浮遊培養 に よるニ ワ トリ胚
網膜 色素上 皮細胞 か らの水 晶体様構 造 の形 成
岡 山 大 学 医 学 部 眼 科 学 教 室(指 導:松 尾 信 彦 教 授) 筒 井 康 子 (平 成8年11月6日 受 稿) Key words:浮 遊 培 養,網 膜 色 素 上 皮 細 胞,分 化 転 換,水 晶体 様 構 造, bFGF 緒 言 網 膜 色 素 上 皮 細 胞 を長 期 間(約60∼180日 間) 付 着 培 養 す る と小 水 晶 体 様 胞(lentoid body)が 出現 す る1)こ とは 古 くか ら知 られ,こ の 現 象 は分 化 の 転 換 と呼 ば れ て い る.近 年 で は,ニ ワ ト リ 胚 の 網 膜 を切 除 し塩 基 性 線 維 芽 細 胞 増 殖 因 子 (basic fibroblast growth factor,以 下bFGF)を 添 加 す る と,in vivoに お い て網 膜 色 素 上 皮 か ら神 経 網 膜 の 再 生 が 誘 導 さ れ る こ と2)が報 告 され て い る.ま たin vitroに お い て も シ ー ト状 の 網 膜 色 素 上 皮 を震 盪 培 養 す る と,bFGF存 在 下 で神 経網 膜 が 形 成 さ れ る こ とが 報 告 され て い る3).こ の よ うな分 化 転 換 が お こ る 条 件 と して,種 々 の 細 胞 外 基 質 や 基 底 膜 の 物 理 的 性 状,細 胞 間 の 相 互 作 用 な ど が考 え ら れ て い る4). 一 方,細 胞 を浮 遊 培 養 す る と細 胞 間 の三 次 元 的構 築 が 可 能 と な り,通 常 の 付 着 培 養 に お け る 二 次 元 的 な 構 築 に 比 べ て,よ り分 化 が 進 む こ と が知 ら れ て い る5∼11).しか し な が ら,上 述 し た よ うに,長 期 の付 着 培 養 に よ っ て ニ ワ ト リ胚 網 膜 色素 上 皮 が 水 晶 体 様 構 造 に分 化 転 換 し た報 告 は あ る も の の,浮 遊 培 養 を長 期 間 行 っ た 報 告 は な い.そ こ で 本 研 究 で は,細 胞 の 分 化 の 転 換 を左 右 す る 因 子 の ひ とつ と し て 細 胞 間 の 接 着 状 態 を 想 定 し,ニ ワ ト リ胚 網 膜 色 素 上 皮 細 胞 の 浮 遊 培 養 を行 っ た.ま た,培 養 液 に 種 々 の 濃 度 のbFGF を加 え て,そ の 濃 度 差 に よ る分 化 転 換 の 有 無 を も比 較 検 討 し た. 材 料 と 方 法 1. 網 膜 色 素 上 皮 の 採 取12) 孵 化 後7.5日 目の ニ ワ トリ入 精 卵 の 卵 殻 を70% ア ル コー ル 液 で 消 毒 し た 後,卵 膜 と と も に ピ ン セ ッ トで 除 去 し,胚 を取 り出 し た.心 臓 の 拍 動 を確 認 し た 後,眼 球 を周 囲 組 織 と と もに 摘 出 し てCa2+, Mg2+を 含 ま な い燐 酸 緩 衝 液(PBS(-), pH 7.2,日 水 製 薬)に 入 れ た.次 に,実 体 顕 微 鏡 下 で 清 潔 操 作 に て,眼 球 赤 道 部 に 沿 って 全 周 を切 開 し,角 膜,虹 彩 毛 様 体,硝 子 体,網 膜 を 一 塊 に し て 除 去 し た.こ の 時 期 の ニ ワ ト リ胚 で は,神 経 網 膜 は網 膜 色 素 上 皮 か ら容 易 に 剥 離 で きた.続 い て,残 っ た 杯 状 の 眼 球 組 織 か ら 眼 杯 裂 の 部 分 を 切 除 し,網 膜 色 素 上 皮 が 付 着 した ま まの 脈 絡 膜,強 膜 及 び 周 辺 結 合 織 を4分 割 し た. こ れ を0.02%エ チ レ ン ジ ア ミン 四 酢 酸(EDTA) 溶 液 に 浸 し,室 温 で40分 間 反 応 させ る と,網 膜 色 素 上 皮 は 軽 く擦 過 す る だ け で 容 易 に 脈 絡 膜 か ら剥 離 で きた. こ の 膜 状 の 網 膜 色 素 上 皮 を 少 量 の 燐 酸 緩 衝 液 中 に 浮 遊 させ,ピ ペ ッ テ ィ ン グ を 繰 り返 して 適 度 な大 き さ の 小 片 に し た の ち,浮 遊 培 養 用 マ ル チ プ レー ト24穴(ス ミロ ンMS-8024R)の 各well で 培 養 し た.一 部 の網 膜 色 素 上 皮 は,0.25%の ト リプ シ ン 液 中 に 浮 遊 させ て37℃ の 恒 温 槽 で5 分 間 反 応 さ せ た の ち ピペ ッ テ ィ ン グ して 細 胞 を 単 離 させ.800rpm,5分 間 の 遠 沈 操 作 に よ っ て 集 め て 少 量 の 培 養 液(後 述)に 再 浮 遊 させ,各 wellに 分 注 し た.こ の と き の 細 胞 数 は,1 well あ た り約1.5∼2.0×105個 で あ っ た. 15
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2. 培 養
培 地 と し て, Dulbecco's modified Eagle's medium (以 下DMEM)(日 水 製 薬)をpH約 7.6に 調 整 し て,硫 酸 ス ト レ プ トマ イ シ ン(明 治 製 薬)お よ び ア ン ピ シ リ ン ナ ト リ ウ ム(ペ ン ブ リ チ ン,藤 沢 薬 品 工 業)を そ れ ぞ れ100mg/lの 濃 度 と な る よ う 加 え,牛 胎 児 血 清Biocell Labo ratories,解 凍 後56℃ の 恒 温 槽 で30分 間 補 体 を不 活 化 し た も の)を10%の 濃 度 と な る よ う に 混 和 し て 用 い た.培 養 条 件 は, 5% CO2, 37℃,湿 度100%で あ る.
bFGF(hFGF-basic, 157aa, Recombinant, R & Dシ ス テ ム)をPBS(-)希 釈0.1%牛 血 清 ア ル ブ ミ ン 溶 液(Albumin, Bovine, F-V,ナ カ ラ イ テ ス ク)で 溶 解 し て25mg/lの 濃 度 と し, 使 用 時 に 上 記 の 培 地 に 設 定 濃 度(200ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml, 0.1ng/ml)と な る よ う 添 加 した.対 照 と してbFGFを 加 え な いDMEM で の 培 養 を行 っ た.培 地 の 交 換 は 週 に2∼3回 行 っ た.培 養 開 始 後24時 間 毎 に 位 相 差 顕 微 鏡 で 観 察 し,写 真 撮 影 を行 っ た. 3. 組 織 学 的 検 査 1) 光 学 顕 微 鏡 試 料 をPBS(-)希 釈4%パ ラ ホル ム ア ル デ ヒ ド液 で 固 定 し,ア ル コー ル 系 列,キ シ レ ン に よ る 脱 水 の 後,パ ラ フ ィ ン に 包 理 し た.パ ラ フ ィ ン切 片 を 作 製 し,ヘ マ トキ シ リン ・エ オ ジ ン染 色 を行 っ た. 2) 電 子 顕 微 鏡 図1 bFGF濃 度200ng/mlで 浮 遊 培養 したニ ワ トリ胚 網膜 色 素 上 皮 の小 片 の 位相 差顕 微 鏡 所 見. ス ケー ル バ ー は100μm. 培養 開 始 後24時 間 目(a)には網 膜 色素 上 皮 小 片 は ま る まっ て塊 状 に な り,培養 開始 後2週 間 目 (b)には無 色素 塊 が 出 現 し,培 養 開始 後4週 間 目(c)には著 明 に増 大 して い る. bFGF非 存 在 下 で4週 間 培養 して も(d),無 色素 塊 は で きな い. 試 料 をPBS(-)希 釈2.5%グ ル ター ル ア ル デ ヒ ド液 お よ び1%四 酸 化 オ ス ミ ウ ム で 二 重 固 定 し,エ タ ノー ル 系 列 で 脱 水 し,エ ポ ン812 に 包 理 した 後,超 薄 切 片 を作 成 した.切 片 を
クエ ン酸 鉛 お よ び 酢 酸 ウ ラ ン で染 色 し,電 子 顕微 鏡(日 立HS-9型)で 観 察 した. 3) 免 疫 組 織 化 学 PBS(-)希 釈4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドで 固 定 し,パ ラ フ ィ ン包 理 切 片 を作 成 した 後, キ シ レ ン,ア ル コ ー ル 系 列 に よ る脱 パ ラ フ ィ ン を行 い,PBS(-)に 切 片 を 浸 し た.免 疫 組 織 化 学 染 色 は, avidin-biotin-conjugated peroxidase complex法(ABC法)
(VectastainTM ABCキ ッ ト, Vector)を 用
い て行 っ た. 図2 bFGF濃 度200ng/mlで 浮 遊 培養 したニ ワ トリ胚 網 色素 上 皮 の小 片 の光 学 顕微 鏡 所 見.ス ケー ル バ ー は50 μm. a∼c:培 養 開始24時 間 目の ヘ マ トキ シ リン・エ オ ジ ン染 色.(a)には網 膜 色素 上 皮 小 片 は ま る ま って 塊状 に な り,培養 開始 後2週 間 目(b)には エ オ ジ ン好性 の細 胞 よ りな る無 色素 塊 が 出現 し,培養 開始 後4週 間 目 (c)には 著 明 に増 大 して水 晶体 様 を呈 してい る. d∼f:培 養 開始 後4週 間の 免 疫組 織 化 学染 色.抗 ク リス タ リン抗体(d)および 抗bFGF受 容 体 抗体(f)に 対 して は 陽性 で あ るが,抗 ロ ドプ シ ン抗 体(e)には陰 性 で あ る. ま ず,組 織 切 片 をPBS(-)希 釈5%正 常 ヤ ギ 血 清 と 室 温 で20分 間 反 応 さ せ た の ち,一 次 抗 体 と37℃ で60分 間,室 温 で30分 間 反 応 さ せ た.一 次 抗 体 と し て は,ウ サ ギ の 抗 牛 ロ ド プ シ ン 抗 体(Anti (bovine) Rhodopsin, LSL, 4000倍 に 希 釈),ウ サ ギ の 抗 牛 ク リ ス タ リ ン 抗
体(Rabbit Antibody to Alpha B Crystallin, SEROTEC, 2000倍 に 希 釈),ま た は ウ サ ギ の 抗 ニ ワ ト リbFGF受 容 体 抗 体(Anti-Chicken-FGF Receptor, UBI, 100倍 に 希 釈)を 用 い た.0.05% Tween-20添 加PBS(-)で,10分 間 ず つ3回 洗 浄 し た.ビ オ チ ン 化 二 次 抗 体(ヤ ギ の 抗 ウ サ ギIgG抗 体)と37℃ で60分 間 反 応
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図3 bFGF濃 度200ng/mlで 浮遊 培養 したニ ワ トリ胚 網 膜 色素 上 皮 小 片 の電 子 顕微 鏡 所 見
.培 養 開始 後4週 間.
a:網 膜 色素 上 皮 細 胞基 底 側 に 無色 素 細 胞 が 出現 して い る.ス ケー ルバ ー は5μm.
図4 bFGF非 存在 下 で浮 遊培 養 した ニ ワ ト リ胚網 膜 色素 上 皮 小 片 の 電子 顕微 鏡 所 見.培 養 開 始 後4週 間. スケー ルバ ー は5μm.
a:内 側 に 基底 膜,外 側 に微 絨 毛(矢 印)が み られ る.
b:網 膜 色 素上 皮 細 胞 間 に は細 胞 間結 合 装 置(矢 印小)が あ り,基 底 膜 を と もな っ た基 底 陥 入(矢 印大 も
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させ た の ち,同 様 に 洗 浄 し た.ア ビ ジ ン-ビ オ チ ン化 ワ サ ビペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 複 合 体 と室 温 で30分 間 反 応 させ,同 様 に 洗 浄 した. ペ ル オ キ シ ダー ゼ 基 質 溶 液 と して,Tris緩 衝 液(0.1M, pH 7.2)で 希 釈 し た0.05% diaminobenzidine tetrahydrochloride (SIGMA)に,過 酸 化 水 素 水 を0.01%と な る よ うに 添 加 し,こ れ と室 温 で30分 間 反 応 させ た の ち,水 道 水 で 反 応 を停 止 した 後,1%メ チ ル グ リー ン液 で 対 比核 染 色 を行 っ た. 結 果 膜 状 に 分 離 した 網 膜 色 素 上 皮 小 片 を 浮 遊 培 養 す る と,翌 日 に は 丸 ま っ て 塊 状 に な っ た(図1 a) .200ng/ml濃 度 のbFGFの 存 在 下 で 培 養 を 続 け る と,お お よ そ3日 後 か ら そ の 塊 の 一 部 に 無 色 素 性 の 部 分 が 瘤 状 に 盛 り上 が る現 象 が み ら れ た.こ の 瘤 状 の 部 分 で は,好 酸 性 に染 ま る明 る い 胞 体 を持 つ 無 色 素 性 の 細 胞 が 主 体 を な し, そ の 形 態 は,瘤 の 周 辺 部 で は 胞 体 も核 も扁 平 で 重 層 し て お り,瘤 の 中 央 部 で は核 は 円 形 な い し 楕 円 形 で 胞 体 は 多 角 形 と な る傾 向 に あ っ た(図 2 a, b, c),こ れ らの 変 化 は 約4週 間 で 定 常 状 態 に 達 し(図1 b, c),そ れ 以 降 は 瘤 状 の 部 分 の 大 き さや 形 態 に 明 ら か な変 化 は み られ な か っ た. 図5 浮 遊 培 養 し た ニ ワ ト リ胚 網 膜 色 素 上 皮 の 小 片 の 位 相 差 顕 微 鏡 所 見 .培 養 開 始 後4週 間.ス ケ ー ル バ ー は100 μm. a∼c:bFGF濃 度200ng/ml . d∼f:bFGF濃 度10ng/ml. g∼i:bFGF濃 度1ng/ml. 10ng/mlで 形 成 さ れ る 無 色 素 塊 は 小 さ く(d∼f), 1ng/mlで は 全 く 形 成 さ れ な い(g∼i) . ト リプ シ ン処 理 を施 し た 場 合 に は,網 膜 色 素 上 皮 細 胞 は バ ラ バ ラ に 浮 遊 し て お り,細 胞 が 再 凝 集 して 塊 に な っ た もの で そ の 形 態 や 大 き さ に は変 化 は み ら れ なか っ た.こ の 場 合,bFGFを 200ng/ml添 加 して も細 胞 塊 か ら無 色 素 性 の 部 分 は形 成 さ れ な か っ た 。200ng/mlのbFGF存 在 下 で4週 間 浮 遊 培 養 した 細 胞 塊 を免 疫 組 織 化 学 法 で し らべ る と,こ の瘤 状 の部 分 は 抗 ロ ドプ シ ン抗 体 に 対 して 陰 性 で,抗 ク リス タ リ ン抗 体 お よ び 抗bFGF受 容 体 抗体 に対 して 陽 性 で あ っ た(図2 d, e, f). 抗 ク リス タ リ ン 抗 体 に 陽 性 で あ っ た 部 分 と抗 bFGF受 容 体 抗 体 に 陽 性 で あ っ た部 分 と は 一 致 して い た. 200ng/mlのbFGF存 在 下 で4週 間 浮 遊 培 養 し た細 胞 塊 を電 子 顕 微 鏡 に て観 察 す る と,網 膜 色 素 上 皮 の 基 底 側 に 無 色 素 細 胞 が 出 現 し て い た (図3 a).そ の 細 胞 間 に は 密 に 細 胞 間 結 合 装 置(intercellular junction)が み られ,細 胞 質 は 均 質 で 中 等 度 の 電 子 密 度 を 示 し て お り(図3 b),水 晶 体 線 維 細 胞 の 特 徴 を そ な え て い た,一 方,bFGF非 存 在 下 で4週 間 浮 遊 培 養 し た 細 胞 塊 で は,網 膜 色 素 上 皮 の分 化 は よ く保 た れ て い た.即 ち,網 膜 色 素 上 皮 細 胞 間 に は 細 胞 間 結 合 装 置 が あ り,そ の 基 底 側 に は 基 底 陥 入 が,そ の 頂 上 側 に は 微 絨 毛 が 多数 み られ た.細 胞 塊 内 に お け る細 胞 の 向 き に つ い て は,基 底 側 は 内 側 に 向 き頂 上 側 は 外 側 に 向 い て い た(図4 a, b). 低 濃 度 のbFGF存 在 下 で 培 養 し た 場 合,翌 日 に は 網 膜 色 素 上 皮 の 小 片 は 丸 ま っ て 塊 状 に な っ た が,無 色 素 性 の 部 分 が 盛 り上 が る現 象 は,濃 度 に よ っ て 差 が み られ た.即 ち,200ng/mlで 培 養 を試 み た24 wellの う ち,4週 間 で 無 色 素 性 の 部 分 が 形 成 さ れ た の は24 well全 部 で あ っ た が, 10ng/mlで は, 24 wellの う ち9 wellの み で あ っ た.こ れ ら10ng/mlのwellに お け る無 色 素 性 の 部 分 の 発 育 はbFGF濃 度200ng/mlの も の に 比 べ,遅 い傾 向 が あ っ た.ま た, 1ng/ml, 0.1ng/ml,お よ びbFGF無 添 加 の 培 地 で 培 養 した 場 合 に は,無 色 素 性 の 部 分 は 形 成 さ れ なか っ た(図1 d,図5). 考 察 タ マ ネ ギ 様 構 造 を 持 つ 瘤 状 の 部 分 は,抗 ク リ ス タ リン抗 体 に 陽 性 で あ っ た こ とか ら,水 晶 体 様 構 造 で あ る と考 え ら れ,こ れ は 網 膜 色 素 上 皮 細 胞 か ら水 晶 体 上 皮 細 胞 へ の 分 化 転 換 を意 味 し て い る.そ して こ の 水 晶 体 様 構 造 の 形 成 はbFGF 濃 度 に 依 存 し て み られ,200ng/mlで は100%に, 10ng/mlで は 約40%に 認 め られ た が,1ng/ml以 下 の 濃 度 で は 全 く認 め ら れ な か っ た.さ ら に こ の 水 晶体 様 構 造 の 中 で,抗 ク リス タ リン 抗 体 に 陽 性 で あ っ た部 分 と抗bFGF受 容 体 抗 体 に 陽 性 で あ っ た 部 分 とが 一 致 して い た こ と か ら,ク リ ス タ リ ン の 発 現 に はbFGFが 重 要 な 役 割 を果 た して い る こ とが 推 測 で き る.一 方,シ ー ト状 の 網 膜 色 素 上 皮 小 片 で は な く,網 膜 色 素 上 皮 細 胞 が 単 離 し て い る 状 態 で 培 養 を 開 始 し た も の で は タマ ネ ギ様 構 造 が で き な か っ た こ と か ら,水 晶 体 様 構 造 の 形 成 に は 細 胞 間 相 互 作 用 が 重 要 な役 割 を 果 た して い る と考 え ら れ る.し た が っ て, 網 膜 色 素 上 皮 細 胞 か ら水 晶 体 上 皮 細 胞 へ の 分 化 転 換 に は,一 定 濃 度 のbFGFの 存 在 と,正 常 な 細 胞 間 相 互 作 用 が 必 要 で あ る と結 論 で き る. Pittackら3)の 実 験 で は 網 膜 色 素 上 皮 小 片 か ら 神 経 網 膜 へ の 分 化 転 換 が 起 こ っ た の に,今 回 の 実 験 で は 神 経 網 膜 で は な く水 晶 体 様 構 造 が で き た.そ の 理 由 と して は,ま ず,実 験 に 用 い た ニ ワ ト リ胚 の 時 期 の 差 と,実 験 に 用 い た網 膜 色 素 上 皮 の 部 位 の 違 い が 考 え られ る.Pittackら は,
Hamburger and Hamilton stage 24∼34の 胚 を
使 用 した が,こ れ は 孵 化 後 約3.5∼8.0日 胚 に 相 当 し,し か もか な りの 幅 が あ る.今 回 の 実 験 で は,予 備 実 験 に て 孵 化 後4.0日 胚 も使 用 して み た が,早 い 時 期 の 胚 か ら は網 膜 を混 入 させ ず に 網 膜 色 素 上 皮 の み を選 択 的 に 採 取 す る こ とが 困 難 で あ っ た の で,網 膜 混 入 を 避 け る た め に 結 局7.5 日胚 を 使 用 す る こ と に し た.ま た,孵 化 後7.5日 目の ニ ワ ト リ胚 の 眼 球 に は 下 方 に 眼 杯 裂 が 存 在 す る の で,本 実 験 で網 膜 色 素 上 皮 を 採 取 す る際 に は こ の 部 分 を 注 意 深 く除 去 した.Pittackら は 眼杯 裂 部 分 の 除 去 に つ い て 言 及 して い な い の で, 神 経 網 膜 を 混 入 し た ま ま培 養 し た 可 能 性 が 否 定 で き な い. 次 に,組 織 片 の 丸 ま る 向 きに つ い て検 討 し て み た.生 体 の 水 晶 体 上 皮 細 胞 は 基 底 を 外 側,即 ち房 水(細 胞 外 液)側 に 向 け て 配 列 して い る. した が っ て,今 回 の 実 験 で は網 膜 色 素 上 皮 小 片 が 基 底 を外 側 に 向 け て 丸 ま っ て い た の で は な い か,つ ま り組 織 片 の 丸 ま る 向 き がPittackら の 実 験 の 震 盪 培 養 と は 逆 だ っ た の で 分 化 の 方 向 が 異 な っ て い た の で は な い か と推 測 した.そ こ で,
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bFGF非 存 在 下 で 網 膜 色 素 上 皮 小 片 を4週 間 に わ た っ て 浮 遊 培 養 した も の を 電 子 顕 微 鏡 的 に 観 察 して み る と,網 膜 色 素 上 皮 の 分 化 は よ く保 た れ て お り,そ の 基 底 側 は 内 側 に,頂 上 側 は 外 側 に 向 い て お り,生 体 の 水 晶 体 上 皮 細 胞 の 向 き と は 反 対 で あ っ た.こ れ は 当 初 の 推 測 とは 矛 盾 す る結 果 で あ るの で,浮 遊 培 養 に お い て網 膜 色 素 上 皮 小 片 が 丸 ま る向 き は,そ の 分 化 転 換 の 方 向 づ け に は 無 関 係 で あ る と考 え ざ る を え な い. 網 膜 色 素 上 皮 細 胞 を単 離 して 培 養 した もの で 分 化 の 転 換 が 起 こ ら な か っ た理 由 の ひ とつ と し て は,播 い た細 胞 の 数 が 少 な か っ た 可 能 性 も考 え ら れ る.Pittackら も,単 離 し た 網 膜 色 素 上 皮 細 胞 を今 回 の 実 験 と同 様 の 細 胞 密 度 で 培 養 し た 場 合,網 膜 へ の分 化 の 転 換 が み られ な か っ た と 述 べ て い る.し たが っ て,分 化 転 換 に は さ ら に 高 密 度 で の 浮 遊 培 養 が 必 要 な の か も しれ な い. 今 回 の 実 験 で は,ニ ワ ト リ胚 網 膜 色 素 上 皮 細 胞 か ら水 晶 体 上 皮 細 胞 へ の 分 化 転 換 に 必 要 と思 わ れ る2の 条 件 が 示 唆 さ れ た が,こ れ ら2つ の 条 件 の み で 充 分 で あ る とは 断 定 で き な い.網 膜 色 素 上 皮 が 網 膜 に な る か 水 晶体 に な るか とい う 分 化 転 換 の 方 向 を決 定 す る条 件 に つ い て も,さ ら に 詳 し く解 明 して ゆ く必 要 が あ ろ う.実 際 の 器 官 形 成 の 過 程 で は,水 晶 体 は 表 皮 外 胚 葉 の 陥 凹 に よ っ て 形 成 さ れ る の で あ っ て,網 膜 色 素 上 皮 の分 化 の 転 換 に よ っ て 形 成 さ れ る わ け で は な い.網 膜 色 素 上 皮 が 水 晶 体 を形 成 す る潜 在 力 を 持 っ て い る とい うこ とは,生 体 で ど の よ う な意 味 が あ る の か に つ い て は 不 明 の ま ま で あ る.な お,今 後 の 展 望 と して は,網 膜 色 素 上 皮 か ら球 形 に近 い水 晶体 様 構 造 が 得 られ た こ とに よ り, 将 来 これ を 人工 水 晶 体 と し て 利 用 で き る可 能 性 が 考 え ら れ る. 結 論 bFGFの 存 在 下 で ニ ワ ト リ胚 の 網 膜 色 素 上 皮 細 胞 を浮 遊 培 養 して,そ の 形 態 変 化 を観 察 し た. 孵 化 後7.5日 胚 の網 膜 色 素 上 皮 に トリプ シ ン処 理 を施 して 細 胞 単 位 の 懸 濁 液 に し た も の と,ト リ プ シ ン処 理 を施 さず ピペ ッ テ ィ ン グ の み で 細 か く した 網 膜 色 素 上 皮 小 片 と を,高 濃 度(10お よ び200ng/ml)のbFGF存 在 下 で 培 養 し て 比 較 した. 網 膜 色 素 上 皮 小 片 は 塊 状 に な っ て 増 殖 しタ マ ネ ギ様 の 球 形 重 層 構 造 を 形 成 した が,細 胞 を単 離 し て 懸 濁 液 に した もの は タ マ ネ ギ様 構 造 を形 成 しなか っ た.この タマ ネ ギ様 構 造 の 形 成 はbFGF の 濃 度 に 依 存 し て起 こ り,bFGFの 濃 度 が1ng/ ml以 下 で は 形 成 さ れ な か っ た.タ マ ネ ギ様 構 造 の部 分 は 免 疫 組 織 化 学 法 に て 抗 ク リス タ リ ン抗 体 に 陽 性 で あ っ た こ とか ら,網 膜 色 素 上 皮 細 胞 か ら水 晶 体 上 皮 細 胞 へ の 分 化 転 換 が 起 こ っ た と 考 え られ た.こ の 部 分 は抗bFGF受 容 体 抗 体 に も陽 性 で あ っ た.以 上 か ら,ニ ワ ト リ胚 網 膜 色 素 上 皮 細 胞 か ら水 晶 体 上 皮 細 胞 へ の 分 化 転 換 に は,網 膜 色 素 上 皮 細 胞 ど う し の 相 互 作 用 お よび 一 定 濃 度 以 上 のbFGFの 存 在 とい う2つ の 条 件 が揃 う こ とが 必 要 で あ る. 要 約 塩 基 性 線 維 芽 細 胞 増 殖 因 子(basic fibroblast growth factor,以 下bFGF)の 存 在 下 で ニ ワ ト リ胚 の 網 膜 色 素 上 皮 細 胞 を 浮 遊 培 養 し て,そ の 形 態 変 化 を 観 察 した.孵 化 後7.5日 胚 の 網 膜 色 素 上 皮 に ト リプ シ ン処 理 を 施 し て 細 胞 単 位 の 懸 濁 液 に した もの と,ト リプ シ ン処 理 を施 さ ず ピペ ッテ ィ ン グ の み で 細 か く した 網 膜 色 素 上 皮 小 片 と を,高 濃 度(10お よ び200ng/ml)のbFGF存 在 下 で 培 養 す る と小 片 は 塊 状 に な っ て 増 殖 しタ マ ネ ギ 様 の 球 形 重 層 構 造 を 形 成 し た が,懸 濁 液 に し た もの は タ マ ネ ギ様 構 造 を形 成 しな か っ た. こ の タ マ ネ ギ様 構 造 の 形 成 はbFGFの 濃 度 に依 存 し て 形 成 さ れ,bFGFの 濃 度 が1ng/ml以 下 で は 形 成 さ れ な か っ た.ま た,こ の 部 分 は,免 疫 組 織 化 学 法 に て 抗 ク リス タ リ ン抗 体 お よ び抗 bFGF受 容 体 抗 体 に 陽 性 で あ っ た.以 上 か ら, ニ ワ ト リ胚 網 膜 色 素 上 皮 細 胞 か ら水 晶 体 上 皮 細 胞 へ の分 化 転 換 に は,網 膜 色 素 上 皮 細 胞 ど う し の相 互 作 用 お よ び 一 定 濃 度 以 上 のbFGFの 存在 とい う2つ の 条 件 が 揃 う こ と が 必 要 で あ る. 稿 を終 え る に 当た り,御 懇切 な る御 指 導御 校 閲 を 賜 りま した岡 山大 学 医 学 部 眼科 学 教 室 松 尾信 彦 教授 に深 謝 い た します.ま た,本 研 究 にお いて 直接 御指 導 い ただ きま した同教 室松 尾 俊 彦 先 生 に感 謝 いた します とと もに,研 究 に ご協 力 い た だ き ま した細 田彰 氏,光 岡健 之 氏,進 輝 子 氏 に 厚 く御 礼 申 し上 げ ます.
なお,本 論 文 の 要 旨 は 第99回 日本 眼科 学会 総 会 に お いて発 表 した.
文 献
1) Eguchi G and Okada TS: Differentiation of lens tissue from the progeny of chick retinal pigment cells culture in vitro: A demonstration of a switch of cell types in clonal cell culture. proc Natl Acad Sci USA (1973) 70, 1495-1499.
2) Park CM and Hollenberg MJ: Basic fibroblast growth factor induces retinal regeneration in vivo. Dev Biol (1989) 134, 201-205.
3) Pittack C, Jones M and Rea TA: Basic fibroblast growth factor induces retinal epithelium to generate neural retina in vivo. Development (1991) 113, 577-588.
4) Opas M and Dziak E: bFGF induced transdifferentiation of RPE to the mechanical properties of the substratum. Dev Biol (1994) 161, 440-454.
5) Moscona A: Rotation-mediated histogenetic aggregation of dissociated cells. A quantifiable approach to cell interactions in vitro. Exp Cell Res (1961) 22, 455-475.
6) Steinberg MS: Reconstruction of tissues by dissociated cells. Science (1963) 141, 401-408.
7) Mueller-Klieser W: Multicellular spheroids. A review on cellular aggregates in cancer research. J Cancer Res Clin Oncol (1987) 113, 101-122.
8) Delong GR: Histogenesis of fetal mouse isocortex and hippocampus in reaggrigating cell cultures. Dev Biol (1970) 22, 563-583.
9) Trapp BD, Honegger P, Richelson E and Webster H: Morphological differentiation of mechanically dissociated fetal rat brain in aggregating cell cultures. Brain Res (1979) 160, 117-130.
10) Landry J, Bernier D, Ouellet C, Goyette R and Marceau N: Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: Histotypic recognization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activ
ities. J Cell Biol (1985) 101, 914-923.
11) Koide N, Sakaguchi K, Koide Y, Asano K, Kawaguchi M, Matsushima H, Takenami T, Shinji T, Mori M and Tsuji T: Formation of multicellular spheroids composed of adult rat hepatocytes in dishes with positively charged surfaces and under other nonadherent environment. Exp Cell Res (1990) 186, 227-235.
12) 林 倫 子:網 膜 色 素 上 皮 細 胞 の 組 織 培 養 に 関 す る 研 究-正 常 ニ ワ ト リ 胚 網 膜 色 素 上 皮 の 培 養 細 胞 に つ い て - . 日 眼 会 誌 (1977) 81, 692-700.
24 筒 井 康 子
Formation of lentoid body from retinal pigment epithelium
of chick embryo in floating culture Yasuko TSUTSUI
Department of Ophthalmology,
Okayama University Medical School,
Okayama 700, Japan (Director: Prof. N. Matsuo)
We observed the morphologic changes of tissue fragments of retinal pigment epithelium (RPE) of chick embryos in floating culture under the presence of bacic fibroblast growth factor (bFGF). At higher concentration (10 and 200ng/ml) of bFGF, rolled up RPE sheets grew to develop non-pigmented lumps with the structure like onions, while dissociated RPE cells did not form such structure. Histologically, the onion-like structure consisted of
lens-fiber-like cells, positive for anti-crystallin antibody and anti-bFGF-receptor antibody. This lentoid structure was not formed at 1ng/ml or lower concentration of bFGF. The trans
differentiation from RPE cells to lens epithelial cells was dependent upon the concentration of bFGF as well as the proper interaction among RPE cells.
