◎原 著
JE−6B rotor（Beckman）による末梢血白血球分離の検討
周藤 眞康， 松原扶美恵，
門門 光， 谷崎 勝朗
荒木 洋行
岡山大学医学部三朝分院内科
要旨：JE−6B rotor（Beckman）を用いてcounterflow centrifugation elutriationに よる末梢血白血球の分離を試み，若干の検討を加えた。1，flow rateが低い場合はリンパ球 が大部分を占めたが，flow rateの増加とともに頻度は減少した。2． flow rateの増加とと
もに，好塩基球の頻度が増加し，9−10ml／minでは頻度のみでなく細胞数の増加も認められ た。各fractionにおけるヒスタミン含有量も同様の傾向が認められた。3．好中球のpeakは
flow rate13mi／minであり以後減少を示した。4．最終段階で好酸球が増加傾向を示し Cham ber内で最も高値を示した。以上の結果よりcounterflow centrifugation eiutri−
ationによる末梢血白血球細胞分離は， in vitroにおける実験に有用な手段である可能性が 示唆された。
キーワード：逆流負荷遠心法，JE−6Bローター，細胞分離，好塩基球
Counterflow gentrifugation elutriation， J E−6B rotor，Cel l sepa−
ration， Basophils
緒 言
末梢血白血球の細胞分離の方法はいろいろ行わ れているが1）一4），cell damageを起こ寸ことな
く，よりin vitroの実験に適した状態で細胞分 離をすることはなかなか困難である。著者らは，
JE−6B rotor（Beckman）を用いてcounter−
flow centrifugation elutriation（逆流負荷遠心 法）5） 7）による末梢血白血球分離を行い，若干の 検討を加えた。
対象ならびに方法
対象は健康人5例である。0．1M EDTA 2．5 ml 添加試験管に静脈IM 17，5ml採取し，採取後室温 に1時間放置したのち，500r．p．m．8分間遠心
しbuffy coatを作成した。 buffy coatをコック Bよりsample reservoirに注入したのち，
flow rate4．5ml／minでbufferを流しsample
をrotorに移した。 rotorからsampleが出始め るとその流出液を分取し（8分間），さらにコック AをCに切替10分間wash outし，以後細胞分離 を行った。方法はflow rateを1m1ずつ増加さ せそれぞれ4分間ずつ分取し，最終flow rate は15．Oml／minとした。なおsampleの温度は4
℃，回転数は2，000r．p．m．一定とした（図1）。
なおbufferはM／10Phosphate BufferにQ14M
NaC l， 2，0％（W／V）bovine serum albumin（B SA）とし最終pHは7．2，浸透圧は325 mOsm／kg
・H20に調整した5）。また細胞分類は末梢血好酸球 好塩基球直接算定用希釈液を用いて行った8）。各 fractionにおけるヒスタミン量は100℃，1時間
︐
煮沸後細胞内に含まれるものを含めた総ヒスタミ ン量として表わした。
結 果
CounterflQw centrifugation elutriationに
38 環境病態研報告 59，1988
P ressuer G auge
う
MoLor
S ample 1 njection V alve
Liquid to Rotor
B uffer
Liquid fron Rotor
Sample CollecLion Reservoir
F lask
図1．Counterflow Centrifugation E lutriationによる細胞分離
よる各fractionの細胞数の平均はflow rate 45ml／minすなわちwash out時に4．64×106 と最も多く，以後減少し，11，12，13，14ml／min でやや細胞数が多い傾向がみられた。またflow
rate 6．Om1／minからchamberまでの合計細胞数 の平均は11．53×106であり，buffy coatからの 回収率は60．6％であ6品目図2）。
Counterflow centrifugation elutriationに よる各fractionの細胞を検討すると，リンパ球で は低いflow rateでより頻度が高く以後flow
rateの増加とともに次第に低下していく傾向が みられた。好中球は低いflow rateでは低い値 を示しflow rate 10ml／min以後急速にpurity
CXto6＞
5．o
th
4．5 6．0 7．0 8．0 9．0 10．01f．Ot2．013．014．OTS．O C， M．C．
Flow rate （mt／min）
M．C，： Mixing chamber
C． ： chamber
が高くなり13ml／minをpeakとして以後次第に 低下していく傾向がみられた。また好酸球は低い flow rateでは出現せず， flow rate 12ml／min 以後急速に頻度が高値を示しchamber内でpeak を示した。一方好塩基球は末梢血中ではO．90±
0．52％であったが，flow rategml／minで11．80
±1．95％と最も高値を示し，以後次第に減少した
（図3）。
各fractionにおける好塩基球の頻度と細胞数
を検討すると，好塩基球はflow rate 4． 5ml ／min
すなわちwash out時に頻度は1．54％と高値を
｛％）
100
憾 50
r ；tXXOX．?D／／ff XNnX
A
好塩基球
岡＿一両グ
ム ロ
∠＼＼ン
←
4．5 6 7 8 9 10 Tl 12 13 14 15 C
flow rate （ml／min） C：Chamber
図2．各fractionにおける細胞数 図3．各fractionにおける細胞の頻度
示したが，細胞数は0．74×105と最も高値を示し た。以後細胞数は減少したが，flow rate・9．Oml／
minで再び高値を示し以後減少した。 flow rate 12．Oml／min以後は頻度，細胞数ともほとんど認 められなかった。またflow rate 6．Oml／minか
らChamberまでの合計好塩基球数の平均は1，51×
105であり，buffy coatからの好塩基球の回収 率は50．4％であった（図4）。
各fractionにおけるヒスタミン含有量を測定 すると，flow rate 4．5ml／minすなわちwash
out時に最も多く以後減少したが， flow rate 9．0−！0．Oml／minで好塩基球の頻度および細胞 数とも同様に再び多くなり12．Om1／min以後では
り ら ロ ロ ロコら り
頻度 〔％） 細胞数 〔×los）
Xi，．：Mi醜：㍑
減少している傾向がみられた（図5）。
以上の結果より我々はcounterflow centri−
fugation elutriationにより3つのfractionに 分離し実験を行っている。第1相はflow rate
4．5ml／min，第2相はflow rate 6． Oml／minよ り11．Oml／minまで，第3相はflow rate 12．Oml／
min以後とした。各fractionにおける主要細胞 の頻度は第！相ではリンパ球が大部分を占めてい るが，第2相ではリンパ球，好中球が大部分を占 め，また好塩基球が3．7％と他のfractionに比べ 高値を示した。第3相では好中球が大部分を占め，
好酸球が少数認められた（図6）。
％oo
50
％oo
50
％oo
50
LNEB LNEB LNEB
I I 皿
（Llリンパ球，N：好中球，El好酸球，Bl好塩基球）
図4．各fractionにおける好塩基球の頻度と細胞 数
十6，各fractionにおける細胞の出現頻度
考 案
（ng／mt）
100
畑
麗，。
J︶︐驚
熱
4．5 6．0 7．0 8．0 9．0 10．all．012．013．e14．015．0 C． M．C．
Flow rate （tatfmin）
cMD．c．@；・ Mixing cehhaamM：eel
図5．各fractionにおけるヒスタミン含有量
末梢血白血球を用いin vitroでの実験を行う 場合，細胞に対するdamageが大きな問題点とな
る。特に末梢血では好塩基球に対する影響が最も 大きいと思われる。好塩基球は1型アレルギー反 応において大きな役割を果たし種々の抗原に対し 化学伝達物質を遊離するといわれているが9）・10），
種々の機械的あるいは化学的刺激に対しても他の 細胞に比べ反応性が強く，cell damageを受け やすい11）。末梢血白血球を用いた実験はいろいろ 試みられているが，．これらの実験ではDextran i）一3），
Hypaqe−Fico114）が使用されており， in vitro での実験においてspontaneousな化学伝達物質 の遊離を起こしやすい可能性も否定はできない。
40 環境病態研報告 59，1988
著者らはJE−6B．rotor（Beckman）を用いて
。．ounterf工ow centrifugation elutriationによ る細胞分離を試みた。各fractionにおける細胞の 頻度はflow rateが低い場合はリンパ球が大部分 を占めたが，flow rateの増加とともに頻度は減 少し逆に好塩基球の頻度が増加した。しかも頻度 のみでなく細胞数の増加も認められ，各fraction におけるヒスタミン含有量も同様の傾向が認めら れた。さらにflow rateが増加すると好塩基球 は減少しはじめ，代り．に好中球が増加しはじめた。
好中球のpeakはflOw． rateは13ml／minであり 以後減少を示した。最終段階で好酸球は増加傾向 を示しchamber内で最も高値を示した。なお単 核球は末梢血中の血液細胞では大きい細胞である が，今回の検討では一定の傾向がみられなかった。
結 語
JE−6B rotor（Bec㎞an）を用いてcounter−
flow．；centrifugation elutriationによる細胞 分離を試みた結果，この分離方法がin vitroに おける実験に有用な．手段である可能性が示唆され
た。．
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Separation of Paripheral leukocytes by courTterflow cerrtr ifugation etutriation
Michiyasu Sudo，Fumie Matsubara， Hiroynki Araki， Hikaru Kitani and Yoshiro Tanizaki
Division of Medicine， Misasa Hospital，
Okayama University Medical Schooi
Separation of peripheral leukocytes was carried out 2n 5 healthy subjects
by counterflow centrifugation elutriatiOn with JEm6B rotor． 1． Number of lympho−
cytes was predominant at low flow rate
（4，5ml／min） of counterflow centrifugation elutriation． 2 As flow rate was increased
（9−10ml／min）， the purity and number of basophils， and histamine content in the
fraction were gradually increased． 3， The purity and number of neutrophils were gradnally increased， and the purity was
reached the peak at 13ml／min． 4． The purity and number．of eosjnophils were gradually increased at the late stage of
the centrifugation elutriation． The results obtained here might suggest that cell separation by counterflow centrifugation elutriatiofl is more useful for experi−
ments， especially allergy testing， in vitro，
