ヘッドスペース固相マイクロ抽出／ガスクロマトグラフィー
によるシアンの分析と剖検事例への応用
竹 川 健 一
1,2），木 戸 啓
1），大 矢 正 算
1） 1）山梨大学医学部法医学教室，2）山梨県警察本部科学捜査研究所 要 旨：固相マイクロ抽出（SPME）法により血液中からシアンを抽出し，ヘッドスペース−ガス クロマトグラフィー（GC）で分析する新たなシアンの分析法を開発し，剖検材料中のシアン分析 に応用して有効性を確認した。 バイアル瓶に血液 0.5 ml，シアン標準液 0.1 ml，内部標準（5 ppm アセトニトリル水溶液） 0.2 ml，無水硫酸ナトリウム 0.3 g および 50 ％リン酸 0.2 ml を加え，50°C で加温しながら 65µm Carbowax-Divinylbenzene ファイバーで 45 分間吸着したのち GC 注入口で 30 秒間熱脱離して GC 分 析を行った。検量線は良好な直線性（シアン濃度 0.04 ∼ 1.0µg/ml，r2＝ 0.998）を示し，検出限界 は 0.02µg/ml（CN−, SN ＝ 3），回収率は 3.02 ∼ 4.06 ％であり RSD は 6.8 ％以下であった。シアン ピークの日内および経日内変動の RSD は，7.1 ％以下と 9.2 ％以下であった。シアン添加実験での 本法と吸光光度法の測定値は一致（r2＝ 0.999）した。シアン投与ラットの血中濃度測定でも両法 の測定値はほぼ一致した。 シアン中毒死と疑われる男女の剖検試料中シアンを GC-MS 法で確認し，本法と吸光光度法で定 量分析を行った。男女の血中シアン濃度は致死レベル（3 ∼ 5µg/ml）以上を示し，胃内容中濃度 はより高濃度を示したことからシアン化合物の服用によるシアン中毒死と判定された。両法の測定 値はほぼ一致（r2＝ 0.994）し，本法は実務において利用価値が高いことが証明された。 キーワード シアン，固相マイクロ抽出，ヘッドスペースサンプリング，ガスクロマトグラフィー， シアン中毒死 はじめに シアンは生体内酵素系とくにチトクロムオキ シダーゼ呼吸酵素系の活性を強く阻害して細胞 内窒息を起こし死に至らしめる最も即効性のあ る毒物である1,2）。シアン化合物は｢毒物及び劇 物取締法｣で毒物に指定され取り扱いは法規制 がなされているが，自他殺や企業恐喝などの凶 悪犯罪にしばしば用いられている。また，新建 材の燃焼時に発生するシアン化水素が焼死の一 因になり得ると指摘されており3–5），血中の一 酸化炭素ヘモグロビン飽和度とともに血中シア ン濃度の測定が要求されている。 従来，法医学および裁判化学分野におけるシ アンの分析は拡散法によるピリジン・ピラゾロ ン吸光光度法1,6）が用いられてきた。その後ガ スクロマトグラフィー（GC）がとり入れられ， クロル化7），ペンタフルオロベンジルブロマイ ド 誘 導 体8 ）と し た の ち 電 子 捕 獲 型 検 出 器 （ECD）で検出する方法，アセトニトリル9）お よびベンゾニトリル10）に変換後窒素・リン検 〒 409-3898 山梨県中巨摩郡玉穂町下河東 1110 受付： 2003 年 8 月 28 日 受理： 2003 年 9 月 12 日原 著
出器（NPD）で検出する方法などが報告され ている。しかし，これらは誘導体化などの煩雑 な前処理や装置の改造が必要であり，実用性に 乏しい。 近年，NPD 検出器を用いたヘッドスペー ス−ガスクロマトグラフィー（HS-GC）が考案 され4,11–13），特別な装置や誘導体化せずに直接 シアンを分析することが可能となった。 一方，有機溶剤を使用しない環境に優しい新 たな抽出法として固相マイクロ抽出（Solid-Phase Microextraction ＝ SPME）法が開発され
た14）。当初は主に揮発性水中汚染物質の分析 に応用されていたが，最近はより複雑なマトリ ックスを持つ各種生体試料中の覚せい剤，コカ イン，ガソリン，シンナー，農薬，医薬品など の薬物分析15）に応用され，さらに SPME 法と 高速液体クロマトグラフィー質量分析を結合さ せた自動分析法16）が報告されている。 わ れ わ れ は H S - G C に 固 相 マ イ ク ロ 抽 出 （SPME）法を組み合わせ，高感度で簡便なシ ア ン の 分 析 法 を 開 発 し た 。 そ し て ， H S -SPME/GC 法を用いてシアン化ナトリウム服用 による男女死体の剖検材料からシアン分析を試 み，本法の有効性を確認した。 実験材料および実験方法 Ⅰ．試薬 シアン化カリウム，リン酸，水酸化ナトリウ ム，p −ジメチルアミノベンジリデンロダニン， クロラミン T は和光純薬社製の試薬特級を， シアノリンブルー（モノピラゾロン：ビスピラ ゾロン＝ 12.5 ： 1，W/W）は同仁化学社製を， 0.1 M 硝酸銀溶液は和光純薬社製の容量分析用 を，アセトニトリルは関東化学社製の高速液体 クロマトグラフ用を使用した。シアン標準液は シアン化カリウム水溶液（CN−1 mg/ml ）を 0.1 M 硝酸銀溶液で標定したのち，0.1 ％水酸 化ナトリウム溶液で希釈して用いた。内部標準 （IS）は 5ppm アセトニトリル水溶液を用いた。 Ⅱ．血液 ボランティアから同意を得て全血を採取し試 料を作成した。 Ⅲ．器具および装置 アルミブロックヒータはピアス社製スターラ ー付リアクティーサーモを，SPME 装置はスペ ルコジャパン社製 65µm Carbowax-Divinylben-zene ファイバーアッセンブリーおよび手動用 ホルダーを，NPD 検出器付 GC 装置は Hewlett Packard 5890A を，データ処理装置は Hewlett Packard 3396A を使用した。コンウェイセルは 柴田科学社製の標準型を用いた。 Ⅳ．HS-SPME/GC 法 試料の作成は篠原ら12）の方法を一部改良し て行った。あらかじめフリーザー内で冷やした 7 ml 容量のバイアル瓶（スペルコジャパン社 製）を氷冷しながらこれに血液 0.5 ml，内部標 準（IS ： 5 ppm アセトニトリル水溶液）0.2 ml， シアン標準液（CN− 0.2 ∼ 30µg/ml ）0.1 ml ， 無水硫酸ナトリウム 0.3 g，50 ％リン酸 0.2 ml を加え全量を 1 ml とし，速やかにテフロン・ シリコンセプタム付きスクリューキャップ（ス ペルコジャパン社製）で密栓した。これを約 30 秒間振り混ぜたのちスタラーバーでかくは んしながら 50°C のアルミブロックヒータ上で 45 分間加温した。SPME ファイバーは手動用ホ ルダーを用いて加温と同時にバイアル内に突き 刺し，液相部を露出して 45 分間吸着させた直 後に GC 分析を実施した。なお，実試料の分析 においてはシアン標準液 0.1 ml の代わりに蒸 留水 0.1 ml を添加して全量を 1 ml とした。 Ⅴ．ガスクロマトグラフィー（GC）条件 カラム：スペルコジャパン社製 Supel-Q Plot （0.32 mm i.d × 30 m），カラム温度： 45°C（2 min）∼ 130°C（10°C/min），注入口温度： 150°C，検出器温度： 220°C，検出器： NPD 検 出 器 ， キ ャ リ ア ー ガ ス ： ヘ リ ウ ム ， 流 速 ： 1 ml /min（45°C，ヘッド圧 40 kps），注入モ ード：スプリットレス。 Ⅵ．吸光光度法 薬毒物化学試験法1）に従って行った。コン
ウェイセルの内室に 0.1 N 水酸化ナトリウム溶 液 2.0 ml，外室に血液試料 1.0 ml を入れ，さら に 10 ％硫酸 0.5 ml を速やかに外室に注入した のちただちにグリセリンを塗布した蓋で密封 し，静かに揺り動かして硫酸と血液を十分に混 合した。室温で 2 時間放置後，内室のアルカリ 溶 液 1.0 ml を試験管にとり，氷冷しながら 0.0625 ％クロラミン T 含有の 0.75 M リン酸一 ナトリウム溶液 0.2 ml を加え，2 分後にピリジ ン・ピラゾロン試薬（シアノンリンブルー 0.25 g をピリジン 20 ml に溶解し，水を 100 ml 加え る）3 ml を加え混和して室温で 40 分放置後， 波長 630 nm における吸光度を測定した。 Ⅶ．実験動物 体重 175 ∼ 195 g のウィスター系ラット 8 週 齢オス 5 匹を用いた。動物実験は山梨大学動物 実験委員会の承認を得て行った。 実験結果 Ⅰ．ガスクロマトグラム 本法で用いた GC 条件でのガスクロマトグラ ムを図 1 に示す。シアンピークは保持時間（Rt） 4.1 分に，アセトニトリルピークは Rt 9.2 分に 出現し，妨害ピークの影響は認められなかった。 シアンピークの形状はシアン化カリウムの酢酸 エチル溶液を直接注入して得たピークに比べ若 干の広がりが認められた。 Ⅱ．SPME ファイバー 極性の異なる 4 種類のファイバー（100µm Polydimethylsiloxane，85µm Polyacrylate，65µm Polydimethylsiloxane-Divinylbenzene，65µm Carbowax-Divinylbenzene）について検出され るシアンピーク面積を比較した。65µm Car-bowax-Divinylbenzene ファイバーの与える面積 に 対 し 100µm Polydimethylsiloxane フ ァ イ バ ー は 47 ％ ， 85µm Polyacrylate フ ァ イ バ ー は 25 ％の面積を与えたが，65µm Polydimethyl-図 1． シアン（HCN）とアセトニトリル（CH3CN）の HS-SPME / GC ガスクロ マトグラム． 左図：シアン（CN− 2 ng）とアセトニトリル（1.57 ng）標準溶液のガスク ロマトグラム，右図：シアン（CN−）濃度 0.4µg/ml と 0.04µg/ml の血液 （アセトニトリル 0.78µg を含む）および無添加血液（blank）のガスクロマ トグラム
siloxane-Divinylbenzene ファイバーは痕跡程度 のピークを与えるにすぎなかった。したがって， 本法では 65µm Carbowax-Divinylbenzene ファ イバーを使用した。 Ⅲ．加温温度 シアンおよび IS を添加した血液 0.5 ml の， 加温温度 30，40，50，60°C におけるシアンお よび IS ピーク面積を測定した。シアンおよび IS ピーク面積は温度上昇とともに増加したが， いずれも 60°C では 50°C のときに比べわずかに 増加しているのみであった。60°C では他の温 度に比べピーク面積値にばらつきが大きく， 60°C 以上の加温では蛋白成分の変性は起こり 易くなり液相の不均一化およびアーティファク トの生成が懸念されることなどを考慮して加温 温度を 50°C に設定した。 Ⅳ．吸着時間 シアンおよび IS を添加した血液 0.5 ml を 50°C で加温し，吸着時間 15，30，45，60 分で シアンおよび IS ピーク面積を測定した結果を 図 2 に示す。バイアル内を平衡化したのちフイ バーで吸着を行うと分析時間が長く迅速性に欠 け，平衡化し圧力が高まっているバイアル内に ファイバーを挿入すると内部のガス漏れにつな がるので，ファイバーを挿入し吸着を開始する のは加温と同時に行った。IS 面積は 15 分以上 で平衡となり，シアンピーク面積は吸着時間と ともに増加するが 45 分以上で平衡となった。 さらに，シアン／ IS のピーク面積比は 45 分で 平衡に達するので吸着時間は 45 分とした。 Ⅴ．熱脱離時間 シアンおよび IS を添加した血液 0.5 ml を 50°C で加温しながらファイバーで 45 分吸着し たのち GC 注入口での熱脱離時間 10，20，30， 50，80 秒におけるシアンと IS ピーク面積を測 定した。IS ピーク面積は 10 秒から 80 秒の間で はわずかに増加するのみであった。したがって， IS は瞬時に熱脱離するものと考えられた。シ アンピーク面積は熱脱離時間が長くなるにした がって増加したが，30 秒の熱脱離でシアンの 大部分が熱脱離しているものと認められた。50 秒以上ではピークのテーリングが大きくブロー ドなピークとなりシャープさに欠けた。この傾 向は熱脱離時間が長いほど強くなり，ピーク割 図 2． シアン（HCN）およびアセトニトリル（CH3CN）ピーク面積と 吸着時間． ―■―： HCN 面積，―▲―： CH3CN 面積， ―○―： HCN/CH3CN 面積比
れを起こし，測定値のばらつきも大きくなった。 ピークは熱脱離時間が短くなるにしたがってシ ャープになったが，ピークの形状とピーク面積 を考慮して熱脱離時間を 30 秒とした。 Ⅵ．塩析効果 シアンおよび IS を添加した血液 0.5 ml に塩 化ナトリウムあるいは無水硫酸ナトリウムをそ れぞれ 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g 加えてシアン および IS ピーク面積を測定した結果を図 3 に 示す。シアンピーク面積は塩化ナトリウムおよ び無水硫酸ナトリウムともに 0.3 g 以上の添加 でほぼ一定となり，IS ピーク面積は塩化ナト リウムで 0.1 g 以上，無水硫酸ナトリウムでは 0.2 g 以上の添加でほぼ一定となった。無水硫 酸ナトリウム添加群は塩化ナトリウム添加群よ りも常にシアンおよび IS ピーク面積の増加が 認められた。したがって，塩析剤は無水硫酸ナ トリウムを 0.3 g 添加することとした。 Ⅶ．回収率 血 液 0.5 ml に シ ア ン （ CN−） 0.2， 1.0， 3.0µg および IS を添加して SPME ファイバー で抽出して得たシアンならびに IS 面積とシア ン化カリウムおよび IS を溶解した酢酸エチル 溶液を直接 GC に注入（CN−2 ng，IS 1.57 ng） して得られたピーク面積を比較して，SPME フ ァイバーでの回収率および相対標準偏差を求め た結果を表 1 に示す（n ＝ 6）。各濃度における シアンの回収率は 4.06，3.49，3.02 ％であり， 相対標準偏差は 6.8，6.3，5.1 ％であった。ま た，IS の回収率は 0.21 ％，相対標準偏差は 7.1 ％であった。 Ⅷ．再現性 血 液 0.5 ml に シ ア ン （ CN−） 0.2， 0.5， 1.0µg を添加し，シアンピーク面積の日内変動 および 6 日間における経日内変動を測定した （n ＝ 6）。各濃度における日内変動の相対標準 偏差は 7.1，5.7，5.3 ％，経日内変動の相対標 準偏差は 9.2，6.2，5.8 ％といずれも良好な結 果が得られた。 Ⅸ．検量線 血中シアン（CN−）濃度 0.04 ∼ 1.0µg/ml に お い て 内 部 標 準 法 に よ り 検 量 線 を 作 成 し た （n ＝ 6）。検量線は良好な直線性を示し，回帰 式は Y ＝ 7.64X ＋ 0.247，相関係数 r2＝ 0.998 図 3． シアン（HCN）およびアセトニトリル（CH3CN）ピーク面積と塩析効果． ―■―： HCN 面積（Na2SO4添加），―□―： HCN 面積（NaCl 添加） ―▲―： CH3CN 面積（Na2SO4添加），―△―： CH3CN 面積（NaCl 添加）
であった。なお，シアン（CN−）の検出限界 はおよそ 0.02µg/ml（SN ＝ 3）であった。 Ⅹ．吸光光度法との対比 血中シアン（CN−）濃度 0.1，0.2，0.5，0.8， 1.0µg/ml の標準試料を調製し，各試料のシア ン濃度を HS-SPME/GC 法および拡散法による ピリジン・ピラゾロン法により定量した値を比 較 し た 。 ピ リ ジ ン ・ ピ ラ ゾ ロ ン 法 で は 血 液 1 ml を使用して定量を行い，HS-SPME/GC 法 では血液 0.5 ml を用いて得た値を 2 倍して定量 値とし，それぞれの平均値（n ＝ 5）を図 4 に 示す。両法の測定値は良く一致し，回帰式は Y ＝ 0.833X ＋ 0.015，相関係数 r2＝ 0.999 であ った。なお，両法の検量線はシアン標準液を用 いて血液試料とそれぞれ同じ操作を行って作成 した。 ⅩⅠ．ラットへの投与実験 ネンブタール （ペントバルビタール）で軽 度に麻酔したオスの 8 週齢ウィスター系ラット 1 匹（体重 175 g）には生理食塩水を，4 匹（体 重 181 ∼ 195 g）にはシアン化カリウム 0.25， 0.5，1.0，2.0 mg をそれぞれ腹腔内に投与した。 20 分後開胸して注射器で心臓血を採取し，ヘ パリンナトリウムで凝固防止を行った。HS-SPME/GC 法および拡散法によるピリジン・ピ ラゾロン法により血中シアン濃度を測定した結 果を表 2 に示す。両法による測定値はおおむね 一致していたが，HS-SPME/GC 法は吸光光度 図 4． HS-SPME/GC 法とコンウェイセルを用いた吸光光度法によるシ アン濃度の相関． 表 1．HS-SPME / GC 法による血中シアンとアセトニトリルの回収率 化合物 添加量 回収率± SD 相対標準偏差 （µg） （％） （％） シアン 0.2 4.06 ± 0.276 6.8 1.0 3.49 ± 0.221 6.3 3.0 3.02 ± 0.162 5.1 アセトニトリル 0.78 0.21 ± 0.015 7.1 SD ：標準偏差 HS-SPME 法（µg/ml ） 吸光光度法（ CN µ g/m l ）
法より若干高い値を示した。 剖検事例への応用 Ⅰ．事件概要 積雪が残る 3 月，山梨県内の林道にドアがロ ックされて停車中の乗用車内で男女の死体が発 見された。運転席側ドアの取手部にティシュペ ーパーに包まれた白色粉末入カプセルが発見さ れ，山梨県警察本部科学捜査研究所で分析した ところ，約 0.8 g のシアン化ナトリウムである と同定された。そのためこの男女は自殺関与の 疑いで翌々日山梨大学医学部法医学教室におい て司法解剖された。 Ⅱ．主要解剖所見 A．男性死体 死斑は鮮紅色で腹部，背面，左右前腕に強く 発現し，指圧では消えない。左右上眼瞼に溢血 点が少数認められ，左右肺はうっ血と浮腫を示 している。胃内には赤褐色流動物を 300 ml 入 れ，幽門付近の胃粘膜後面に 5 × 4 cm の暗紫 赤色腐食性びらんが認められる（図 5）。胃内 容物上でシアンの予備試験であるシェーンバイ ン−パーゲンステッヘル反応を試みたところ， 陽性であった。心内血中，尿中のエチルアルコ ールおよび心内血中の一酸化ヘモグロビンは検 出されなかった。 B．女性死体 死斑は鮮紅色で胸腹部，背面，左右前腕に強 く発現し，指圧では消えない。左右肺はうっ血 浮腫が強い。咽喉頭から気管気管支内にかけて 透明泡沫粘液を多量に入れる。胃内に赤褐色流 動物を 200 ml 入れる。胃内容物上でシェーン バイン−パーゲンステッヘル反応を試みたとこ ろ，弱陽性であった。胃底の粘膜に 5 × 3 cm の暗紫赤色腐食性びらんが認められる（図 5）。 子宮体右側に大きさ 7 × 9 cm 大，重さ 250 g の 硬い筋腫を付着する。心内血中，尿中のエチル アルコールおよび心内血中の一酸化ヘモグロビ ンは検出されなかった。 Ⅲ．剖検材料中のシアンの定量 男女死体は，解剖所見および胃内容物上での シアン予備試験結果からシアン化合物を服用し た可能性が高いと判明したので，男女の剖検材 料中のシアン濃度を HS-SPME/GC 法と拡散法 によるピリジン・ピラゾロン法により測定した 値を比較した。さらに，ガスクロマトグラフィ ー質量分析（GC-MS）法を用いてシアン化水 素の確認を併せて行った。 A．HS-SPME/GC 法 心内血液，尿，胃内容は蒸留水で適宜希釈し た液の 0.5 ml を，各臓器は同量の 0.1 N 水酸化 カリウム溶液を加え氷冷下ホモジナイズし，そ の 0.5 g をそれぞれ 7 ml 容量のバイアル瓶に取 ったのち，前述の実験方法と同様にして分析し た。 B．吸光光度法 試料は希釈した血液，尿，胃内容 1.0 ml，ホ モジナイズした各臓器 1 g を使用し，10 ％硫酸 に換えて 50 ％リン酸 0.5 ml を用いて前述の実 験方法と同様に測定した。 C．ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）法 HS-SPME 法でサンプリングした試料につい 表 2．ラット腹腔内シアン化カリウム投与後の HS-SPME / GC 法と吸光光度法による血中シアン濃度 ラット 体重 投与量 シアン濃度 （CN −µg/ml ） （g） （KCN mg） HS-SPME/GC 法 吸光光度法 1 181 0.25 2.5 2.1 2 183 0.5 4.6 4.2 3 190 1.0 6.9 6.8 4 195 2.0 13.0 12.2 5 175 生理食塩水 不検出 不検出
図 5． 胃粘膜の腐食性びらん． 上図：男性死体，下図：女性死体
て電子イオン化法による GC-MS 分析を行った。 装 置 ： 島 津 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ 質 量 分 析 計 QP5050A， カ ラ ム ： ス ペ ル コ ジ ャ パ ン 社 製 Supel-Q Plot（0.32 mm i.d × 30 m），カラム温 度： 40°C（5 min）∼ 200°C（15°C/min），注入 口 温 度 ： 150°C， イ ン タ ー フ ェ イ ス 温 度 ： 220°C，イオン化法：電子イオン化，キャリア ーガス：ヘリウム，流速： 1.3 ml/min（40°C）， 注入モード：スプリットレス。 Ⅳ．測定結果 HS-SPME/GC 法および吸光光度法で測定し た男女の剖検材料中のシアン濃度を表 3 に示 す。男性では肺が最も高く，次いで脾臓，胃内 容，心内血液の順で検出された。女性では脾臓 と胃内容と心内血液が高値を示し，次が肺と胃 であった。本 2 例の定量結果は男女間で大きな 差が認められたが，各臓器へのシアンの分布状 況は類似した傾向を示した。男女ともこれら剖 検材料における HS-SPME/GC 法と吸光光度法 表 3．HS-SPME/GC 法と吸光光度法による剖検材料中のシアン（CN−）濃度 剖検材料 男 女 HS-SPME/GC 吸光光度法 HS-SPME/GC 吸光光度法 心内血 14.7µg/ml 12.5µg/ml 4.5µg/ml 4.1µg/ml 尿 0.5µg/ml 0.2µg/ml 0.2µg/ml 0.1µg/ml 胃内容 24.3µg/ml 23.2µg/ml 4.6µg/ml 6.2µg/ml 脳 0.4µg/g 0.4µg/g 0.1µg/g 0.1µg/g 心 0.6µg/g 0.9µg/g 0.2µg/g 0.4µg/g 肺 37.0µg/g 33.8µg/g 2.4µg/g 2.9µg/g 肝 1.8µg/g 1.1µg/g 0.2µg/g 0.1µg/g 胃 7.9µg/g 8.4µg/g 2.0µg/g 2.1µg/g 脾 25.1µg/g 24.3µg/g 4.7µg/g 5.7µg/g 膵 5.2µg/g 4.5µg/g 0.5µg/g 0.3µg/g 腎 0.4µg/g 0.4µg/g 0.1µg/g 0.1µg/g 図 6． HS-SPME / GC 法と吸光光度法による剖検材料中シアン濃度 の相関． HS-SPME/GC（CN−µg/ml 又は g） 吸光光度法 （ CN −µ g/m l 又は g ）
の定量値はほぼ同様であり，図 6 に示す良好な 相関関係が認められ相関係数は r2＝ 0.994 であ った。 HS-SPME/GC 法で検出された剖検資料中の シアンピークを HS-SPME/GC-MS 法でマスス ペクトルを測定したところ，いずれも分子イオ ン M＋ 27 がベースピークとなるシアン化水素 のマススペクトルと一致した。その一例を図 7 に示す。 考 察 これまで，HS-GC 法によるシアンの分離に はポーラスポリマー系液相のパックドカラムも しくはフューズドシリカキャピラリーカラムが 用いられてきた4,11–13）。 しかし，近年はカラムの分離効率，感度およ び再現性に優れたフューズドシリカキャピラリ ーカラムが主流となっている。Seto ら13）はワ イドボアフューズドシリカキャピラリーカラム GS-Q（0.53 mm i.d.× 30 m）を使用してシアン の分析を行っており，本研究においても同じ GS-Q カラムを用いて分析を試みたが，低濃度 領域においてシアンピークにテーリングが強く 生じた。そこでカラム内径が細く同様の固定相 を持つ Supel-Q PLOT フューズドシリカキャピ ラリーカラム（0.32 mm i.d.× 30 m）を使用し て分析を行ったところ，Supel-Q PLOT は低濃 度領域においてもバックグランドレベルは低 く，シアンおよび内部標準ピークはシャープに 図 7． 剖検材料 （女性死体心内血液）のガスクロマトグラムとマススペクトル． A 図： HS-SPME / GC 法によるシアン（HCN）とアセトニトリル（CH3CN）のガスクロマト グラム，B 図： HS-SPME / GC-MS 法によるシアンピークのマススペクトル
出現した。 ワイドボアキャピラリーカラムにおいてもス プリットレス注入法では試料注入量に限界があ り，過量の試料ガスはセプタムパージベントか ら漏出し，そのため定量性と検出感度が低下し た。Seto ら13,17）は注入量が 200µl を越えると ピーク面積と注入量の相関がくずれ，500µl の 注入ではシアン化水素で 17 ％，アセトニトリ ルで 23 ％のガスの損失を認めている13）。しか し，HS-SPME/GC 法ではヘッドスペースガス を注入せずガス中の成分のみを注入する手法で あるのでこのような問題は発生せず，SPME フ ァイバーの液相への濃縮効果のため 65µm Car-bowax-Divinylbenzene ファイバーでの回収率が 3 ∼ 4 ％と低レベルにも関わらず検出感度は上 昇したものと考えられる。さらに，より内径の 細いカラムを使用することにより高分解能を得 ることができた。 NPD 検出器を用いた HS-SPME/GC 法の内部 標準物質としてのアセトニトリルは，シアンと は添加剤の影響やヘッドスペース液相の性状の 違いにより気相／液相間での分配に差違が認め られると Seto13,17）らが指摘している。本法で は適当な低沸点化合物が見つからないので内部 標準物質にアセトニトリルを用いたが，HS-SPME/GC 法による血中シアンの分析は，血液 への添加実験，動物実験および剖検例において も拡散法によるピリジン・ピラゾロン法と良好 な相関が認められた。 剖検事例において，男女は死体解剖所見から シアン化合物を服用したと認められるが，HS-S P M E / G C 法 に よ り 胃 内 容 か ら 男 性 で 24.3µg/ml，女性で 4.6µg/ml と男性の血中濃 度 14.7µg/ml，女性の血中濃度 4.5µg/ml を越 えるシアンが検出され，シアン化合物の服用が 裏付けられた。 シアンの血中の致死濃度（CN−µg/ml 又は g） については明確な値は示されていないが，過去 の文献値3,18-20）から 3 ∼ 5µg/ml 以上が血中致 死濃度と考えられている。本剖検死体の心内血 中のシアン濃度は，HS-SPME/GC 法では男 14.7µg/ml と女 4.5µg/ml，吸光光度法では男 12.5µg/ml と女 4.1µg/ml であった。いずれも 致死レベルと同等かそれ以上を示すものであ り，死因はシアン中毒によるものと認められ た。 剖検材料では腐敗によりアミン類や硫化物が 発生し，シアン分析に影響を及ぼすおそれがあ る。そのため本件では剖検材料中のシアンピー クを GC-MS 分析し，シアン化水素のマススペ クトルを確認した。HS-SPME 法は GC-MS 法と の結合によりシアン化水素の質量測定が可能と なり，吸光光度法では不可能であるシアン化水 素の同定が可能となるので，吸光光度法では回 避不可能な古い死体材料からの腐敗アミンや硫 化物などの影響21）を回避できる。よって，日 常複雑なマトリックスを持つ試料を取り扱う法 医学および裁判化学分野においては最も重要な 分析手法の一つであると考えられる。 臓器組織中のシアン濃度の測定に関してはこ れまでほとんど報告がみられない。われわれが かつて当教室でシアンガス吸入による中毒死体 を解剖したさい吸光光度法によるシアンの臓器 内分布を調べたところ，血液と肺に高濃度つい で脾に多く，胃や胃内容からはごく微量しか検 出されなかった22）。今回の事件における男女 はシアン化合物を服用したものでシアンガスを 吸入したものでないにもかかわらず肺と脾に胃 を上回る濃度のシアンが検出されている。した がって，肺に高濃度のシアンが検出されたから といってガスを吸入したことにはならないこと になる。シアン中毒の場合肺のうっ血が強くシ アンを含む血量は多い。脾も比較的に血量に富 む臓器であるので，高濃度を示すのは血中濃度 の影響が大であると考えられる。しかし，血中 濃度より高い値を示すのは血液量だけでは説明 できず，胃内で発生したシアンガスの拡散など の影響が考えられるが，原因については不明で ある。 シアン中毒死は科学警察研究所の統計23）お よび東京監察医務院の統計24）によると昭和 26 年の新｢毒物及び劇物取締法｣の施行およびその
後の法改正により，昭和 30 年ころをピークに 以後は激減している。しかし，これとは逆に毒 物検査としてのシアン検査件数は｢昭和 59 年 グリコ森永事件｣の発生などの影響により昭和 60 年以降年間 1349 ∼ 2400 件以上と激増してい る。シアンの検査方法は昭和年代では比色法が 主であったが，平成に入ると検査のほとんどが ガスクロマトグラフィーで行われ，簡便で精度 の高い分析法へと変遷してきている。したがっ て，われわれが開発した HS-SPME/GC 法は検 査方法の進歩に対応し，さらに GC によるシア ンの検査法を前進させるものと確信する。 結 論 固相マイクロ抽出（Solid-Phase Microextrac-tion ＝ SPME）法を用いた血中シアンの新しい 分析法であるヘッドスペース固相マイクロ抽 出／ガスクロマトグラフ（HS-SPME/GC）法 をシアン化カリウムの血液添加およびラットへ の投与実験さらにシアン化ナトリウム服毒自殺 2 例におけるシアンの分析に応用し，従来法で ある拡散法によるピリジン・ピラゾロン法と比 較検討したところ，以下の結論が得られた。 Ⅰ．HS-SPME/GC 法によるシアンの分析は血 液添加実験での再現性と回収率が良好で，検 量線は相関係数 r2＝ 0.998 の直線性を示し， 検出限界は CN−としておよそ 0.02µg/ml （SN 比＝ 3）と高感度である。 Ⅱ．HS-SPME/GC 法と従来法である拡散法に よるピリジン・ピラゾロン法を比較検討の結 果 ， 両 者 の 相 関 係 数 は 血 液 添 加 実 験 で は r2＝ 0.999，剖検材料では r2＝ 0.994 を与え， 非常に良好な相関を有する。 Ⅲ．HS-SPME/GC 法はヘッドスペースガスの 注入を必要とせず，口径の細いカラムが使用 可能で高分解能を期待できる。本法は有機溶 剤を使用しない抽出法であるので環境に優 れ，簡便，迅速，高感度にシアン分析が可能 であり法医実務において利用価値が高い。 Ⅳ．HS-SPME 法は GC-MS 法と結合することに よりシアンの定量のみならず質量測定により 同定が可能となり，法医解剖死体からのシア ン分析ならびにシアン中毒死の決定にきわめ て有効である。2 例のシアン中毒死例におけ る体液および臓器内分布データはシアン中毒 死に関する重要な基礎資料になりうる。 文 献 1） 日本薬学会編：薬毒物化学試験法と注解，シア ン 化 合 物 試 験 法 ． 南 山 堂 ， 東 京 ： 第 4 版 ， 75–83，1992． 2） 日本薬学会編：衛生試験法・注解，一般試験法 シアン化合物．金原出版，東京： 91–94，1995． 3） Anderson R A, Harland W A: Fire Deaths in
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