細 胞 内 に お け るAdenovirus
12型T抗
原 の
免 疫 組 織 化 学 的 研 究
三
沢
洋
IMMUNOHISTOCHEMICAL
STUDIES OF
ADENOVIRAS
12
T ANTIGEN
IN
CELLS
The Institute of Medical Science, The University
of TOKYO and
Central Reseach Laboratoraries,
Sankyo CO., Ltd.
Hiroshi Misawa
〔受 付: 7月5日, 1968年 〕 総 括 ハ ム ス ター 胎 児2代 培 養 細 胞 にAdenovirus 12型 の 感 染 に よ り誘 発 され る腫 瘍 抗 原 (T抗 原) の 性 質 を推 定 す るた め に, 従 来 の組 織 化 学 的 手 技 に 螢光 抗 体 法 を併用 した 免 疫 組織 化 学 的 方 法 を用 い, 各 種 処 理 剤 のT抗 原 に 対 す る影 響 を検 討 した 結 果, T抗 原 は蛋 白質 を 根 幹 と し て抗 原 決 定 基 に 糖 が 関 係 し た物 質 で あ ろ うこ とが推 定 さ れ た. 序 文 Adenovirus 12型 (Ad-12) を乳 呑 みハ ム ス タ ー な どに 接 種 す る と腫 瘍 を 形 成 し, そ の腫 瘍 抽 出液 中 にAd-12 に よる担 癌 ハ ム ス ター の γグ ロ ブ リン と特 異的 に補 体 結 合 反 応 (CF) を起 す 抗 原 が 存 在 す る こ とが 証 明 され た. そ の後, SV40, ポ リオ ー マ ウイ ル ス で も 同様 な事 実 が 見 出 され, さ らに腫 瘍 組 織 だ け でな く各 種 培 養 細 胞 にAd-12を 接 種 して も, Virion抗 原 と は別 個 に この 種 の抗 原 が形 成 され る こ とが 明 らか に なつ た. こ の抗 原 は, 一 般 に は, 腫 瘍 抗 原 (T抗 原) と称 され て い る. Popeら (1964) は螢 光 抗 体 法 を もち い, CF陽 性 血 清 と 特 異 的 に反 応 す るT抗 原 の形 態 的 観 察 を行 い, こ の抗 原 は細 胞 質 や核 にfleck様 (筆の ほ さ き様) に存 在 す る こ と, 又 抗 ウイ ル ス血 清 とは反 応 し な い こ と を明 らか に し て い る. こ のT抗 原 の化 学 的 性 状 は “early protein” とみ な さ れ てい る が, 量 的 に集 め に くい た め と抽 出 時 の 変 性 の た め か, そ の本 態 は ほ とん ど明 らか に なつ て い な い. 従 来 の組 織 化 学 的手 法 に 螢 光抗 体 法 を加 味 した 免 疫 組 織 化 学 的 手 法 を用 い, 微 量 のT抗 原 の 生 理 化 学 的 性状 を検 討 す る こ と を 目的 と して 実 験 を行 つ た. 材 料 と方 法 使 用 ウイル スAd-12 Huie株 を用 い 人胎 児 腎 培 養 細 胞 (HEK), あ る い はKB細 胞 のmonolayerに 種 ウイ ル ス を感 染 させ, 血 清 を含 ま な いEagle液 を維 持 液 と して36℃ に保 ち, 典 型 的 なCPEが あ らわれ た の ち凍 結 融 解 を3回 く りか
え し, 3,000rpm 10分 遠 心 し た上 清 を フ リー ザ ー に保 存 し, ウイ ル ス液 と して使 用 した. ウイ ル ス 液 の感 染 価 は HEKで のtube titrationに よ り, 107.2 TCID/mlで あ つ た. 使 用 細 胞 ハ ムス ター 胎 児 (HaE) の2代 培 養 細 胞 の カ バ ー ス リ ップ上 に単 層 培 養 した もの を主 に 使 用 し た. 培 養 液 は 10%コ ウシ血 清 を含 むEagle液 を用 い た. 検 査 標 本 の 作 成 東 京 大 学 医科 学研 究 所 三 共 株 式 会 社 中央 研 究所 HaEの 単 層 培 養 され た カ バ ー ス リ ップ を血 清 を 除 い たEagle溶 液 に交 換 培 養 し, Ad-12をmoi (multipli city of infection) 30 TCID50 per cellの 割 に感 染 させ, T抗 原 の形 成 が 最 高 に認 め られ た 時 (感染 後20∼72時
間), PBS (phosphate buffered saline) に で細 胞 を良 く 洗 滌, 乾燥 させ, 直 ち に試 験 管 に入 れ て 密 栓 し-20℃ に保 存 した. この よ うに し て保 存 され た カバ ー ス リ ップ
を随時 と り出 して 以 下 にの べ る よ うな実 験 に供 した. な お, T抗 原 の被 染 色性 が 保 存 中 に変 化 す る よ うな傾 向 は
44 (324) 三 沢 洋 み られ なか つ た. 表1 標 識 抗 体 の 性 状 標 識 抗 体 抗 ウイ ル ス血 清 (抗V血 清) は, 予 防 衛 生 研 究 所 腸 内 ウイ ル ス部 でHEKに 増 殖 させ たAd-12で ウサ ギ を免 疫 して作 成 した もの で あ る. そ のCF価 は ウイル ス 抗 原 に 対 し512倍, T抗 原 に対 して は2倍 以 下, HEKに 対 し256倍 (これ は ヒ ト肝 ア セ トン乾 燥 粉 末 で 標識 抗 体 を吸 収 す る こ と に よ り完 全 に除 か れ た) の もの で あ る. 抗T血 清 は 同 じ く予 防 衛 生 研 究 所 腸 内 ウ イ ル ス部 か ら 分 与 を受 け た. Ad-12でinduceさ れ た担 癌 ハ ム ス タ ー の血 清 で, CF価 はT抗 原 に対 し12∼32倍, V抗 原 に 対 し ては4倍 以 下 の も の を6匹 分 プ ー ル して使 用 した . これ らの血 清 はそ れ ぞれ γグ ロブ リ ン を分 画 した後, 川 村 ら の方 法 でfluorescein isothiocyanateを 標 識, 精 製 し, 抗 体価 の測 定 を行 つ た. それ らの性 状 は表1に 示 す 通 りで あ る. 標 識 抗 体 は さ らに非 特 異 螢 光 を除 去 す る た め に, そ れ ぞ れ の反応 力 価 の8単 位 に相 当す る稀 釈 の と ころ で, ヒ ト肝 ア セ トン乾 燥 粉 末 (2容) と, ハ ム ス タ ー肝 アセ トン 乾 燥 粉 末 (1容) の混 合 した も の を用 い, 次 の如 く吸 収 し た. ア セ トン 粉 末 を抗 体1mlあ た り100mgの 割 に加 え, 室 温 に1時 間 放 置 後16,000rpm 30分 遠 心 し, 上 清 に50mg/mlあ た り ア セ トン 粉 末 を加 え 再吸 収 を 行 つ た. これ らT抗 抗 体, 抗V抗 体 は相 互 に交 叉 反 応 性 は な く, きわ め て 特 異 性 が高 い こ と が認 め られ た. 吸 収 標 識 抗 体 は 少 量 宛 ア ン プル に分 注, ドライ ア イ ス ア セ トンで 急 速 に凍 結 後-70℃ 中 に保 存 し, 使 用 時 融 解 させ使 用 倍 数 ま で 生 理 食 塩 水 で稀 釈 し, 実 験 に使 用 した 使 用 倍 数 は4単 位 に 相 当す る稀 釈, す な わ ち抗T標 識 抗 体 は8 倍, 抗V標 識 抗 体 は16倍 の もの を用 い た. 処 理 と反 応 法 T抗 原 を蛋 白質, 核 酸, 脂 質, 糖 質 とそれ ぞ れ想 定 し た 上 で 種 々 の処 理 を行 な い, T抗 原 の特 異 螢 光 像 が どの よ うな形 態 的 変化 をす るか を観 察 し, 同時 に細 胞 や 標 識 抗 体 に 及 ぼ す影 響 を検 討 す る こ とに よ りT抗 原 の組 成 の 推 定 を行 な う こ とに した. 図1 サ ン プル を処 理 剤 の 中 に浸 し, 反 応 せ しめ た後, PBS で充 分 洗 滌 し処理 剤 を除去, 乾 燥 させ る. こ のサ ン プ ル に標 識 抗 体 を か け37℃ 2時 間 反 応 を 行 わ せ る, PBS で洗 滌, 乾 燥 し, 緩 衝 グ リセ リン溶 液 (pH 8.5) で 封 入 後 観 察 を行 な つ た (図1参 照). 以 下, 染 色 前 処 理 試 験 (前処 理), 染 色後 処 理試 験 (後処 理) とい う言 葉 を用 い る が, そ れ は 次 の よ うな 処理 方法 を意 味 す る. 「前処 理 」…抗 原 を処理 剤 で処 理 した 後 に標 識 抗 体 と反 応 さ せ る場 合. 「後 処 理 」…抗 原 と標 識 抗 体 と反応 させ て か ら処理 剤 で 処 理 を行 な う場 合. こ の場 合, 抗 原 抗 体 結 合 物 が処 理 剤 の影 響 を 受 け る こ とに な る. 染 色 阻 止 試 験 標 識 抗 体 を阻 止 剤 で37℃ 2時 間置 い た もの を抗 原 と 反 応 させ, 特 異 螢 光 像 の減 少 を対 照 と比較 した. 糖 を阻 止 剤 とす る場 合 は10mg/mlの 濃 度 で行 つ た. 補 体 結 合 反 応 抗 体 (4単 位) は一 定 と し, 抗 原 の稀 釈 を行 な い, 各 稀 釈 の抗 原 と処 理 剤 を 一定 時 間及 応 させ た の ち, 必 要 に 応 じ処 理 剤 の作 用 を除去 し, これ に抗 体, 補 体, 血球 を加 え, 定 法 に した が い判 定 を行 な つ た. 観 察 方 法 封 入 した サ ンプル を千 代 田FM200螢 光 顕 微 鏡 (超高
圧 水 銀 燈: オ ス ラ ムHBO 200) 下 で観 察 を行 つ た. 観 察 は特 異 螢 光 像 の形 態 的 変 化 と同時 に 螢 光輝 度 の判 定 を行 な つ た. 方 法 は少 な く も3名 以 上 の もの が 同 一 標 本 を観 察 し, 輝度 の強 さが もつ と も強 い もの を (〓), 特 異 螢 光 の な い もの を (-) と し, そ の 間 を螢 光 の 強 さに よ り区 分 し, 成 績 の統 一 を行 つ た. 又輝 度 の 比較 を厳 密 に す る た め 図2に 示 す 様 な ブイ ル タ ー の組 合 せ か ら, 3毅 階 の励 起 条 件 を作 り, 各 々 の条 件 下 で特 異 螢 光 像 が 陽 性 の細 胞 数 を数 え, 対 照 との比 較 に よつ て 輝 度 を定 めた. 表2 成 績 図2
46 (326) 三 沢 洋
表3 成 績
(1) (6) (11)•c•c0.1M Veronal buffer pH 7.5 (2)•c•c0.2M Tris buffert+0.01M Mgcl2 pH 7.5 (3)•c•c0.2M Tris buffer pH 7.5 (4) (5) (10)•c•cPBS pH 7.5
(7) (14) (17)•c•c0.005M Phosphate buffer pH 7.0
(8) (9) (12)•c•c0.1M Acetate buffer pH 5.6 (13)•c•c 0.1M Acetate buffer pH 5.0 (15) (16)•c•c0.1M Acetate buffer pH 4.8 成 績 全 て の実 験 を通 じて, 使 用 し た未 処 理 対 照HaE細 胞 の 特 異 螢 光 像 の所 見 は標 本 に よ る差 異 が ほ とん ど認 め ら れ な かつ た. す なわ ちT抗 原 の特 異 螢 光 像 は, 核 内 で は fleck様 の もの が か らみ 合 い, 細 胞 質 で は 核 膜 の外 側 に そ つ て, fleck様 の も のが 束 に な り核 を被 う もの と, 比 較 的 ま ば らにfleckが 散 在 す る像 が認 め られ た (図3, 4). こ のT抗 原 に対 す る各 種 処 理 剤 の光影響 を特 異 螢 光 の輝 度 と形 態 の変 化, 細 胞 自体 に対 す る影 響 に分 け て 観 察 を行 つ た. そ の処 理 条 件 と成 績 を ま とめ た もの が 表2, 表3の 通 りで あ る. 表 に おい て 細 胞 に対 す る影 響 の うち, (〓)--細 胞 の 形 態 が はつ き り しない もの, (++)--か な り変 化 の あ る も の, (+)--変 化 の多 少 み られ る もの, (-)--変 化 の な い もの を示 す. 螢 光 像 の変 化 も, (-) は 変 化 が な かつ た も の, ブ ラ ン ク にな つ てい る のは 螢 光 が (-)か, 細 胞 の流 失 で 変 化 が わ か ら ない も の であ る. 螢 光輝 度 の 程 度 は 次 の よ う定 め た 〓 … か た い 感 じ のす る強 い螢 光 を示 す +++… 強 い 螢 光 を示 す ++…や や 弱 い 螢 光 を示 す +… 白味 が かつ た 螢 光 を示 す -… 螢 光 が み られ ない 物 理 的 処 理 細胞 や 螢 光 像 に 対 す 影 響 はみ られ ず, wetの 状 態 で の加熱 (PBSを70℃ に した 中 に サ ンプル を入 れ る) で 輝 度 の消 失 がみ られ た (図5, 図6). pHで はpH 2.0 よ りpH 11.0の 方 が や や 安 定 の よ うで あ る.
表4 染 色 阻 止 試 験 (1)… …図2に よ る 輝 度 の 程 度 を 示 す (2)…… 抗 原8× を使 用 無 機 化 合 物 処 理 硝 酸 で, 細胞 の 変 化 と螢 光 像 の砂 状 変 化 が み られ た 硫 酸 の場 合 「前処 理 」 で は 輝 度 の消 失 が み られ る (図7) が, 「後 処 理 」 で は低 下 が わ ず か で あ る (図8). 1 MNaCl で は細 胞 の 萎縮 と螢 光 輝 度 の低 下 が認 め られ た. 有 機 溶 媒 処理 極 性 を有 す る溶 媒 処 理 で 多少 螢 光輝 度 の低 下 が み られ るが, Lipidを 良 く抽 出 す る とい わ れ る ク ロ ロ ホル ム: メ タ ノ ー ル (1:1) 処 理 で も螢 光 像 の消 失 は み られ な か つ た. 有 機 化 合物 処 理 酢 酸 処 理 で は螢 光像 の凝 集 状 変 化 と螢 光 輝 度 の低 下 が み られ た. コハ ク酸, 石 炭 酸 では 螢 光 像 の消 失 が み られ た. ク エ ン酸 で は 膜構 造 の 変 化 に と もな うT抗 原 の流 出 と螢 光 像 の 砂状 変 化 が み られ た. デ オ キ シ コール 酸, 8 M尿 素 の 「前 処 理 」 で は螢 光 像 の消 失 が み られ た が, 「後 処 理 」 で は あ ま り輝 度 の低 下 はみ られ な か つ た. ジ メ チ ル スル ホ オ キ シ ド処 理 で は 螢 光 像 の砂 状 変 化 と輝 度 の低 下 が み られ た. ホ ル マ リ ン処 理 で は 螢 光 の変 化 は み られ な か つ た (図9). 緩 衝 液 処 理 酢 酸 緩 衝 液 で は 螢 光 像 の 砂 状 変 化 と輝 度 の低 下 が み ら れ た. 脂 質 分 解 酵 素 処 理 Lipase処 理 で は螢 光輝 度 の 低 下 が み られ たが, 細 胞 も か な り変化 を うけ て い た. 核 酸 分 解酵 素 処 理 DNase, RNase処 理 で 螢 光 像 の 変 化 が み られ た (図 10, 図11). 蛋 白質 分 解酵 素 処 理 蛋 白質 分 解 酵 素 処 理 で は 細 胞 自体 に 対 す る 作 用 が強 く, 細 胞 が 流 出 して し ま うた め, T抗 原 に対 す る作 用 を み るこ とは 困難 で あ つ た. しか し, 例 え ばTrypsinを 100γ/mlの 濃 度 で室 温5分 間 作 用 させ た 場 合 に, 流 失 せ ず に 残 つ た 細胞 に 細胞 か ら とび 出 し たT抗 原 が, 輝 度 の 低 下 は あ つ て も形 態 的 に 確認 で きた (図12). 過 ヨ ウ度 酸 々 化 過 ヨ ウ度 酸 処 理 で は, 「前 処 理 」 に おい て は螢 光 像 が完 全 に 消失 す る (図13) の に対 して, 「後 処 理 」 で は螢 光 像 の 消 失 は み られ な か つ た (図14). 糖質 分 解 酵 素 処 理
Neuramidase, Sialidase β-amylase, β-glucosidase (図 15) な どに よ る処 理 で は 螢 光輝 度 の 低 下, 螢 光 像 の砂 状 変 化 が み られ た. 又, α-amylaseは 蛋 白質 分 解 酵 素 を含 ん で い た よ うで 細胞 が 流 失 し判 定 で きな か つ た. 表5 補 体 結 合 反 応 (1) (1)… 抗 体: 4単 位 (32×) を使 用 阻 止 試 験 行 なつ た阻 止 試 験 は抗 体 に対 す る阻 止反 応 で あ つ て, 抗 体 過 剰 の条 件 下 で抗 原 と作 用 させ る方 法 を用 い て い る た め完 全 な阻 止 は み られ な か つ た. 表4に そ の成 績 の 一 部 を示 す. Lactoseはcontrolに 比 較 して 明 らか に 阻止 が み られ た. 他 の糖 で も阻 止 が み られ た例 が あ つ た が, 結 果 にバ ラ ツ キ がみ られ, は つ き り し た 事 は い え な い. 考 察 免 疫 組 織 化 学 的 手 法 に よ るT抗 原 の解 析 も, この方 法 論 自体 に限 界 が あ る だ け に, あ くま で も物 質 同定 の ス ク リー ニ ン グ的 な も の とい え よ う. もち ろ ん特 異螢 光 の 消
48 (328) 三 沢 洋 失 か ら直 ちに 抗原 の溶 出, 破 壊 を断 定 す る こ とは不 可 能 で あ るが, 物 質 自体 と細 胞 に対 す る処 理 剤 の影 響 は, あ る程 度 区 別 し て推 定 出 来 る で あ ろ う. 特 に化 学 的 に分 析 す るに は材 料 が 量 的 に足 りな い場 合, こ の よ うな 実験 手 技 に よ り物 質 を推 定 し, 実 際 に物 質 を取 り出す 手 掛 りと す る こ とは有 意 義 と考 え られ る. T抗 原 は 最 近Tavitanら (1967) に よれ ば15万 の 分 子 量 を持 つ た も の でDNase, RNaseで は 作用 を受 け ず, TrypsinでCF活 性 が 消 失 す る硫 安 沈 澱 性 の もの, す な わ ち, 蛋 白質 性 の も の で あ ろ う との べ て い る. またHollinshad (1967) は2万 と8万 の 分 子 量 を持 つ た も の で2万 の も の はheat stable, 8万 の もの はunsta bleで あ る とのべ て い る. しか し, わ れ わ れ の実 験 成 績 か らT抗 原 はLipid可 溶 性 有 機 溶 媒 処 理 で も. 螢 光 像 の 消 失 が み られ な かつ た の で, Lipidの 関 与 は あ ま りな い と考 え られ る. Lipase処 理 で の輝 度 の 低 下 は, 細胞 に対 す る作 用 に よ る二 次 的 な もの で, これ と同 様 な こ とが核 酸 分 解 酵 素 に つ い て もい え る. ジ メチ ル ス ル ホオ キ シ ド処 理 でT抗 原 の砂 状 変 化 が み られ るが, これ も細 胞 の膜 構 造 の変 化 の た め の二 次 的 な 変化 で あ るの か, この 実 験 か らは 不 明 で あ る. Try psin処 理 で もT抗 原 が形 態 的 に確 認 出来 る とい う こ とか らT抗 原 の 主 体 は 蛋 白質 で あ る と して も, 抗 原 決定 基 は 別 の もの と推 定 出 来 る. 過 ヨウ度 酸 処 理 で螢 光 像 が完 全 に消 失 す る点 か ら決 定 基 に は糖 が 関係 して い る もの と考 え られ る. しか し, 過 ヨウ度 酸 は 蛋 白質 に対 して も長 時 間 作 用 させ た 場 合 多 少 作 用 す る とい われ て い る. 糖 質 分 解 酵 素 処 理 で輝 度 の低 下 と螢光 像 の砂 状 変 化 が み られ る が, これ らの酵 素 は酢 酸 緩 衝 液 を溶 媒 と して お り, 緩 衝 液 自体 で も影 響 が 出 て い る こ とか ら, 酵 素 自体 の作 用 で あ る か否 か は早 急 に結 論 を出せ な い. しか し, Lactose に よ る阻 止 が 起 る点 か ら して, 抗原 決 定 基 にLactose類 似 構 造 の糖 が 関与 して い る もの と推 定 され る. Lactose が決 定 基 に 関 与 し て い る とす る と, β-Glucosidaseで は な く β-Galactosidaseの 作 用 を 受 け な けれ ば な ら な い が, β-Galactosidaseに つ い ては 実 験 を行 なつ て い な い. ま た β-Glucosidaseに β-Galactosidaseの 混 入 も考 え ら れ る が, こ の点 不 明 で あ る の で, Lactoseと 言 うよ り も 糖 が 関 与す る と考 え る方 が 良 い で あ ろ う. ま たTrypsin な どに よ る処 理 でT抗 原 の特 異 螢 光 像 の形 態 的変 化 は み られ な い が, 螢 光 輝 度 の低 下 が か な り顕 著 で あ つ た こ と か ら, 蛋 白質 を根 幹 と して い る こ とは ま ち が い な い事 実 と考 え られ る. 以 上 の こ とか らT抗 原 は少 な く と も蛋 白 質 を根 幹 と し て, 決 定 基 に糖 が 関 与 して い る もの で な い か と推 定 され る. 謝 辞 稿 を終 る に の ぞみ, 御 指 導 と御 校 閲 を賜 つ た東 大 医 科 研 山本 郁 夫 教 授, 川 村 明義 助 教 授, ま た 内 地 留 学 の 機 会 を与 えて 頂 い た三 共 株 式 会 社 中央 研 究 所 長 砂 川 玄 俊 博 士 に心 か ら 感 謝 の意 を表 しま す. ま た, 終 始, 御 指 導, 御 助 言 を頂 き ま し た東 大 医科 研 細 胞 化 学研 究 部積 田 享 教 授, 免 疫 学 研 究 部川 島豊 作 博 士 をは じめ, 御 協 力 下 さつ た免 疫 学 研 究 部 の諸 氏 に深 く感 謝 す る と共 に, 御 鞭 撻 頂 い た予 研 下条 寛 人博 士, 山 本 弘 史 氏 に も深 く感 謝 の 意 を 表 し ます. 本 研 究 の研 究 費 の 一 部厚 生 省 科 学 研 究 費 に よつ た.
Summary
In this paper, an immunohistochemical
study on
the tumor antigen (T) induced by adenovirus type
12 infection
to hamster
embryo
cells (HaE) in
vitro was explored by the use of immunofluores
cence technique.
The infected cells were subjected
to observe any antigenic alteration of T antigen
stained with fluorescein
isothiocyanate
conjugated
anti-T antigen hamster
antibody
after treatment
of those cells with the following various reagents.
The antigenicity
of T antigen
was somewhat
deteriorated
by treatment
with both proteolytic
and carbohydrate-digesting
enzymes and completely
abolished
with sodium periodate,
phenol, deoxy
cholate,
and sulfuric acid.
However, it resisted
to treatment
with formaldehyde
and organic sol
vents
such
as
ethyl-ether,
carbontetrachloride
chloroform, while some hydrophilic
organic sol
vents, for instance,
acetone,
methyl- and ethyl
alcohol acted somewhat deterioratively.
Interestingly,
preabsorption of the conjugate with
lactose resulted in inhibiting the positive fluores
cence in T antigen
From these results,
an assumption
was made
that adeno-12 induced T antigen
in HaE would
mainly consist of a protein which contains a part
of polysuccharide
like lactose as an immuno
determinant
group.
文
献
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50 (330) 三 沢 洋 写 真 説 明 HaE2代 培 養 細 胞 にAd-12を 感 染 後24∼72時 間 の 標 本 . 抗Ad-12 T標 識 抗 体 使 用 に よ る 螢 光 抗 体 直 接 法. 図3 図4 対 照, 核 内 及 び 細 胞 質 にfleck様 のT抗 原 が み ら れ る. 図5 乾 燥 状 態 (dry) で の 加 熱 (70℃ 30分) 螢 光 像 の 変 化 は み られ な い. 図6 湿 潤 状 態 (wet) で の 加 熱 (70℃ 30分) fleck様 の 特 異 螢 光 像 は 消 失 し て い る. 図7 1N硫 酸 (室 温10分) 処 理, 図6と 同 様 に 特 異 螢 光 像 は 消 失 し て い る. 以 上 「前 処 理 」 図8 1N硫 酸 (室 温10分) 処 理, 輝 度 の 低 下 は 少 な くfleck様 のT抗 原 が み ら れ る. 「後 処 理 」 図9 10%ホ ル マ リ ン (室 温10分) 処 理, 螢 光 の 変 化 は み られ な い. 図10 DNase (1mg/ml 37℃ 30分) 処 理, 螢 光 像 の 変 化 (fleck→ 凝 集 状) が み ら れ る. 図11 RNase (1mg/ml 37℃ 30分) 処 理, 輝 度 の 低 下 と 螢 光 像 の 変 化 が み られ る. 図12 Trypsin (100γ/ml室 温5分) 処 理, こ わ れ た 細 胞 内 にfleck様 のT抗 原 が み られ る. 図13 0.1M NaIO4 (室 温30分) 処 理, fleck様 の 特 異 螢 光 は 完 全 に 消 失 し, 細 胞 の 自 己 螢 光 が 強 く な つ て い る. 以 上 「前 処 理 」 図14 0.1M NaIO4 (室 温30分) 処 理, 螢 光 輝 度 の 低 下 は あ つ て もfleck様 の 特 異 螢 光 は み ら れ る .「後 処 理 」 図15 β-Glucosidase (1mg/ml 37℃ 30分) 処 理, 螢 光 像 の 砂 状 変 化 が み られ る. 「前 処 理 」
