a n ) Ts p 1 : T h r o m b o s p o n d i n 1 ( m o u s e ) T N F : t u m o r n e c r o s i s f a c t o r a l p h a ( h u m a n ) P L A U : u r o k i n a s e - t y p e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r ( h u m a n ) Ve g f a : Va s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r - A ( m o u s e ) Ve g f c : Va s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r - C ( m o u s e )

学 位 論 文 を 構 成 す る 論 文 1 . I r i y a m a S . , M a t s u n a g a Y . , A m a n o S . H e p a r a n a s e a c t i v a t i o n i n d u c e s e p i d e r m a l h y p e r p l a s i a , a n g i o g e n e s i s , l y m p h a n g i o g e n e s i s a n d w r i n k l e s . E x p . D e r m a t o l . 2 0 1 0 : 1 9 , ( 1 1 ) : 9 6 5 - 9 7 2 . 2 . I r i y a m a S . , M a t s u n a g a Y . , T a k a h a s h i K . , M a t s u z a k i K . , K u m a g a i N . , A m a n o S . A c t i v a t i o n o f h e p a r a n a s e b y u l t r a v i o l e t B i r r a d i a t i o n l e a d s t o f u n c t i o n a l l o s s o f b a s e m e n t m e m b r a n e a t t h e d e r m a l - e p i d e r m a l j u n c t i o n i n h u m a n s k i n . A r c h . D e r m a t o l . R e s . 2 0 1 1 : 3 0 3 ( 4 ) : 2 5 3 - 2 6 1 . 3 . I r i y a m a S . , H i r u m a T . , T s u n e n a g a M . a n d A m a n o S . I n f l u e n c e o f h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s i n p r o t e o g l y c a n a t t h e d e r m a l - e p i d e r m a l j u n c t i o n o n e p i d e r m a l h o m e o s t a s i s . E x p . D e r m a t o l . 2 0 1 1 : 2 0 ( 1 0 ) : 8 1 0 - 8 1 4 . 4 . I r i y a m a S . , T s u n e n a g a M . , A m a n o S . a n d A d a c h i E . K e y r o l e o f h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s i n a s s e m b l y o f a n c h o r i n g c o m p l e x a t t h e d e r m a l - e p i d e r m a l j u n c t i o n . E x p . D e r m a t o l . 2 0 1 1 : 2 0 ( 1 1 ) : 9 5 3 - 9 5 5 . 5 . I r i y a m a S . , O n o T . , A o k i H . a n d A m a n o S . H y p e r p i g m e n t a t i o n i n h u m a n s o l a r l e n t i g o i s p r o m o t e d b y h e p a r a n a s e - i n d u c e d l o s s o f h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s a t t h e d e r m a l – e p i d e r m a l j u n c t i o n . J . D e r m a t o l . S c i . 2 0 1 1 : 6 4 ( 3 ) : 2 2 3 - 2 2 8 .

緒 言 ヒ ト の 身 体 全 体 を 覆 う 皮 膚 は 、 成 人 で 面 積 が 1 . 6 m2、 重 量 は 体 重 の 約1 6 % を 占 め る 人 体 で 最 大 の 臓 器 で あ る 。 外 界 と 直 接 触 れ る た め 、 水 分 の 喪 失 や 透 過 を 防 ぎ 、 体 温 を 調 節 す る 。 さ ら に 、 微 生 物 や 物 理 化 学 的 な 刺 激 か ら 生 体 を 守 り 、 感 覚 器 と し て の 役 割 も 果 た す な ど 、 生 命 を 維 持 す る た め の 必 要 不 可 欠 な 様 々 な 機 能 を も っ て い る 。皮 膚 は 上 層 か ら 順 に 、表 皮 、真 皮 、皮 下 脂 肪 か ら 構 成 さ れ 、加 え て 毛 、爪 、皮 脂 腺 、 汗 腺 等 の 付 属 器 や 神 経 、 血 管 、 リ ン パ 管 が 存 在 す る 。 表 皮 基 底 膜 は 、 皮 膚 の 表 皮 と 真 皮 の 接 合 部 に 存 在 す る 厚 さ 約 1 0 0 n m の 膜 状 の 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス で あ る 。表 皮 基 底 膜 は 光 学 顕 微 鏡 観 察 に て 過 ヨ ウ 素 酸 シ ッ フ ( P e r i o d i c a c i d S c h i f f ; PA S ) 染 色 に 赤 く 染 ま り 、 ジ ア ス タ ー ゼ 抵 抗 性 を 示 す 。 電 子 顕 微 鏡 観 察 で は 基 底 板 （ l a m i n a d e n s a ; L D ） を 中 心 と し た 複 雑 な 構 造 が 見 ら れ る （ 図 1 ） 。 基 底 細 胞 の 細 胞 膜 と 基 底 板 と の 間 を 透 明 層 （l a m i n a l u c i d a ; L L ） と い う 。 基 底 板 は 6 0 ～ 8 0 n m で 、 基 底 細 胞 が 産 生 す る I V 型 コ ラ ー ゲ ン 、 ラ ミ ニ ン 3 3 2 、 パ ー ル カ ン な ど か ら 構 成 さ れ る 。 基 底 細 胞 と 表 皮 基 底 膜 と の 接 着 に は 、 ヘ ミ デ ス モ ゾ ー ム が 重 要 な 役 割 を 果 た す 。ヘ ミ デ ス モ ゾ ー ム は イ ン テ グ リ ンα 6 β 4 、 B P 1 8 0 、 プ レ ク チ ン な ど で 構 成 さ れ る 。 イ ン テ グ リ ン α 6 β 4 が ラ ミ ニ ン 3 3 2 と 結 合 し 、 プ レ ク チ ン が ト ノ フ ィ ラ メ ン ト （ ケ ラ チ ン 5 / 1 4 ） と 結 合 す る こ と で 、 表 皮 基 底 膜 と 基 底 細 胞 の 結 合 お よ び 細 胞 の 形 態 維 持 に 寄 与 し て い る 。 基 底 板 の 下 に は 、V I I 型 コ ラ ー ゲ ン で 形 成 さ れ る 係 留 線 維 が 半 弧 状 に フ ッ ク の よ う に 存 在 し て お り 、こ の ア ン カ ー 構 造 に 真 皮 マ ト リ ッ ク ス 成 分 で あ る I 型 / I I I 型 コ ラ ー ゲ ン 線 維 が 絡 ま る こ と で 、 基 底 板 と 強 固 に 結 合 し て い る 。 こ の よ う に 表 皮 基 底 膜 は 表 皮 と 真 皮 マ ト リ ッ ク ス に 結 合 す る こ と で 、 表 皮 真 皮 を 繋 ぎ 止 め る 役 割 が あ る 。 こ れ ら 表 皮 と 真 皮 の 結 合 に 関 与 す る 因 子 に 遺 伝 的 な 異 常 や 欠 損 が 生 じ た 場 合 、表 皮 と 真 皮 を 繋 ぎ と

め る 表 皮 基 底 膜 構 造 を 形 成 す る こ と が で き ず 、表 皮 と 真 皮 の 間 に 水 疱 （ 水 ぶ く れ ） や び ら ん （ た だ れ ） を 生 じ る 表 皮 水 疱 症 を 発 症 す る 。 そ の た め 、 表 皮 基 底 膜 構 造 の 形 成 は 、 表 皮 真 皮 の 構 造 維 持 に 大 き な 影 響 を 及 ぼ す 要 因 と 考 え ら れ て い る 。 表 皮 基 底 膜 の 構 造 異 常 は 、 遺 伝 的 要 因 以 外 に よ っ て も 引 き 起 こ さ れ る 。 紫 外 線 を 浴 び た 皮 膚 で は 、 V I I 型 コ ラ ー ゲ ン で 形 成 さ れ る 係 留 線 維 は 減 少 し[ 1 ] 、基 底 板 は 重 層 化 す る こ と が 知 ら れ て い る [ 2 , 3 ] 。 こ の 紫 外 線 に 伴 う 表 皮 基 底 膜 の 分 解 に は 、 マ ト リ ッ ク ス メ タ ロ プ ロ テ ア ー ゼ （ M M P s ） [ 4 , 5 ] 、 ウ ロ キ ナ ー ゼ 型 プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン ア ク チ ベ ー タ ー （u PA ） [ 6 , 7 ] が 関 与 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 表 皮 基 底 膜 は 、表 皮 と 真 皮 を 繋 ぎ と め る 構 造 的 な 役 割 以 外 に も 、表 皮 真 皮 コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョ ン を 健 全 に 保 つ 機 能 的 な 役 割 も 担 っ て い る 。 表 皮 基 底 膜 に 存 在 す る プ ロ テ オ グ リ カ ン で あ る パ ー ル カ ン の ヘ パ ラ ン 硫 酸 鎖 は 、 ヘ パ ラ ン 硫 酸 結 合 性 サ イ ト カ イ ン が 表 皮 、 真 皮 間 を 無 秩 序 に 拡 散 す る こ と を 防 ぎ 、サ イ ト カ イ ン の リ ザ ー バ ー と し て 作 用 す る こ と が 知 ら れ て い る[ 8 , 9 ] 。 さ ら に 、 エ ラ ス タ ー ゼ 、 M M P 、 u P A は ヘ パ ラ ン 硫 酸 鎖 に 結 合 す る こ と が 知 ら れ て い る[ 1 0 - 1 3 ] 。そ の た め 、表 皮 基 底 膜 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 は 、 ヘ パ ラ ン 硫 酸 結 合 性 サ イ ト カ イ ン 、 各 種 分 解 酵 素 と 結 合 す る こ と で 、 こ れ ら 物 質 の 表 皮 、 真 皮 間 の 移 動 を 制 御 し 、 表 皮 真 皮 コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョ ン を 健 全 な 状 態 に 保 た れ て い る と 考 え ら れ て い る 。 ヘ パ ラ ナ ー ゼ は e n d o - β - D - g l u c u r o n i d a s e で 、 ヘ パ ラ ン 硫 酸 を 5 - 7 k D a の サ イ ズ ま で 加 水 分 解 す る [ 1 4 - 1 6 ] 。正 常 組 織 で は 、肥 満 細 胞 、血 漿 板 、 胎 盤 、ラ ン ゲ ル ハ ン ス 細 胞 に ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 が あ る こ と が 報 告 さ れ て い る[ 1 7 , 1 8 ] 。皮 膚 組 織 で は 、角 層 お よ び 内 毛 根 鞘 細 胞 に て 発 現 し 、 分 化 、 落 屑[ 1 7 ] 、 発 毛 [ 1 9 ] 、 創 傷 治 癒 [ 2 0 ] に 関 与 す る 。 ま た 、 食 道 上 皮 細 胞 に て ヘ パ ラ ナ ー ゼ が 発 現 し 、 分 化 に 関 与 し て い る [ 2 1 ] 。 さ ら に 、 悪 性 腫 瘍 細 胞 に て 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ が 発 現 亢 進 、 活 性 化 す る こ と で 、 表

皮 基 底 膜 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 を 分 解 し 、 悪 性 腫 瘍 細 胞 の 浸 潤 、 転 移 に 関 与 す る こ と が 報 告 さ れ て い る [ 2 2 ] 。 こ の よ う に 、 皮 膚 に て ヘ パ ラ ナ ー ゼ が 発 現 し て い る こ と は 報 告 さ れ て い る が 、ど の 細 胞 が 主 た る 産 生 細 胞 で あ る の か 、 ま た 皮 膚 で の 役 割 に つ い て は 明 ら か に な っ て い な い 。 紫 外 線 を 慢 性 的 に 浴 び て い る 顔 面 の 皮 膚 （ 以 下 露 光 部 ） は 、 非 露 光 部 以 上 に T r a n s e p i d e r m a l Wa t e r L o s s ( T E W L ) が 増 加 す る こ と で 皮 膚 の 乾 燥 が 誘 導 さ れ[ 2 3 ] 、 加 え て 特 徴 的 な 加 齢 変 化 と し て シ ミ 、 シ ワ 、 た る み の 形 成 、 皮 膚 表 面 の 形 態 変 化 が 生 じ る [ 2 4 , 2 5 ] 。 組 織 学 的 に は 、 自 然 老 化 で 見 ら れ る 表 皮 萎 縮 、 表 皮 基 底 膜 の 平 坦 化 に 加 え 、 コ ラ ー ゲ ン の 減 少 [ 3 , 2 6 ] 、 エ ラ ス チ ン の 変 性 ( S o l a r E l a s t o s i s 形 成 ) [ 2 7 ] 、 表 皮 基 底 膜 の 変 性 、 断 片 化 [ 2 , 2 8 ] が 生 じ る 。 ま た シ ワ 、 シ ミ の 形 成 に は 人 種 差 が あ り 、メ ラ ニ ン の 少 な い 白 人 は ア ジ ア 人 と 比 較 し て 早 期 に 起 こ る [ 2 9 , 3 0 ] 。 さ ら に 、 紫 外 線 量 の 少 な い 秋 田 県 の 女 性 と 紫 外 線 量 の 多 い 鹿 児 島 県 の 女 性 で の 疫 学 調 査 に て 、鹿 児 島 県 の 女 性 の 方 が 早 期 に シ ワ 、 シ ミ が 形 成 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ て い る [ 3 1 ] 。 こ の よ う に 、 紫 外 線 が 皮 膚 老 化 の 主 た る 要 因 で 、表 皮 基 底 膜 の 変 性 、断 片 化 を 含 む 、様 々 な 構 造 変 化 に よ っ て 引 き 起 こ さ れ る こ と が 広 く 知 ら れ て い る 。し か し な が ら 、表 皮 基 底 膜 の 機 能 に 関 わ る ヘ パ ラ ン 硫 酸 に つ い て の 報 告 は さ れ て い な い 。 ま た 、 ヘ パ ラ ン 硫 酸 を 分 解 す る 酵 素 ヘ パ ラ ナ ー ゼ に つ い て も 同 様 で 、 紫 外 線 に よ る 影 響 も 明 ら か に さ れ て い な い 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 、 表 皮 基 底 膜 の 機 能 変 化 が 外 的 ス ト レ ス に 伴 う 皮 膚 障 害 に 、 ど の よ う な 影 響 を 及 ぼ す の か を 明 ら か に し 、ま た そ の 作 用 機 序 を 解 明 す る こ と を 目 的 と し て 研 究 を 行 っ た 。 さ ら に こ の 機 序 に 基 づ き 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ に よ る 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 分 解 を 抑 制 す る こ と で 、ヘ パ ラ ナ ー ゼ が 皮 膚 に 与 え る 影 響 に つ い て も 検 討 し た 。 本 論 文 の 概 略 を ま と め る と 、 初 め に 第 1 章 で は 、 一 過 的 な 外 的 ス ト レ ス が ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 活 性 化 、お よ び 表 皮 基 底 膜 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 に ど の よ う な 影 響 を 及 ぼ す の か を 生 体 皮 膚 で 明 ら か に す る こ と を 目 的 と

し 、 非 露 光 部 皮 膚 に 、 紫 外 線 を 照 射 さ せ 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ お よ び ヘ パ ラ ン 硫 酸 が ど の よ う に 変 化 す る の か を 解 析 し た 。 次 に 第 2 章 で は 、 慢 性 的 な ス ト レ ス が 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 活 性 化 、 お よ び 表 皮 基 底 膜 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 に ど の よ う な 影 響 を 及 ぼ す の か を 生 体 皮 膚 で 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し 、 光 老 化 皮 膚 組 織 、 老 人 性 色 素 斑 組 織 に お け る ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 変 化 を 解 析 し た 。 さ ら に 、 シ ワ 形 成 モ デ ル マ ウ ス を 用 い 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ が シ ワ 形 成 に 及 ぼ す 影 響 を 解 析 し た 。 第 3 章 で は 、 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 が 表 皮 分 化 、 表 皮 基 底 膜 形 成 、 黒 化 に 及 ぼ す 影 響 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 阻 害 剤 を 用 い て 、 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 分 解 を 抑 制 す る こ と で 、表 皮 分 化 、表 皮 基 底 膜 形 成 、 黒 化 に 与 え る 影 響 を 解 析 し た 。 こ れ ら の 検 討 か ら 、 外 因 性 ス ト レ ス に 伴 う 表 皮 ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 活 性 化 が 、 表 皮 基 底 膜 の 機 能 低 下 を 誘 導 し 、 皮 膚 の 構 造 と 機 能 に 影 響 を 及 ぼ す と い う 皮 膚 科 学 研 究 の 新 知 見 を 、本 研 究 の 成 果 と し て 得 る こ と が で き た 。

図 1 皮 膚 お よ び 表 皮 基 底 膜 の 構 造

第 １ 章 紫 外 線 暴 露 で の 急 性 的 な 皮 膚 障 害 に お け る 表 皮 基 底 膜 機 能 へ の ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 影 響 1 . 1 序 論 皮 膚 は 紫 外 線 Ｂ 波 ( U l t r a v i o l e t B ( U V B ) : 2 9 0 - 3 2 0 n m ） を 浴 び る と 、 表 皮 肥 厚 、 紅 斑 （ サ ン バ ー ン ）、 色 素 沈 着 （ サ ン タ ン ）、 血 管 お よ び リ ン パ 管 の 透 過 性 亢 進 、浮 腫 の 形 成 が 一 過 的 に 誘 導 さ れ る [ 3 2 - 3 4 ] 。表 皮 肥 厚 、 紅 斑 、 色 素 沈 着 な ど の 表 皮 性 の 変 化 は 主 に 、 紫 外 線 暴 露 に よ る D N A 損 傷 に よ り 誘 導 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ て い る [ 3 5 - 3 7 ] 。 ま た 、 血 管 お よ び リ ン パ 管 の 透 過 性 亢 進 、 浮 腫 の 形 成 な ど の 真 皮 の 変 化 は 、 表 皮 に お け る Va s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r - A ( V E G F - A ) の 産 生 亢 進 に よ っ て 引 き 起 こ さ る[ 3 8 - 4 0 ] 。そ の 他 に 、紫 外 線 暴 露 に 伴 い 、M a t r i x M e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s ) が 産 生 亢 進 、 活 性 化 [ 4 , 4 1 ] し 、 E l a s t a s e を 産 生 す る 好 中 球 の 真 皮 乳 頭 層 へ の 浸 潤[ 4 2 ] が 生 じ 、 表 皮 基 底 膜 成 分 で あ る I V 型 、V I I 型 コ ラ ー ゲ ン や 、真 皮 乳 頭 層 に 存 在 す る マ ト リ ッ ク ス で あ る I 型 コ ラ ー ゲ ン 、 エ ラ ス チ ン が 分 解 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 す な わ ち 、 紫 外 線 を 浴 び た 皮 膚 で は 、 表 皮 、 表 皮 基 底 膜 、 真 皮 の 構 成 物 が ダ メ ー ジ を 受 け 、 急 性 的 な 皮 膚 障 害 が 生 じ る 。 ヘ パ ラ ン 硫 酸 プ ロ テ オ グ リ カ ン ( H S P G ) は 、 F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r - 2 ( F G F - 2 ) な ど の ヘ パ ラ ン 硫 酸 結 合 性 サ イ ト カ イ ン を 介 し た 生 理 活 性 を 持 っ て い る [ 4 3 ] 。ヘ パ ラ ン 硫 酸 は 細 胞 膜 上 の F G F - F G F 受 容 体 の 親 和 性 を 高 め 、 c o - r e c e p t o r と し て 作 用 す る こ と で 、 F G F s の 活 性 を 制 御 す る[ 4 4 ] 、 ま た 、 V E G F - A も ヘ パ ラ ン 硫 酸 と 結 合 す る こ と で 血 管 新 生 を 誘 導 す る こ と が 知 ら れ て い る[ 4 5 , 4 6 ] 。 H S P G で あ る パ ー ル カ ン は 、 表 皮 － 真 皮 間 に 存 在 す る 表 皮 基 底 膜 の 構 成 成 分 で 、様 々 な サ イ ト カ イ ン の シ グ ナ ル を 制 御 し て い る [ 4 7 - 4 9 ] 。 さ ら に 、 パ ー ル カ ン は 、 表 皮 基 底 膜 に お い て ヘ パ ラ ン 硫 酸 結 合 性 サ イ ト カ イ ン の リ ザ ー バ ー と し て 作 用 す る[ 5 0 - 5 3 ] 。ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 に よ っ て 、ヘ パ ラ ン 硫 酸 が 分 解 さ れ

る こ と で 、 H S P G に 結 合 し て い る サ イ ト カ イ ン は 遊 離 す る こ と が 知 ら れ て い る が[ 5 4 ] 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ が 紫 外 線 に よ っ て ど の よ う に 影 響 を 受 け る の か は 明 ら か に さ れ て い な い 。 本 章 で は 、紫 外 線 照 射 に 伴 う 急 性 的 な 皮 膚 障 害 に ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 化 お よ び 表 皮 基 底 膜 の 機 能 変 化 が 関 与 す る の か を 明 ら か に す る た め に 、 ヒ ト 皮 膚 組 織 を 用 い て 検 討 を 行 う こ と と し た 。 紫 外 線 の 影 響 を 検 討 す る た め 、日 常 紫 外 線 に 暴 露 さ れ て い な い 非 露 光 部 皮 膚 で あ る 臀 部 皮 膚 に 紫 外 線 照 射 最 小 紅 斑 量( M E D ) の ２ 倍 ( 2 M E D ) の U V B を 照 射 し た U V B 照 射 ヒ ト 皮 膚 組 織 と 、そ の 近 傍 の 非 露 光 部 皮 膚 を 用 い て 、ヘ パ ラ ナ ー ゼ 、 お よ び 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 に 対 す る 影 響 を 検 討 し た 。 さ ら に 、U V B 照 射 に よ る ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 活 性 へ の 影 響 を 明 ら か に す る た め に 、 培 養 表 皮 角 化 細 胞 を 用 い て 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 活 性 を 評 価 し た 。 1 . 2 実 験 材 料 と 方 法 1 . 2 . 1 実 験 材 料 ア セ ト ン 、安 息 香 酸 メ チ ル 、キ シ レ ン 、パ ラ フ ィ ン 、ヘ マ ト キ シ リ ン 、 酢 酸 ナ ト リ ウ ム 、 過 ヨ ウ 素 酸 ナ ト リ ウ ム は 和 光 純 薬 （ 大 阪 、 日 本 ） か ら 購 入 し た 。F G F - 2 , F G F - 7 , V E G F - A は R & D s y s t e m s（ M i n n e a p o l i s , M N ） か ら 、ヘ パ リ ン － セ フ ァ ロ ー ス 、セ フ ァ ロ ー ス はG E ヘ ル ス ケ ア（ T o k y o 、 J a p a n ） か ら 、 N H2- R e a c t i v e - B i o t i n は D o j i n d o M o l e c u l a r T e c h .（ T o k y o , J a p a n ) か ら 、 U l t r a f r e e C 3 L G C は ミ リ ポ ア ( J a p a n M i l l i p o r e , To k y o ) か ら 、 T y r a m i d e S i g n a l A m p l i f i c a t i o n ( T S A ) k i t は イ ン ビ ト ロ ジ ェ ン ( I n v i t r o g e n , T o k y o , J a p a n ) ） か ら 、 3 , 3 ’ - d i a m i n o b e n z i d i n e t e t r a h y d r o - c h l o r i d e（ D A B ） は D A K O（ D a k o , J a p n a ） か ら 、 ヒ ト 正 常 表 皮 角 化 細 胞 は ク ラ ボ ウ 社 （ To k y o , J a p a n ） か ら 、 ダ ル ベ ッ コ 改 変 イ ー グ ル 培 地 （D M E M ）、 牛 胎 児 血 清 （ F B S ） は G I B C O / B R L （ G r a n d I s l a n d , N Y ） か ら 、 ヘ パ ラ ン 硫 酸 、 ヘ パ リ チ ナ ー ゼ I / I I は 生 化 学 工 業 （ 東 京 、 日 本 ） か ら 、p h o t o b i o t i n a c e t a t e は S I G M A （S t . L o u i s , M O） か ら 、 カ ル ボ バ イ

ン ド 9 6 穴 プ レ ー ト は C o r n i n g（ C o r n i n g , N Y ） か ら 、 B C A P r o t e i n A s s a y K i t は T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c （R o c k f o r d , I L） か ら 購 入 し た 。 抗 体 は 、 抗 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 抗 体 （ C l o n e ; H P 3 / 1 7 , I n S i g h t B i o p h a r m a c e u t i c a l s , R e h o v o t , I s r a e l ） 、 抗 パ ー ル カ ン 抗 体 （ C l o n e ; M A B 1 9 4 8 , C h e m i c o n I n t e r n a t i o n a l , C A ）、 抗 ヘ パ ラ ン 硫 酸 抗 体 （ C l o n e ; J M 4 0 3 , S e i k a g a k u k o g y o , To k y o , J a p a n ）、 抗 ヘ パ ラ ン 硫 酸 抗 体 （ C l o n e ; 3 G 1 0 , S e i k a g a k u k o g y o , To k y o , J a p a n ） 、 抗 ヒ ト  - a c t i n 抗 体 ( c l o n e ; C 4 , M i l l i p o r e , T o k y o , J a p a n ) を 用 い た 。 1 . 2 . 2 紫 外 線 を 照 射 し た ヒ ト 皮 膚 組 織 の 採 取 イ ン フ ォ ー ム ド コ ン セ ン ト を 行 っ た 2 5 歳 か ら 4 6 歳 の 日 本 人 の ボ ラ ン テ ィ ア 5 名 の 臀 部 か ら 皮 膚 採 取 を 行 っ た 。 採 取 に 当 た っ て は 、 当 該 ヒ ト 試 験 の 倫 理 性 、 科 学 的 妥 当 性 、 個 人 情 報 の 保 護 、 イ ン フ ォ ー ム ド コ ン セ ン ト の 内 容 な ど を 、 社 外 弁 護 士 、 医 師 を メ ン バ ー に 含 む 、 資 生 堂 倫 理 審 議 会 で 審 査 、 承 認 を 受 け た 。 資 生 堂 倫 理 審 議 会 は 厚 生 労 働 省 か ら 通 達 さ れ た 「 臨 床 研 究 に 関 す る 倫 理 指 針 」 に 基 づ い た 審 査 基 準 が 策 定 さ れ て い る 。 U V B 照 射 に は 、 3 0 5 n m を ピ ー ク と す る 2 8 0 - 3 6 0 n m の 波 長 の U V B を 照 射 す る m o d e l M - D M R 1 0 0 （ 東 芝 、 東 京 、 日 本 ） を 用 い た 。 M E D 判 定 は 、0 . 3 5 m W / c m2 を 最 小 用 量 と し て 、照 射 2 4 時 間 後 の 紅 斑 の 状 態 か ら 判 定 し た 。判 定 結 果 に 基 づ き 、臀 部 皮 膚 2 × 2 c m に 2 M E D の U V B を 照 射 し た 。 照 射 4 8 時 間 後 に 照 射 部 位 と 近 接 の 未 照 射 部 位 か ら 、 表 皮 お よ び 真 皮 上 層 を 局 所 麻 酔 下 3 m m バ イ オ プ シ に よ り 採 取 し た 。 採 取 後 、組 織 切 片 作 製 用 に 、冷 蔵 ア セ ト ン で 固 定 後 に A M e X 法 で パ ラ フ ィ ン に 包 埋 し た 。 1 . 2 . 3 免 疫 組 織 染 色 A M e X パ ラ フ ィ ン ブ ロ ッ ク よ り 厚 さ 3 μ m の 薄 切 切 片 を 作 製 し た 。 薄

切 切 片 は 、 キ シ レ ン 、 ア セ ト ン に よ る 脱 パ ラ フ ィ ン 化 後 に 、 内 在 性 の ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 を 失 活 さ せ る た め 3 % 過 酸 化 水 素 で 室 温 2 0 分 処 理 し た 。 そ の 後 ブ ロ ッ キ ン グ 溶 液 で 1 時 間 処 理 後 に 、 1 次 抗 体 反 応 を 室 温1 時 間 行 っ た 。 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 染 色 に は 2 種 類 の 抗 体 （ J M 4 0 3 抗 体 、 3 G 1 0 抗 体 ） を 用 い た 。 J M 4 0 3 抗 体 は 、 ラ ッ ト の 糸 球 体 の 基 底 膜 由 来 ヘ パ ラ ン 硫 酸 プ ロ テ オ グ リ カ ン を 抗 原 と し て 作 成 さ れ た 抗 体 で 、表 皮 基 底 膜 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 を 認 識 す る 抗 体 で あ る 。 ま た 、3 G 1 0 抗 体 は 、 ヘ パ ラ ン 硫 酸 を 特 異 的 に 消 化 す る ヘ パ リ チ ナ ー ゼ I / I I 処 理 後 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 の n e o - e p i t o p e ( 不 飽 和 ウ ロ ン 酸 ) を 認 識 す る 抗 体 で あ る 。 3 G 1 0 抗 体 を 用 い た 染 色 の 場 合 、 ブ ロ ッ キ ン グ 溶 液 で の 反 応 前 に 、 ヘ パ リ チ ナ ー ゼ I / I I 溶 液 に て 1 時 間 室 温 で 反 応 さ せ 、組 織 中 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 を 分 解 さ せ 、 3 G 1 0 抗 体 が 認 識 す る n e o - e p i t o p e を 露 出 さ せ て か ら 、ブ ロ ッ キ ン グ 溶 液 処 理 を 行 い 、 1 次 抗 体 反 応 を 行 っ た 。 そ の 後 、 ス ラ イ ド を P h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) で 3 回 洗 浄 、 ホ ー ス ラ デ ィ ッ シ ュ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ （ H R P ） が 結 合 し た 抗 I g G を 室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ た 。 再 度 P B S で 3 回 洗 浄 後 、 D A B 基 質 溶 液 を 加 え 1 - 5 分 間 反 応 さ せ た 。 最 後 に 、 ヘ マ ト キ シ リ ン 溶 液 に 2 0 秒 間 浸 漬 さ せ 、 M i l l i Q 水 で 洗 浄 後 、 キ シ レ ン に 置 換 し 、 マ ウ ン ト ク イ ッ ク を 用 い て 封 入 し 、 顕 微 鏡 顕 観 察 を 行 っ た 。 1 . 2 . 4 サ イ ト カ イ ン の ビ オ チ ン 化 膨 潤 化 さ せ た ヘ パ リ ン － セ フ ァ ロ ー ス に 、 F G F - 2 、 V E G F - A 、 F G F - 7 を 加 え 室 温 で 3 0 分 反 応 さ せ る こ と で 、ヘ パ リ ン に 結 合 さ せ た 。そ の 後 、 N H2- R e a c t i v e - B i o t i n を 室 温 で 5 分 反 応 さ せ 、 ヘ パ リ ン に 結 合 し た サ イ ト カ イ ン を ビ オ チ ン 化 さ せ た 。 そ の 後 、P B S で 6 回 洗 浄 後 、 3 M N a C l バ ッ フ ァ ー で ヘ パ リ ン － セ フ ァ ロ ー ス か ら 溶 出 し た 。 U l t r a f r e e C 3 L G C を 用 い て N a C l を 除 去 し 、ビ オ チ ン 化 F G F - 2 、ビ オ チ ン 化 V E G F - A 、ビ オ チ ン 化 F G F - 7 を 調 製 し た 。

1 . 2 . 5 I n s i t u b i n d i n g a s s a y 1 . 2 . 3 と 同 様 に ブ ロ ッ キ ン グ 処 理 ま で 行 っ た 薄 切 切 片 に 、 ビ オ チ ン 化 F G F - 2 、 ビ オ チ ン 化 V E G F - A 、 ビ オ チ ン 化 F G F - 7 を 室 温 で 2 時 間 反 応 さ せ た 。ス ラ イ ド を P B S で 3 回 洗 浄 後 、H R P 結 合 抗 I g G を 室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ た 。 再 度 P B S で 3 回 洗 浄 後 、 T S A 増 感 試 薬 を 5 分 反 応 さ せ 、 再 度 P B S で 3 回 洗 浄 後 、 再 度 H R P が 結 合 し た 抗 I g G を 室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ 、 P B S で 3 回 洗 浄 後 、 D A B 染 色 試 薬 に て 発 色 さ せ た 。 P B S で 洗 浄 後 、 ヘ マ ト キ シ リ ン に て カ ウ ン タ ー 染 色 を 行 い 、 マ ウ ン ト ク イ ッ ク を 用 い て 封 入 し 、 光 学 顕 微 鏡 に て 観 察 し た 。 1 . 2 . 6 細 胞 の 培 養 ヒ ト 正 常 表 皮 角 化 細 胞 は 、 無 血 清 上 皮 細 胞 用 培 地 で 、3 7 ℃ 、 5 % C O2 イ ン キ ュ ベ ー タ ー 内 に て 培 養 し た 。 P a s s a g e 3 の ヒ ト 正 常 表 皮 角 化 細 胞 を 6 w e l l p l a t e に 播 種 し 、 2 4 時 間 後 に 、 培 地 を P B S に 置 換 し て か ら 5 0 m J / c m2 の U V B を 照 射 し た 。 対 照 群 は 培 地 を P B S に 置 換 し た の み と し た 。 照 射 後 、 培 地 に 戻 し 培 養 を 再 開 し 、 1 時 間 、 2 時 間 、 3 時 間 後 に 回 収 し て 評 価 に 用 い た 。 1 . 2 . 7 ヘ パ ラ ナ ー ゼ ア ッ セ イ 1 . 2 . 7 . 1 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の ビ オ チ ン 化 4 m g ヘ パ ラ ン 硫 酸 と 、 2 m g p h o t o b i o t i n a c e t a t e を 2 . 4 m L P B S に 溶 解 し 、 U V c r o s s l i n k e r （ U V P 、 C L - 1 0 0 0 ） に て 0 . 5 μ W / c m2の 強 度 で4 0 分 U V を 照 射 し た 。 反 応 物 は 、 透 析 膜 に 入 れ て 、4 ℃ P B S 中 で 一 晩 攪 拌 す る こ と で 、 透 析 し た 。 透 析 後 は 、 P B S に て 8 m L に メ ス ア ッ プ し て 5 0 0 μ g / m L の ビ オ チ ン 化 ヘ パ ラ ン 硫 酸 と し た 。1 0 0 μ L / t u b e に て 8 0 本 に 分 注 し 、- 3 0 ℃ に て 保 存 し た 。

1 . 2 . 7 . 2 過 ヨ ウ 素 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 の 調 製 酢 酸 ナ ト リ ウ ム 0 . 8 2 g を 8 0 0 m L の 水 に 溶 解 し 、p H を 4 . 0 に 調 整 し た 後 に 水 で 1 L へ メ ス ア ッ プ し た も の を 、 1 0 m M 酢 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 と し た 。 過 ヨ ウ 素 酸 ナ ト リ ウ ム0 . 0 2 1 3 8 g を 1 0 m M 酢 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 1 m L に 溶 解 し 、 1 0 0 m M 過 ヨ ウ 素 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 を 作 製 し 、 そ れ を さ ら に 1 0 m M 酢 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 に て 1 0 , 0 0 0 倍 希 釈 し た も の を 1 0 μ M 過 ヨ ウ 素 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 と し た 。 1 . 2 . 7 . 3 9 6 ウ ェ ル プ レ ー ト へ の ビ オ チ ン 化 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 固 定 ビ オ チ ン 化 ヘ パ ラ ン 硫 酸 を 、1 0 μ M 過 ヨ ウ 素 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 に 混 合 し 、 5 分 間 室 温 で 静 置 さ せ る こ と で 、 末 端 糖 鎖 を 酸 化 開 環 さ せ た 。 そ の 後 、素 早 く カ ル ボ バ イ ン ド 9 6 穴 プ レ ー ト に 1 0 0 μ L / w e l l で 播 種 し 、 3 7 ℃ で 2 時 間 反 応 さ せ 、ビ オ チ ン 化 ヘ パ ラ ン 硫 酸 鎖 を プ レ ー ト に 共 有 結 合 さ せ た 。 そ の 後 、 0 . 1 % T w e e n 2 0 を 含 む P B S ( P B S - T ) に て 3 回 洗 浄 し た 。 そ の 後 、 1 % ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン ( B S A ) を 含 む P B S - T ( 1 % B S A - P B S - T ) を 1 0 0 μ L / w e l l 播 種 し て 、3 7 ℃ で 1 時 間 反 応 さ せ る こ と で ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た 。 プ レ ー ト は 、 乾 燥 さ せ た 後 、 - 3 0 ℃ に て 保 存 し た 。 1 . 2 . 7 . 4 細 胞 抽 出 液 の 調 製 紫 外 線 を 照 射 し た ヒ ト 表 皮 角 化 細 胞 を 、 可 溶 化 溶 液 （ 5 0 m M T r i s , 0 . 5 % T r i t o n X - 1 0 0 , 0 . 1 5 M N a C l , p H 4 . 5 ） に て 可 溶 化 し 、 ス ク レ イ パ ー に て 回 収 し た 後 、 ピ ペ ッ テ ィ ン グ を 行 い 氷 上 で 3 0 分 間 静 置 さ せ た 。 そ の 後 1 0 , 0 0 0 r p m で 1 0 分 遠 心 す る こ と で 、 不 溶 解 物 を 除 去 し て 上 清 を 細 胞 抽 出 液 と し た 。 細 抽 出 液 中 の タ ン パ ク 量 は B C A P r o t e i n A s s a y K i t に て 測 定 し た 。

1 . 2 . 7 . 5 ヘ パ ラ ナ ー ゼ ア ッ セ イ お よ び 検 出 細 胞 抽 出 液 を 評 価 溶 液 （ 5 0 m M H E P E S , 5 0 m M C H3C O O N a , 1 5 0 m M N a C l , 9 m M C a C l2, 0 . 1 % B S A ） に て 所 定 の 濃 度 に 希 釈 し 、 ビ オ チ ン 化 ヘ パ ラ ン 硫 酸 固 定 化 プ レ ー ト に1 0 0 μ L / w e l l で 播 種 し た 。3 7 ℃ で 2 時 間 反 応 さ せ 、P B S - T で 3 回 洗 浄 し て か ら 、ホ ー ス ラ デ ィ ッ シ ュ パ ー オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 ア ビ ジ ン 溶 液 ( H R P － a v i d i n / P B S － T ) を 1 0 0 μ L / w e l l で 播 種 し て 3 7 ℃ で 1 時 間 反 応 さ せ た 。再 度 3 回 P B S - T に て 洗 浄 を 行 い 、3 , 3 ' , 5 , 5 ' - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e ( T M B ) を 1 0 0 μ L / w e l l で 播 種 し て 反 応 さ せ 、 1 N H2S O4 に て 反 応 を 止 め た 後 、 O D 4 7 5 n m を 測 定 し た 。 1 . 2 . 8 ヘ パ ラ ナ ー ゼ の ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 表 皮 角 化 細 胞 の タ ン パ ク 質 抽 出 液（ 1 0 μ g 等 量 ）を 、0 . 1 % S D S 、5 – 1 5 % S D S – P A G E で 電 気 泳 動 を 行 い 、 ニ ト ロ セ ル ロ ー ス メ ン ブ レ ン に 電 圧 印 加 法 に よ り 転 写 し た 。イ ム ノ ブ ロ ッ ク で メ ン ブ レ ン を ブ ロ ッ キ ン グ 後 、 1 次 抗 体 を 反 応 さ せ 、 さ ら に H R P を 結 合 さ せ た 2 次 抗 体 を 反 応 さ せ た 。 抗 原 抗 体 複 合 体 は E C L を 用 い て 検 出 し た 。 1 . 2 . 9 擬 似 基 底 膜 を 用 い た V E G F - A 透 過 性 評 価 所 定 の 比 率 （ 1 0 0 : 0 , 8 0 : 2 0 , 6 0 : 4 0 , 4 0 : 6 0 , 2 0 : 8 0 , 0 : 1 0 0 ） で 混 合 し た ヘ パ リ ン － セ フ ァ ロ ー ス 、セ フ ァ ロ ー ス に 加 熱 溶 解 し た ア ガ ロ ー ス を 加 え 、 0 . 5 ％ ア ガ ロ ー ス 溶 液 と し た 。 ヘ パ リ ン － セ フ ァ ロ ー ス 、 セ フ ァ ロ ー ス を 含 む 0 . 5 % ア ガ ロ ー ス 溶 液 を S n a p w e l l の メ ン ブ レ ン に 1 5 μ L 添 加 し て 、 メ ン ブ レ ン を 均 一 に ゲ ル 化 さ せ た 。 S n a p w e l l を 2 4 w e l l p l a t e に 設 置 し 、 p l a t e w e l l 側 に 0 . 1 % B S A - P B S を 5 0 0 μ L 加 え 、 S n a p w e l l 側 に 1 0 0 μ g / m L V E G F - A / 0 . 1 % B S A - P B S を 1 0 0 μ L 加 え た 。 4 ℃ で 一 晩 静 置 後 に w e l l 側 の 溶 液 に 含 ま れ る V E G F - A 量 を 測 定 し た 。

1 . 2 . 1 0 E L I S A 法 に よ る V E G F - A の 定 量 測 定 培 養 上 清 お よ び 希 釈 標 準 品1 0 0 μ L を 、 抗 V E G F 抗 体 を コ ー ト し た w e l l に 加 え 、 3 7 ℃ で 6 0 分 静 置 し た 。 洗 浄 バ ッ フ ァ ー で 3 回 洗 浄 後 、 標 識 抗 体 溶 液1 0 0 μ L 加 え 抗 体 を 反 応 さ せ た 。3 回 洗 浄 後 に 、T M B で 呈 色 反 応 さ せ 、1 N H2S O4で 反 応 を 停 止 さ せ た 。4 5 0 n m の 吸 光 度 を 測 定 し 、 希 釈 標 準 品 の4 5 0 n m の 吸 光 度 値 か ら 検 量 線 を 作 製 し 、 V E G F - A 量 を 算 出 し た 。 1 . 2 . 1 1 血 管 新 生 キ ッ ト を 用 い た 透 過 V E G F - A に よ る 血 管 新 生 評 価 1 . 2 . 9 で 作 製 し た ヘ パ リ ン － セ フ ァ ロ ー ス を 含 む ア ガ ロ ー ス で ゲ ル 化 し た S n a p w e l l と 、 セ フ ァ ロ ー ス を 含 む ア ガ ロ ー ス で ゲ ル 化 し た S n a p w e l l を 、 血 管 新 生 キ ッ ト の 2 4 w e l l p l a t e に 設 置 し た 。 血 管 新 生 専 用 培 地- 2 を P l a t e w e l l に 5 0 0 μ L 加 え 、 0 μ g / m L , 1 0 μ g / m L , 1 0 0 μ g / m L V E G F - A / 0 . 1 % B S A - P B S を S n a p w e l l に 1 0 0 μ L 加 え て 、 3 7 ℃ 、 5 % C O2 イ ン キ ュ ベ ー タ ー 内 に て 培 養 し た 。 培 養 11 日 目 後 に 、 キ ッ ト の 説 明 に 従 っ て 、 7 0 % エ タ ノ ー ル で 細 胞 を 固 定 化 し 、 抗 C D 3 1 抗 体 を 用 い て 、 管 腔 染 色 し た 。血 管 新 生 定 量 ソ フ ト ウ エ ア を 使 用 し て ス コ ア リ ン グ し 、 管 腔 面 積 を 評 価 し た 。 1 . 2 . 1 2 統 計 解 析 デ ー タ は 平 均 値 ± 標 準 誤 差 に て 表 し た 。 対 照 群 と 複 数 の 条 件 群 と の 有 意 差 の 検 定 に は F i s h e r の p r o t e c t e d l e a s t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ( F i s h e r ’ s P L S D ) 検 定 を 、 対 照 群 と 比 較 群 と の 有 意 差 の 検 定 は S t u d e n t のt 検 定 を 用 い 、マ イ ク ロ ソ フ ト エ ク セ ル に て 解 析 を 行 っ た 。P 値 が 0 . 0 5 よ り 小 さ い 場 合 に 有 意 差 が あ る と し た 。

1 . 3 結 果 1 . 3 . 1 紫 外 線 照 射 に よ る 表 皮 中 に お け る ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 発 現 増 加 お よ び 活 性 化 ヘ パ ラ ナ ー ゼ が ヒ ト 皮 膚 組 織 に て 発 現 し て い る の か 、 ま た 紫 外 線 に よ っ て 発 現 変 動 す る の か を 検 討 す る た め 、ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 免 疫 組 織 染 色 を U V B 照 射 し た ヒ ト 皮 膚 組 織 に て 実 施 し た 。 マ ウ ス I g G を 用 い た コ ン ト ロ ー ル で は 染 色 は 確 認 で き な い の に 対 し て（ 図 2 c ）、紫 外 線 を 浴 び て い な い 非 露 光 部 の ヒ ト 皮 膚 組 織 切 片 で は 表 皮 に 薄 い 染 色 が 確 認 さ れ た （ 図 2 a ） 。 さ ら に 、 2 M E D の U V B を 照 射 し て 4 8 時 間 後 の ヒ ト 皮 膚 組 織 切 片 で は 表 皮 で の 染 色 性 が 増 加 し た （ 図 2 b ） 。 そ の 他 4 名 の ボ ラ ン テ ィ ア に お い て も 同 様 な 結 果 が 得 ら れ た（ デ ー タ 非 掲 載 ）。 紫 外 線 に よ っ て ヒ ト 皮 膚 組 織 中 の 表 皮 に て ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 発 現 が 亢 進 し た こ と か ら 、 次 に U V B 照 射 に 伴 う ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 変 化 を 検 討 す る た め 、 培 養 ヒ ト 表 皮 細 胞 中 の ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 を 測 定 し た 。 す る と 、 5 0 m J / c m2 の U V B を 照 射 2 , 3 時 間 後 に 有 意 な ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 化 が 認 め ら れ た （ 図 2 d ） 。 さ ら に 、 前 駆 体 と 活 性 型 の 両 方 の ヘ パ ラ ナ ー ゼ を 認 識 す る H P 3 / 1 7 抗 体 を 用 い て ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 解 析 を 行 っ た と こ ろ 、 U V B を 照 射 し た 培 養 表 皮 細 胞 タ ン パ ク 質 溶 液 中 に 、 前 躯 体 ヘ パ ラ ナ ー ゼ で あ る 6 8 k D a バ ン ド に 加 え 、活 性 型 ヘ パ ラ ナ ー ゼ で あ る 5 0 k D a の バ ン ド が 検 出 さ れ た （ 図 2 e ） 。 1 . 3 . 2 紫 外 線 照 射 に よ る 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 減 少 活 性 型 ヘ パ ラ ナ ー ゼ は 、 皮 膚 表 皮 - 真 皮 間 の 表 皮 基 底 膜 に 存 在 す る ヘ パ ラ ン 硫 酸 プ ロ テ オ グ リ カ ン で あ る パ ー ル カ ン の ヘ パ ラ ン 硫 酸 鎖 を 分 解 す る こ と が 報 告 さ れ て い る こ と か ら[ 5 5 ] 、 次 に パ ー ル カ ン の コ ア タ ン パ ク 質 、 組 織 中 の 全 ヘ パ ラ ン 硫 酸 プ ロ テ オ グ リ カ ン 、 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 免 疫 染 色 を 検 討 し た 。 パ ー ル カ ン の コ ア タ ン パ ク 質 は 、 紫 外 線 照 射 の 有 無 に よ る 変 化 は 観 察 さ れ な か っ た （ 図 3 a , b ） 。 さ ら に 、 ヘ

パ リ チ ナ ー ゼ I / I I 処 理 を 行 い 、 3 G 1 0 抗 体 が 認 識 す る ヘ パ ラ ン 硫 酸 の n e o - e p i t o p e を 露 出 さ せ た 組 織 切 片 に て 、 3 G 1 0 抗 体 を 用 い た 免 疫 染 色 を 行 っ た が 、紫 外 線 照 射 の 有 無 に よ る 変 化 は み ら れ な か っ た（ 図 3 e , f ）。 し か し な が ら 、 紫 外 線 を 照 射 し た ヒ ト 皮 膚 組 織 で は 、 紫 外 線 を 浴 び て い な い ヒ ト 皮 膚 組 織 と 比 較 し て （ 図 3 c ） 、 J M 4 0 3 抗 体 が 認 識 す る 表 皮 基 底 膜 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 鎖 の 染 色 性 が 著 し く 低 下 し て い た （ 図 3 d ） 。 そ の 他 の ボ ラ ン テ ィ ア の 皮 膚 組 織 の 染 色 結 果 で も 同 様 の 結 果 で あ っ た （ デ ー タ 非 掲 載 ） 。 1 . 3 . 3 紫 外 線 照 射 ヒ ト 皮 膚 の 表 皮 基 底 膜 に お け る サ イ ト カ イ ン の 結 合 量 低 下 さ ら に 、表 皮 基 底 膜 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 は F G F - 2 、V E G F - A 、F G F - 7 と 結 合 す る こ と で 、こ れ ら サ イ ト カ イ ン が 表 皮 － 真 皮 間 で の 移 動 の 制 御 を 行 っ て い る こ と か ら[ 5 6 , 5 7 ] 、紫 外 線 照 射 ヒ ト 皮 膚 組 織 を 用 い て i n s i t u b i n d i n g a s s a y に て 各 サ イ ト カ イ ン の 結 合 性 を 検 討 し た 。紫 外 線 を 浴 び て い な い 非 露 光 部 ヒ ト 皮 膚 組 織 切 片 で は 、F G F - 2 、 V E G F - A 、 F G F - 7 は 表 皮 基 底 膜 だ け で な く 、表 皮 細 胞 の 膜 状 に も 結 合 し て い る が ( 図 4 a - c ) 、 紫 外 線 を 照 射 し た 皮 膚 で は 、そ れ ら 結 合 性 が 著 し く 低 下 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た ( 図 4 d - f ) 。 そ の 他 の ボ ラ ン テ ィ ア の 皮 膚 組 織 の 染 色 結 果 で も 同 様 の 結 果 で あ っ た （ デ ー タ 非 掲 載 ） 。 1 . 3 . 4 ヘ パ ラ ン 硫 酸 減 少 に よ り 、 血 管 新 生 を 誘 導 ヘ パ リ ン は 、 ヘ パ ラ ン 硫 酸 と 同 様 に 硫 酸 基 を 持 つ 糖 鎖 で あ り 、 サ イ ト カ イ ン と 結 合 す る こ と が 知 ら れ て い る [ 5 8 ] 。 そ こ で 、 ヘ パ ラ ン 硫 酸 減 少 に よ り 、V E G F - A の 透 過 性 が 亢 進 す る の か を 明 ら か に す る た め 、 ヘ パ リ ン を 含 む 擬 似 基 底 膜 を 透 過 す る V E G F - A 量 を E L I S A 法 に て 評 価 し た 。 そ の 結 果 、 ヘ パ リ ン の 量 に 依 存 し て 透 過 す る V E G F - A 量 が 低 下 し た 。 さ ら に 、 血 管 新 生 キ ッ ト （ ク ラ ボ ウ 社 ） を 用 い て 、 透 過 し た

V E G F - A に よ る 血 管 新 生 へ の 影 響 を 評 価 し た 。 そ の 結 果 、 ヘ パ リ ン を 含 ま な い 擬 似 基 底 膜 を 用 い た 群 で は 、添 加 し た V E G F - A 量 に 依 存 し て C D 3 1 陽 性 血 管 内 皮 細 胞 の 管 腔 形 成 が 認 め ら れ た が 、 ヘ パ リ ン を 含 む 擬 似 基 底 膜 を 用 い た 群 で は 、 添 加 し た V E G F - A 量 に 依 存 せ ず C D 3 1 陽 性 血 管 内 皮 細 胞 の 管 腔 形 成 が 認 め ら れ な か っ た 。 し た が っ て 、 ヘ パ リ ン が 減 少 す る と 、 V E G F - A の 透 過 性 が 高 ま り 、 血 管 新 生 を 誘 導 し た 可 能 性 が 示 唆 さ れ た （ 図 5 ） 。

図 2 U V B 照 射 に 伴 う 皮 膚 表 皮 に お け る ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 発 現 増 加 お よ び 活 性 化

26 歳 、 非 露 光 部 （ 臀 部 ） 皮 膚 組 織 切 片 （ a） と 、 UVB を 照 射 し た 臀 部 皮 膚 組 織 切 片 （ b） に お け る 、 抗 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 抗 体 （HP3/17）を 用 い た 組 織 免 疫 染 色 を 行 っ た 。 （ c）： UVB を 照 射 し た 臀 部 皮 膚 組 織 切 片 に よ る mouse IgG を 用 い た Negative コ ン ト ロ ー ル 染 色 を 示 し た 。 バ ー は 200μm を 示 す 。 （ d） ： 50mJ/cm2 _{UVB を 照 射 し 1, 2, 3 時 間 後 の 培 養 ヒ ト 表} 皮 角 化 細 胞（ 照 射 群 ）と 、未 照 射 で 同 条 件 の 培 養 ヒ ト 表 皮 角 化 細 胞（ 未 照 射 群 ）に お け る ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 を 比 較 評 価 し た 。 結 果 は 、 各 群 N=6 の 平 均 値 ±標 準 誤 差 で 示 し た 。 群 間 の 統 計 学 的 な 有 意 差 検 定 は 、Student t 検 定 に て 解 析 し た 。 照 射 群 は 未 照 射 群 と 比 較 し 、 **は P<0.01、*は P<0.05 を 示 す 。（ e）： 50mJ/cm2 UVB を 照 射 2 時 間 後 の 培 養 ヒ ト 表 皮 角 化 細 胞 と 未 照 射 で 同 条 件 の 培 養 ヒ ト 表 皮 角 化 細 胞 か ら 抽 出 し た タ ン パ ク 質 抽 出 液 に よ る 、 抗 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 抗 体(HP3/17)お よ び 抗 β-actin 抗 体 を 用 い た ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 解 析 を 示 し た 。

図 3 U V B 照 射 に 伴 う ヒ ト 皮 膚 に お け る 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 減 少 26 歳 、 非 露 光 部 （ 臀 部 ） 皮 膚 組 織 に よ る 抗 パ ー ル カ ン 抗 体 (MAB1948)（ a） 、 抗 ヘ パ ラ ン 硫 酸 抗 体 （JM403）（ c） 、 抗 ヘ パ ラ ン 硫 酸 抗 体 （ 3G10）（ e） を 用 い た 免 疫 染 色 結 果 を 示 し た 。 同 一 人 の 臀 部 に UVB を 照 射 48 時 間 後 の UVB 照 射 皮 膚 組 織 に よ る 抗 パ ー ル カ ン 抗 体(MAB1948)（ b） 、 抗 ヘ パ ラ ン 硫 酸 抗 体 (JM403)（ d） 、 抗 ヘ パ ラ ン 硫 酸 抗 体 (3G10)（ f） を 用 い た 免 疫 染 色 結 果 を 示 し た 。 非 露 光 部 皮 膚(a, e)と 比 較 し て 、 紫 外 線 照 射 皮 膚 (b, f)で は 、表 皮 基 底 膜 に お け る パ ー ル カ ン の コ ア タ ン パ ク 質(a, b)お よ び 3G10 抗 体 が 認 識 す る ヘ パ ラ ン 硫 酸 の n e o - e p i t o p e (e, f)に 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 一 方 、 JM403 抗 体 が 認 識 す る 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 は 、 非 露 光 部 皮 膚(c)に 比 べ て 、 紫 外 線 照 射 皮 膚 (d)に て 減 少 し て い た 。 バ ー は 、200 μ m を 示 す 。

図 4 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 減 少 に 伴 う サ イ ト カ イ ン の 結 合 低 下

26 歳 、 非 露 光 部 （ 臀 部 ） 皮 膚 組 織 を 用 い た In situ binding assay に よ る 内 在 性 ヘ パ ラ ン 硫 酸 へ の FGF-2 (a), VEGF-A (b), FGF-7 (c)の 結 合 量 を 評 価 し た 。 同 一 人 の 臀 部 に UVB を 照 射 48 時 間 後 の UVB 照 射 皮 膚 組 織 を 用 い て In situ binding assay に よ る 内 在 性 ヘ パ ラ ン 硫 酸 へ の FGF-2 (d), VEGF-A (e), FGF-7 (f)の 結 合 量 を 評 価 し た 。 バ ー は 、 200 μ m を 示 す 。

図 5 V E G F - A 透 過 性 実 験 (a)VEGF-A 透 過 実 験 の デ ザ イ ン 。イ ン サ ー ト 膜 に ヘ パ リ ン を 含 む 薄 い ゲ ル を 作 製 す る こ と で 、 ウ ェ ル 内 外 を 隔 て た 。(b)イ ン サ ー ト ウ ェ ル 内 に VEGF-A を 含 む 溶 液 を 加 え 、 ウ ェ ル 内 に 透 過 し た VEGF-A 量 を ELISA 法 に て 定 量 化 し た 。 擬 似 基 底 膜 に 含 ま れ る ヘ パ リ ン 量 が 多 い ほ ど 、透 過 し た VEGF-A 量 が 少 な い こ と を 示 す 。(c-h)血 管 新 生 キ ッ ト の CD31 免 疫 染 色 画 像 。ヘ パ リ ン を 含 ま な い 擬 似 基 底 膜 に 0μ g/mL (c)、10μ g/mL(d)、100μ g/mL(e) VEGF-A を 添 加 し た 場 合 。 ヘ パ リ ン を 含 む 擬 似 基 底 膜 に 0μ g/mL(f)、 10μ g/mL(g)、 100μ g/mL(h)、 VEGF-A を 添 加 し た 場 合 。 (i) 血 管 新 生 キ ッ ト 定 量 ソ フ ト ウ エ ア 「 Angiogenesis Image Analyzer」 に て 、 (c-h)画 像 中 の CD31 陽 性 の 面 積 を 算 出 し た 結 果 で 、 ヘ パ リ ン を 含 ま な い 擬 似 基 底 膜 で は 、VEGF-A が 透 過 し 、 血 管 新 生 を 誘 導 し た 。

1 . 4 考 察 こ の 章 で は 、紫 外 線 暴 露 に 伴 う 皮 膚 障 害 に お い て ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 活 性 化 、お よ び 表 皮 基 底 膜 の 機 能 変 化 が 起 こ る の か を 明 ら か に す る こ と を 目 的 に 検 討 を 行 っ た 。紫 外 線 照 射 に よ り 表 皮 角 化 細 胞 中 の ヘ パ ラ ナ ー ゼ 量 増 加 、 活 性 化 に 伴 い 、 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 減 少 が 示 唆 さ れ た 。 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 減 少 は 、 各 種 サ イ ト カ イ ン の 結 合 量 を 低 下 さ せ 、 さ ら に 、 V E G F - A の 透 過 性 を 亢 進 さ せ る こ と で 、 血 管 新 生 を 誘 導 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 こ れ ま で の 報 告 か ら 、 皮 膚 に て ヘ パ ラ ナ ー ゼ は 発 現 し て い る が 、 ど の 細 胞 が 主 た る 産 生 細 胞 で あ る の か は 明 ら か で な か っ た た め 、ヘ パ ラ ナ ー ゼ 産 生 細 胞 を 明 ら か に す る た め 、 組 織 免 疫 染 色 に て 解 析 し た 。 そ の 結 果 、表 皮 角 化 細 胞 に て ヘ パ ラ ナ ー ゼ が 存 在 し 、U V B 照 射 に よ っ て 表 皮 に お け る 発 現 量 が 増 加 し て い た 。そ し て 、U V B 照 射 に よ っ て 発 現 増 加 し た ヘ パ ラ ナ ー ゼ が 活 性 化 し て い る の か を 明 ら か に す る た め 、 5 0 m J / c m2 の U V B を 照 射 し て 2 時 間 後 の 表 皮 角 化 細 胞 の タ ン パ ク 質 抽 出 液 を 用 い た 、ヘ パ ラ ナ ー ゼ の ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 解 析 に て 検 討 し た と こ ろ 、 U V B 照 射 に よ っ て 5 0 k D a の バ ン ド を 検 出 し た 。 さ ら に 、構 築 し た ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 評 価 系 に て 、U V B 照 射 後 の 表 皮 角 化 細 胞 の タ ン パ ク 質 抽 出 液 に て 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 増 加 を 確 認 し た 。 ヘ パ ラ ナ ー ゼ は 、6 5 k D a の 前 駆 体 と し て 発 現 し 、 そ の 後 ラ イ ソ ゾ ー ム 内 に て カ テ プ シ ン L に て プ ロ セ シ ン グ を 受 け て 、 5 0 k D a と 8 k D a か ら な る ヘ テ ロ ダ イ マ ー の 活 性 型 に な る [ 5 9 ] 。 そ し て 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 化 に 関 与 す る カ テ プ シ ン L は 主 に 表 皮 に て 発 現 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る[ 6 0 ] 。 さ ら に 、 活 性 型 ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 分 泌 に は 、 P 2 Y レ セ プ タ ー の 活 性 化 を 介 し た ア デ ノ シ ン 、A D P 、 A T P 刺 激 に よ っ て 引 き 起 こ さ れ る こ と が 報 告 さ れ て い る が[ 5 9 ] 、 I n o u e ら は 、 U V B 照 射 後 の 表 皮 細 胞 に て A T P が 分 泌 さ れ る こ と を 明 ら か に し て い る [ 6 1 ] 。 こ れ ら の i n v i v o と i n v i t r o の 知 見 よ り 、 U V B 照 射 さ れ た 皮 膚 で は 、 表 皮 角 化 細 胞

に て ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 発 現 が 亢 進 し 、活 性 化 後 に 分 泌 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 本 章 で は 、 2 種 類 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 に 対 す る 抗 体 を 用 い て 紫 外 線 照 射 に よ る 皮 膚 組 織 中 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 変 化 を 検 討 し た 。 3 G 1 0 抗 体 は 、 ヘ パ リ チ ナ ー ゼ I / I I 処 理 に よ っ て 分 解 さ れ た ヘ パ ラ ン 硫 酸 鎖 末 端 の n e o - e p i t o p e（ 不 飽 和 ウ ロ ン 酸 ） を 認 識 し て い る こ と か ら 、 組 織 中 に 存 在 す る 全 て の ヘ パ ラ ン 硫 酸 プ ロ テ オ グ リ カ ン を 認 識 す る こ と で 知 ら れ て い る [ 6 2 ] 。 こ の こ と か ら 、 抗 ヘ パ ラ ン 硫 酸 抗 体 （ 3 G 1 0 ） お よ び 抗 パ ー ル カ ン 抗 体 を 用 い た 免 疫 染 色 の 結 果 か ら 、皮 膚 組 織 中 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 プ ロ テ オ グ リ カ ン は U V B 照 射 に よ っ て 影 響 を 受 け な い と 考 え ら れ る 。 し か し な が ら 、 表 皮 基 底 膜 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 を 認 識 す る J M 4 0 3 抗 体 を 用 い た 免 疫 染 色 の 結 果 で は 、U V B 照 射 に よ っ て 表 皮 基 底 膜 の ヘ パ ラ ン 硫 酸 が 著 し く 低 下 し て い た 。こ れ ら の 結 果 は 、U V B 照 射 に よ っ て 表 皮 基 底 膜 に 存 在 す る ヘ パ ラ ン 硫 酸 プ ロ テ オ グ リ カ ン で あ る パ ー ル カ ン の コ ア タ ン パ ク 質 は 変 化 せ ず に 、ヘ パ ラ ン 硫 酸 鎖 の み 特 異 的 に 減 少 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。こ れ ら ヘ パ ラ ン 硫 酸 に 関 す る 結 果 と 、ヘ パ ラ ン 硫 酸 を 特 異 的 に 分 解 す る ヘ パ ラ ナ ー ゼ の 結 果 は 良 く 一 致 し 、U V B 照 射 に よ っ て 表 皮 角 化 細 胞 中 で 活 性 化 し た ヘ パ ラ ナ ー ゼ が 表 皮 基 底 膜 に 存 在 す る パ ー ル カ ン の ヘ パ ラ ン 硫 酸 を 特 異 的 に 分 解 し た と 考 え る の は 妥 当 で あ る と 考 え ら れ た 。 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 鎖 は 、ヘ パ ラ ン 硫 酸 結 合 性 サ イ ト カ イ ン の リ ザ ー バ ー と し て 作 用 す る こ と で 表 皮 、真 皮 間 を 無 秩 序 に 拡 散 す る こ と を 防 い で い る が [ 8 , 9 ] 、 創 傷 治 癒 時 は 、 ヘ パ ラ ナ ー ゼ 活 性 化 に 伴 う 表 皮 基 底 膜 ヘ パ ラ ン 硫 酸 分 解 に 伴 い 、表 皮 基 底 膜 に 結 合 し て い る サ イ ト カ イ ン を 拡 散 さ せ 、 血 管 新 生 、 表 皮 細 胞 増 殖 を 誘 導 す る こ と で 、 治 癒 を 促 進 さ せ て い る[ 6 3 ] 。 血 管 新 生 を 誘 導 す る V E G F - A は 、 表 皮 角 化 細 胞 が 産 生 し 、真 皮 乳 頭 層 に 存 在 す る 毛 細 血 管 の 血 管 上 皮 細 胞 に 作 用 す る こ と が 知 ら れ て い る[ 6 4 ] 。 実 際 、 U V B 照 射 に 伴 う 血 管 新 生 は 、 表