Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/
Title
マラッセの上皮遺残細胞によるiPS細胞の骨性細胞への分
化誘導の可能性について
Author(s)
直野, 公一; 中島, 啓; 國分, 克寿; 村上, 聡; 井上,
健児; 木田, 玲子; Tungalag, Ser-Od; Akram,
Al-Wahabi; 松坂, 賢一; 井上, 孝
Journal
歯科学報, 116(3): 232-232
URL
http://hdl.handle.net/10130/4040
Right
目的：現在，歯周炎の治療においては，十分な量の 歯槽骨の再生を含めた予知性の高い歯周組織再生が 課題となっている。iPS 細胞は，その増殖能と多分 化能から組織再生における移植細胞のソースとして の応用が期待されている。Runx 2 は骨芽細胞分化 に必須の転写因子であるが，iPS 細胞からの骨分化 過程における作用については未だ明らかにされてい ない点が多い。そこで今回，Runx 2 ホモ欠損マウ ス由来 iPS 細胞を作成し，骨芽細胞分化における Runx 2非依存的経路の解明を目的に研究を 行 っ た。 方法：Runx 2 ヘテロ欠損マウス（C５７BL/６）の交 配により得られた胎児より，マウス胚線維芽細胞 （MEF）を 作 成 後，Runx 2/ ，Runx 2+/ ，Runx 2+/+
の３群 に 分 け，Oct 3/4，Sox 2，Klf 4，c-Myc の４因子を導入し，マイトマイシン処理を行った MEF フィーダー細胞上に播種した。そして iPS 細 胞の形態を示すコロニーを選別し，培養することで 各群の iPS 細胞の作成を行った。未分化マーカーの 発現およびテラトーマの作成を行い，iPS 細胞の樹 立を確認した。各 iPS 細胞は骨芽細胞分化誘導培地 にて培養した後，２，３週でアルカリフォスファ ターゼ（ALP）染色，von Kossa 染色ならびに分化 マーカーの解析を行った。 結果および考察：作成した iPS 細胞様細胞は３群と もに未分 化 マ ー カ ー で あ る Oct 3/4，Nanog，Sox 2，Cripto，Dax 1，Ecat 1，Rex 1 の 発 現 を 認 め， テラトーマの作成では扁平上皮，腺上皮，骨様硬組 織といった三胚葉由来の組織を確認した。以上の結 果より，iPS 細胞樹立に成功した。また，各群とも に形態および増殖に明確な相違は認めなかった。骨 芽細胞分化誘導後２週，３週において３群ともに ALP 活性を認めた。Real-time PCR の結果から Alp の mRNA 量は２週と比較し３週では３群ともに有 意に上昇したが，各週での３群の有意差は認めな かった。これらの結果より，骨芽細胞分化の初期 においては Runx 2 非依存的な経路が存在すること が示唆された。現在，分化時期を代表する Alp や Bsp，Ocn の発現上昇時期において，マイクロアレ イを用いた網羅的解析による Runx 2 関連遺伝子群 の発現を解析している。 目的：歯根膜内に存在するマラッセの上皮遺残細胞 （ERM）は，歯根膜内に存在し，近年，過度の石 灰化抑制や歯根膜の幅の維持，セメント質の修復， 歯根吸収を防いでいるなど硬組織の恒常性に関与し ているとの報告がなされている。そこで ERM を フィーダー細胞として用い，近年，再生医療分野で 注目されている iPS 細胞の骨性細胞への分化の可能 性について検索を行った。 方法：フィーダー細胞としてブタ由来 ERM を用い た。ERM 細胞の増殖能を不活化する目的でマイト マイシン C 処理（MMC 群），細胞を化学固定する 目的でホルムアルデヒド処理（FA 群），そして未 処理（未処理群）の３群を比較検討した。理化学 研究所 バイオリソースセンターより得たマウス由 来 iPS 細胞（３×１０４cells/well）を各処理を行った ERM 上 に 播 種 し，３７℃，５％CO２下 で DMEM 培
地（１５％FBS，１mM ピル ビ ン 酸 ナ ト リ ウ ム，２ mML L-グルタミン，０．１mM 非必須アミノ酸，０．１ mM ２-メル カ プ ト エ タ ノ ー ル，１０００U/mL（LIF 添加））にて培養を行った。培養期間は６日と１０日 目とし，位相差顕微鏡による形態観察と骨分化マー カーとして Runx 2，骨シアロタンパク質（BSP）， オステオカルシン（OCN）の mRNA の発現レベル について Taqman 遺伝子発現 AssaysⓇ にて定量的 リアルタイム RT-PCR によって分析した。 結果および考察：iPS 細胞のコロニーの大きさは MMC 群，FA 群 で は 大 き く，未 処 理 群 で は 小 さ かった。コロニーの性状は MMC 群では扁平に広 がっていた。また，FA 群，未処理群では他群に比 べ，コロニー中心部で細胞の過増殖が生じていた。 Runx２，BSP の発現は MMC 群で経時的な増加が 認められた。OCN の発現は３群すべてにおいて経 時的な増加が見られ，１０日目では MMC 群が FA 群 よりも多く発現していた。以上のことから，MMC 処理された ERM は iPS 細胞の骨分化を誘導させる ことが示唆された。
