SHINKAI6500 / YOKOSUKA YK06-07
Cruise Report By On Board Scientists
June 21 (Otaru) – 25 (JAMSTEC, Yokosuka), 2006
「日本海奥尻海嶺バクテリアマット堆積物における硫黄及び
その化合物を呼吸に用いる微生物の網羅的培養」
はじめに 日本は海に囲まれた国であり、海なくして 日本はなく、海なくして日本を語れない。ま た、日本は地震の国でもある。これは日本を 複雑に取り巻くプレート運動の作用に他なら ないが、日本近海底にはこれに因する低温湧 出帯(cold seep)と呼ばれる微生物生態系が発 達したスポットが存在する。これは、地中よ り湧き上がる水素や二酸化炭素、硫黄化合物、 ミネラルなどなどが最初のエネルギー源とな り微生物がメタンを作り（非微生物由来のメ タンの場合もある）、嫌気的なメタン生成が起 こり、更に上部で硫黄酸化・メタン酸化が起 こることで、本来貧栄養な海底環境にも生物 のオアシスが出来上がる。 1993 年 12 月に起こった北海道南西沖地震 は、かつてない速さで押し寄せた津波により 甚大な被害を出した。その震源となったのが 奥尻海嶺に存在する活断層であり、地震以後 行われた JAMSTEC を中心とする海底調査に より、奥尻海嶺における低温湧出帯が確認さ れ、バクテリアマット帯が発見された(Arakawa
et al., 2004; Arakawa et al., in press) 。 本
バクテリアマット堆積物はその後の微生物生 態学的解析から、ANME と呼ばれる古細菌の 存在が確認されたが、同じ活断層上のバクテ リアマットでも生態系の発達が異なり、非常 に興味深いサイトである。バクテリアマット に見られる微生物の多様性の差は何に起因す るのか？、ここは今将に微生物オアシスが発 展途中のところなのだろうか？、先に起こっ た地震等々はどのように影響するのか？など など本サイトにおける低温湧出帯の微生物生 態学的興味は尽きない。 低温湧出帯において、非常に重要な生態学 定位置をしめる ANME 古細菌群と硫酸塩還元 菌のコンソーシアの存在は、ごく最近の研究 成果である(Hinrichs et al. 1999; Boetius et al. 2000)。それまでは、嫌気的に生成されたメタ ンをいったい誰によって消費されているのか 大きな謎であった。この ANME 古細菌群はそ の集積培養に関してはいくつか報告があるも のの、現在なお未培養な微生物群である。低 温湧出帯および熱水噴出口で優占的に存在す るε-Proteobacteria に属する硫黄酸化細菌は、 JAMSTEC らのグループにより近年ようやく 純粋分離された分類群である(Takai 2003)。こ のように、まだまだ未培養な微生物群は海底 環境にあまたと存在し、微生物研究者により 将に海底から日の目を見ることを待ちわびて いるのである。そもそも、現在に至るまで、 分離培養可能な微生物（Prokaryote）の割合は 全微生物の 0.5%以下に過ぎず、海洋環境から 分離可能な微生物の割合は 0.1%に過ぎない (Schleifer 2004)。遺伝子解析ツールの発達に より、微生物生態系全体を解析することは可 能になったが、実際には その一端の微生物を 知るのみで、その一端の微生物による応用研 究を行っていることに気づく。微生物の分離 培養は古くから行われてきたが、今後も微生 物分離学者の手で弛まぬ努力を続けねばなる まい。微生物の分離培養はその微生物資源の 開発に他ならない。 奥尻海嶺をはじめとする低温湧出帯は新規 微生物の宝庫であり、微生物資源を開拓する のに絶好なサイトである。一方で、本研究に はしんかい 6K チームをはじめとする熟練した 技能や JAMSTEC を中心とする深海研究経験 なくして行うことは出来ない。新参者の集ま りであった本航海を実施するにあたり、手を 貸して頂いた様々な人に感謝するとともに、 海底研究という興味の尽きないフィールドを 与えくれた研究者らに感謝したい。 森 浩二 Arakawa, S. et al. Mar. Biotechnol. 6: S185, 2004.
Arakawa, S. et al. Extremophilies, in press. Boetius, A. et al. Nature 407: 623, 2000. Hinrichs, K.-U. et al. Nature 398: 802, 1999. Schleifer, K.-H. Syst. Appl. Microbiol. 27: 3, 2004.
Takai, K. et al. FEMS Microbiol. Lett. 218: 167-174, 2003.
目次
はじめに Preface 2
目次 Index 3
1. 調査の目的 Purpose 4
2. 乗船者リスト List of crews
2.1. 乗船研究者 On board scientific group 6
2.2. 6K オペレーションチーム 6K operation team 7
2.3. よこすか船員 Yokosuka crew 7
3. 調査
3.1. 調査海域 Survey area and map 8
3.2. Ship log 9
3.3. Dive log
3.3.1. Dive#960 and payloads 10
3.3.2. Dive log 10
3.3.3. Event mark list 12
3.3.4. Site map of the diving point 13
3.3.5. Track of dive#960 14
3.3.6. CTDO profiles of dive#960 15
4. Preliminary results on board and future plans
4.1. 広域サーベイによる海底図 Site map based on the survey 16
4.2. Dive#960 概要 Dive#960 summary 17
4.3. Sample list and distribution 18
4.4. 硫黄酸化細菌、メタン酸化細菌及び硫酸塩還元菌の分離培養（森）
Isolation of sulfur-oxidizing, methane-oxidizing and sulfate-reducing microorganisms (by Mori) 20 4.5. 日本海奥尻海嶺バクテリアルマットからの新規嫌気性微生物の分離・培養（飯野）
Isolation of novel anaerobic microorganisms (by Iino) 21 4.6. Culturing biodiversity of aerobic and facultatively anaerobic bacterial biodiversity of
deep sea marine sediment (by Khan) 22 4.7. Microbial diversity of the microbial mat sediments and isolation trial of novel piezophilic microorganisms from the Shiribeshi Trough at the northeast Japan Sea (by Kato) 23 4.8. 日本海奥尻海嶺バクテリアマット堆積物に生息する新規嫌気性微生物の分離培養
Isolation of novel anaerobic microorganisms (by Hattori) 24 4.9. 日本海奥尻海嶺バクテリアマット堆積物からの新規微生物の分離培養
Isolation of novel microorganisms (by Mochimaru) 25
1. 調査研究の目的 北海道西に位置する日本海奥尻海嶺は、少 なくとも過去２回（2001 年の YK01-06、2003 年の YK03-05）、JAMSTEC らにより生物・微 生物学的調査が行われた。本調査海域は冷水 湧出帯（cold seep）であり、豊富な栄養源に より発達したバクテリアマットが多数確認さ れている。両調査において、採取した堆積物 を対象に遺伝子抽出を行い、16S rRNA 遺伝子 を指標とした微生物の群集構造解析が実施さ れた。2001 年に採取した堆積物からは、系統 学的にδ-Proteobacteria に属する硫酸塩還元 菌と考えられる絶対嫌気性細菌の存在が確認 された。一方、2003 年に採取した堆積物から は 、 こ の 硫 酸 塩 還 元 菌 群 に 加 わ り 、 γ -Proteobacteria とε--Proteobacteria に属する菌 群が遺伝子レベルで新たに検出された。系統 学的に、おそらくこれら菌群は硫黄酸化細菌 であると推測できる。硫黄酸化細菌と考えら れる本菌群の出現は、何らかの理由により現 場が還元的な環境から酸化的な環境へ推移し た、又は推移しつつあることが考えられる。 このことから、本海域の継続的な微生物解析 により、数年スケールでの微生物群集構造の 推移が観察できるものと思われる。奥尻海嶺 は、短期間での微生物群集構造変移が観察で きる極めて希有な海域といえる。環境のささ いな（？）変化が与える微生物の栄枯盛衰を 観察できる可能性があり、非常に興味深い。 一方で、遺伝子を用いた微生物解析は、所 詮未知微生物が存在するという事実と系統分 類学的な位置情報が得られるのみであり、そ の微生物がいかなる性状を持っているかは分 離培養を行わなければ分からない。分離した 微生物の性状を調べることで、現場環境を推 測するというフィードバックも期待できる。 さらには、分離した微生物を用いた応用研究 も可能である。 堆積物を含む海洋環境において、硫酸塩還 元菌と硫黄酸化細菌の存在とその重要性は古 くから認識され、分離培養が行われてきた。 硫酸塩還元菌については、低温環境では系統 学的にδ-Proteobacteria に属する硫酸塩還元 菌が古くから研究され、熱水噴出口周辺の高 温環境では古細菌（Archaeoglobus 属）が分 離されている（花田＆森, 2005）。これ以外に も 、近 年分 離 した 好 熱細 菌（Oceanithermus 属）も硫黄を嫌気的に還元していることがわ かり（Mori et al., 2004）、海洋微生物の硫黄や 硫黄化合物還元ポテンシャルは高く、その活 性を持つ微生物の多様性は今後広がっていく であろう。一方、硫黄酸化細菌についても古 くから研究されてきているが、近年、硫黄酸 化能を持つとして認識又は推測された微生物 群が多い。系統学的にγ-Proteobacteria に属 するいくつかの未培養微生物群において硫黄 酸化能を持つことが示唆され、また、系統学 的にε-Proteobacteria に属する数年前まで未 培養であった微生物群の多くが硫黄酸化細菌 であったことは非常に興味深い（Takai et al., 2003）。これらの事実から、今後、海洋で検出 される未培養の微生物群が硫黄酸化細菌とし て分離される可能性は非常に高いと考えられ る。
Fig. 1 The ecology of cold seep environment また、低温湧出帯は硫黄酸化細菌や硫酸塩 還元菌以外にも、メタン酸化細菌、嫌気的メ タン酸化古細菌(ANME cluster)、メタン生成古 細菌が複雑に絡み合うことで成り立つ微生物 生態系である。その概略を Figure1 に示す。奥 尻海嶺の低温湧出帯も特定のバイオマット帯 より採取した堆積物中に、嫌気的メタン酸化 微生物の存在が報告されている(Arakawa et al.,
2006)。荒川らの報告では、この嫌気的メタン 酸化が強く示されている堆積物には、様々な 微生物の存在が確認され、本堆積物より様々 な微生物を網羅的に培養することは、この生 態系を解析することに有意義であるばかりで なく、新たな遺伝資源を獲得する上も重要で ある。深海底を対象とした微生物の分離培養 は、全体的な数からすればほんの一握りであ り、まだまだ未開拓な分野である。このため、 様々な分離培養の手法でもって網羅的に培養 することは、深海底の微生物を評価するうえ で重要であろう。分離した微生物は、深海底 の高圧環境由来微生物であるため、産業上、 有用微生物である可能性が高い。 本調査では、 (1) 遺伝子を指標とした群集構造解析により本 海域の群集の変移を検証する。 (2) 硫酸塩還元菌と硫黄酸化細菌を中心に、 様々な微生物の網羅的な培養を試みる。 以上の２点を目的として行う。 参考文献
Arakawa, S. et al. Extremophiles (in press).
Mori, K. et al. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1561-1566, 2004.
Takai, K. et al. FEMS Microbiol. Lett. 218: 167-174, 2003.
花田智 ＆ 森浩二. 海の研究(Oceanography in Japanese) 14: 327-335, 2005.
2. 乗船者リスト
2.1. On board scientific group
森 浩二 Koji Mori (首席) (独)製品評価技術基盤機構 研究職員 飯野 隆夫 Takao Iino (副首席) (独)製品評価技術基盤機構 研究職員 加藤 千明 Chiaki Kato (独)海洋研究開発機構 グループリーダー
カーン Shams Tabrez Khan (独)製品評価技術基盤機構 研究職員 服部 聡 Satoshi Hattori 山形大学農学部 助手 持丸 華子 Hanako Michimaru (独)産業技術総合研究所 技術研修員 福本 健浩 Takehiro Fukumoto 近畿大学工学部 学生 池田 恵理子 Eriko Ikeda 日本大学文理学科 学生 伊藤 麻貴 Maki Ito 日本海洋事業（株） 観測技術員
2.2. 6K operation team 今井 義司 司 令 櫻井 利明 副司令 佐々木 義高 一等潜技士 牧 哲司 一等潜技士 川間 格 一等潜技士 大野 芳生 一等潜技士 小椋 徹也 二等潜技士 松本 恵太 二等潜技士 植木 博文 三等潜技士 千田 要介 三等潜技士 齋藤 文誉 三等潜技士 大西 琢磨 三等潜技士 2.3. Yokosuka crew 齋藤 房夫 船長 増島 宏明 一等航海士 出合 泰夫 二等航海士 高尾 淳 三等航海士 梶西 喜代徳 機関長 金田 和彦 一等機関士 栄村 三郎 二等機関士 儀武 大輔 三等機関士 渡瀬 諭 電子長 北村 勝利 二等電子士 久木 康吉 甲板長 中村 金吾 甲板手 細川 清次 甲板手 金田 潔 甲板手 山本 修一 甲板手 大端 正則 甲板手 吉野 勇希 甲板手 村瀬 弘亮 甲板員 高橋 英樹 甲板員 松田 誠一 操機長 大石 洋之 操機手 三浦 浩三 操機手 田中 佐幸 機関員 山岡 義典 機関員 田中 将貴 機関員 宮内 武志 司厨長 田中 信介 司厨手 永野 和則 司厨手 高津 忠幸 司厨手 阿部 崇裕 司厨手
3. 調査
3.1. Survey Area and Map
日本海奥尻海嶺の調査海域を Figure 3 に示 す。潜航場所は後志海山の南南東に位置する 南後志海丘の東端であり、過去の調査 (YK03-05)において、微生物マット帯が確認され、そ の後の微生物学的解析から低温湧出帯として の活性が高いことが示された地点である。
Fig. 3. Map of the sampling site at the northeastern Japan Sea. M1 site indicates the diving point (Dive 960; 43°20.24 N, 139°39.85 E, 2960 m depth).
3.2. Ship log
Date Time Comment.1 position Position/Weather/Wind/ Seacondition(Noon) 21,Jun,06 14:00 研究者乗船完了 06/2112:00(JST) 14:45 6Kチームとのミーティング 43-12'N141-00'E 14:50 小樽港小樽第2埠頭8号岸壁出航 43-12'N141-00'E Overcast 15:30-16:30 船内生活、船内案内 NE-2,LightBreeze 18:30 研究者ミーティング 19:00 調査海域着 19:13 XBT計測 19:42 MBES事前調査及び広域サーベイ実施 22,Jun,06 9:57 Dive#960潜航開始 06/2212:00(JST) 11:32 着底 2967m 43-20'N139-40'E 15:53 離底 2960m Overcast 17:00 浮上 SW-5,FreshBreeze 17:23 揚収完了 SeaSlight 23,Jun,06 00:12-2:43 MBES海底地形調査実施 06/2312:00(JST) 2:45 横須賀向け発航 41-21'N140-17'E Cloudy NNW-3,GentleBreeze SeaSmooth 24,Jun,06 横須賀向け回航中 06/2412:00(JST) 13:30 首席研究員による船内セミナー 37-13'N141-32'E BlueSky ENE-2,LightBreeze SeaRippledCalm 25,Jun,06 8:30 JAMSTEC入港 関係者下船
3.3. Dive log
3.3.1 Dive #960 and payloads
観察者 森浩二
潜水船船長 佐々木 義高
船長補佐 小椋 徹也
ペイロード MBARI core sampler (50 cm type) x3 MT core sampler x2 Sterile tube sampler x2 Niskin bottle x2 Kumade Sample box 3.3.2. Dive log Time (JST) X Y Depth (m) Heading (Deg) Description 10:09 -190 920 500 10:21 -190 930 190 航走開始 10:32 -470 910 1500 230 10:42 -720 760 1973 10:44 2025 ニスキン採水を行った 10:56 2502 102 10:59 -810 780 2563 142 11:19 2880 122 ライトON 11:29 2967 346 白い何かがあった 11:31 -940 820 2967 350 着底 水温0.2℃ 11:38 2965 271 白いU字のものがあった 11:41 -940 780 2962 291 11:46 -950 720 2948 319 11:49 2947 001 6個の白いなにか 11:52 2942 000 土が黒くなった 11:53 2942 358 地形がボコボコ 11:56 2940 000 岩があった 11:57 -870 690 2939 000 2つの岩
11:59 2937 000 2つ小さめの岩 12:02 2933 000 二つの隆起物 12:05 2927 045 海底に黒い斑点があった 12:06 -790 710 2928 55 12:08 2929 61 小さな石ころがごろごろとあった 12:12 2940 74 白い固形物が１つあった 12:14 -770 810 2943 74 12:18 2945 016 黄色や白の固形物がいくつか存在 12:19 2945 015 ぼこぼこの地面 12:20 2945 050 細いピンクの生物 12:21 -740 850 2946 068 12:23 2949 088 小さな黒い斑点がいくつかあった 12:25 2953 091 ミミズのようなくねった物が浮いていた 12:26 2959 051 赤白いモヤがかかっていた 12:29 -740 940 2960 011 12:30 2959 ミミズのようなものが浮いていた 12:31 2959 001 画面右上に白い線の物体 12:34 2958 000 白い円形のマットのようなものがいくつか(視認) 12:38 2955 001 円形のマット 12:39 -660 930 2955 000 12:44 -620 920 2959 350 12:54 2964 208 白い固形物が浮遊していた 12:55 2964 202 ごつごつとした地形 12:56 -560 860 2964 194 12:57 2964 195 白い物が地面にいくつか存在している 13:00 -576 857 2954 198 MBARI(赤)使用-マットなし：Cr 13:10 2961 265 ピンクのウロコムシ 13:13 -580 820 2960 299 13:18 2954 岩 13:21 -590 750 2951 267 13:24 -600 720 2916 300 バクテリアマット?-無線での報告 13:32 2953 007 バクテリアマットー無線にて、視認 13:34 2955 027 バクテリアマット映像にて確認 13:39 2556 327 ニスキン 13:44 2956 316 13:45 2956 MBARI-白-マット上：Cw 13:54 2956 MTコアー赤ーマット上：Mr 14:01 2956 くまで小 14:12 -540 740 2956 332 14:28 -530 690 2939 085 14:32 -560 770 2951 125 14:38 -580 740 2954 100 14:43 2959 031 ピンクのウロコムシ 14:48 -570 780 2964 026 14:54 2960 329 バクテリアマットー無線にて、視認 14:57 2960 002 バクテリアマット 15:01 2961 352 一面バクテリアマット 15:02 2961 337 バクエイアマットの中に黒い物が混ざっていた 15:04 2961 339 MBARIの黒：Cbk 15:08 2961 338 ピンクの粒が浮遊していた 15:14 2961 316 黄色のMTを差し込む-マット上：My 15:19 -510 750 2961 315 15:26 2961 343 黄色の無菌採泥：Sy 15:29 2961 326 青色の無菌採泥：Sbl
15:34 2961 327 泥あさり、くまで小
15:46 2961 007 北に向かって航走開始
15:52 -460 760 2961 011 離底(17:00浮上予定)
3.3.3. Event mark list
ORIGIN (XY<->LATLON CONVERT) LAT 43°20.5000’N LON 139°39.3000’E XY ORIGIN ((X, Y)=(0, 0)) LAT 43°20.5000’N LON 139°39.3000’E
NO. DAY TIME LAT LON X Y
1 2006-06-22 10:00:00 43°20.2428’N 139°39.8496 -476.1 742.6 Landing target 2 2006-06-22 10:44:00 43°20.0910’N 139°39.8496 -752.2 742.6 Sampling: Niskin (red)
D=2000 m
3 2006-06-22 11:32:00 43°19.9934’N 139°39.9063 -937.9 819.2 Landing D=2967 m
4 2006-06-22 13:04:00 43°20.1891’N 139°39.9340 -575.6 856.7 Sampling: MBATI core (red) D=2965 m
5 2006-06-22 13:45:00 43°20.2069’N 139°39.8499 -542.6 743.0 Finding bacteria mat Sampling: Niskin (yellow) D=2956 m
6 2006-06-22 13:55:00 43°20.2069’N 139°39.8499 -542.6 743.0 Sampling: MBARI core (white) D=2956 m
7 2006-06-22 14:02:00 43°20.2069’N 139°39.8499 -542.6 743.0 Sampling: MT core (red) D=2956 m
8 2006-06-22 14:12:00 43°20.2069’N 139°39.8499 -542.6 743.0 Sampling mud by dustpan D=2956 m
9 2006-06-22 15:19:00 43°20.2238’N 139°39.8555 -511.3 750.6 Sampling: MBARI core (black) Sampling: MT core (yellow) D=2961 m
10 2006-06-22 15:35:00 43°20.2238’N 139°39.8555 -511.3 750.6 Sampling: Sterile core (x2) D=2961 m
11 2006-06-22 15:46:00 43°20.2238’N 139°39.8555 -511.3 750.6 Sampling mud by dustpan D=2961 m
3.3.4. Site map of the diving point
Y K 0 6 -0 7 C ru is e R ep o
14
3 .3 .5 . T ra c k o f d iv e # 9 60Y K 0 6 -0 7 C ru is e R ep o
15
3 .3 .6 . C T D O p ro fil e s o f d iv e # 9 604. Preliminary results on board and future plans 4.1. 広域サーベイによる海底図
4.2. Dive #960 概要 10:00 に潜航開始し、水深 200 m で水温 4°C となり、水深1000 m で水温 0.2°C に達した。 以降、終始水温は0.2°C であった。水深 2005 m にてニスキン（赤）による採水を行った後、 11:32 に水深 2967 m に着底した。Photo.4.2.1 が示すように、海底潜航中は終始、ぼた雪大 の浮遊物が漂い、非常に視界が悪かった。ま た、目に見える生物としては、小さなエビの 他に、堆積物が舞い上がった際にゴカイのよ うなものが確認できたが、それ以外は全く観 察できなかった。
Photo.4.2.1. Floating matters on the seafloor 着底地点は過去の潜航(YK03-05)でバイオマ ット帯が確認された M1 サイトより南 400 m ほどの地点である。2003 年の YK03-05 の調査 時よりバイオマット帯が拡大している可能性 を考えて、本地点よりバイオマット帯を探し ながら M1 サイトを目指した。活断層帯にバイ オマット帯が広がっていることを期待したが、 発達したバイオマットを発見することはでき なかった。13:04 に弱いバクテリアマット帯が 見受けられたため、MBARI 式柱状採泥器（赤） にて採泥を行った（船上で採取した堆積物を 観察したがバクテリアマット帯で特有に見ら れる硫化水素臭の伴った堆積物は確認できな かった）。 １本目の採泥後、M1 サイトを目指して北上 を再開し、13:35 に発達したバクテリアマット 帯を視認した(Photo.4.2.2.)。本地点は、M1 サ イトより50 m ほど南西に位置する。本地点で、 ニスキン（黄）、MBARI 式柱状採泥器（白）、 MT 式柱状採泥器（赤）による試料採取を順次 行い、最後に柱状採泥を行ったことで掘り下 がった箇所を中心に「ちりとり」による採泥
Photo.4.2.2. Microbial Mat
を行った。堆積物の上部を覆っている白色の マット部分は非常に飛散しやすく、その直下 から真っ黒な堆積物が出現した。また、堆積 物は非常に抵抗が少なく、柱状採泥器が容易 に突き刺さった。柔らかく突き刺さったあと は非常に堅く、それより先、深く刺すことは 出来なかった。この傾向はこの後に行った採 泥においても同様であった。 採泥の後、バクテリアマットがどこまで広
がっているか確認するためマットに沿って潜 航したが、14:30（約 10 分後？）、マット帯が 確認できなくなり、視界不良もあり、マット 帯を見失った。右往左往した結果、15:00 に前 採泥地点の東 50 m ほどの地点で再びバクテリ アマット帯を確認し、15:08 より MBARI 式柱 状採泥器（黒）、MT 式柱状採泥器（黄）によ る採泥を順次行った。この後、無菌採泥器（青 及び黄、同じ箇所にて使用）により白いマッ ト部分の採取を行った（Photo.4.2.3.）が、飛 散しやすいため多く採取することは不可能で あった（船上にてある程度採取できたことを 確認した）。最後に「ちりとり」による採泥を 行い、15:46 に作業を終了し、バイクテリアマ ット帯を確認しつつ北上した。15:52 に地形的 に急斜面に突き当たる感じでマット帯がとぎ れた（おそらく M1 サイトを中心にバクテリア マット帯はせいぜい直径 100 m 程度であった 模様）。全ての作業を終了し、15:53 離底した。
4.3. Sample list and distribution
Sample ID LAT.LON & Depth Description Distribution Photo. Cr 43°19.9934’N MBARI core (red). C. Kato et al.:
139°39.9063’E Control core sediments. Cr-3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 (10 g) 2965 m Gray, brown, oxygenated. for DNA extraction.
K. Mori: Cr-3, 0 cm Cr-3 (10 g) Cr-4, 5 cm for DNA extraction. Cr-5, 10 cm Cr-6, 15 cm Cr-7, 20 cm Cr-8, 25 cm Cr-9, 30 cm Cr-10, 35 cm (depth from surface)
Cw 43°20.2069’N MBARI core (White). C. Kato et al.: 139°39.8499’E Mat core sediments. Cw-7, 8, 9, 10 (10 g) 2956 m Surface mat. for DNA extraction
Middle black sediment, K. Mori: and H2S smell. Cw-7, 8, 10 (1 g)
Bottom clay. for cultivation; Cw-7
Cw-7, 0 cm (10 g) for DNA extraction. Cw-8, 5 cm T. Iino:
Cw-9, 10 cm Cw-10 (2.5 g) Cw-10, 15 cm for cultivation. (depth from surface) S. T. Khan:
Cw (mix) for cultivation. S. Hattori: Cw-7, 10 (2.5 g)
for observation and cultivation. H. Mochimaru:
Cw-8, 10 (6 g)
for observation, cultivation, and DNA extraction.
Cbk 43°20.2238’N MBARI core (Black) C. Kato et al.:
139°39.8555’E Mat core sediments. Cbk-6, 7, 8, 9, 10 (10 g) 2961 m Surface mat. for DNA extraction.
Middle black sediments, K. Mori:
and H2S smell. Cbk-6, 7, 10 (1 g)
Bottom clay (?). for cultivation. S. Hattori: Cbk-6, 0 cm Cbk-6, 10 (2.5 g)
Cbk-7, 5 cm for observation and cultivation. Cbk-8, 10 cm H. Mochimaru:
Cbk-9, 15 cm Cbk-6 (6 g)
Cbk-10, 20 cm for observation, cultivation, (depth from surface) and DNA extraction.
Mr 43°20.2069’N MT core (Red) K. Mori:
139°39.8499’E Mat core sediments. Surface layer (3 g) 2956 m Surface mat. for observation.
Middle black sediments, S. Hattori: and H2S smell. Middle layer
for observation and cultivation. H. Mochimaru:
Surface layer
for observation, cultivation, and DNA extraction.
My 43°20.2238’N MT core (Yellow) 139°39.8555’E Mat core sediments. 2961 m Surface mat.
Middle black sediments, and H2S smell.
Stopper was problem, then the sediment was fallen!!
Sy 43°20.2238’N Sterile tube (Yellow) C. Kato:
139°39.8555’E Mat sediments, and H2S smell. for cultivation of piezophilic
2961 m microorganisms at 55 MPa, 4°C.
Sbl 43°20.2238’N Sterile tube (Blue) C. Kato:
139°39.8555’E Mat sediments, and H2S smell. for cultivation of piezophilic
2961 m microorganisms at 55 MPa, 4°C.
Stocked in liquid nitrogen.
Nr 43°20.0910’N Niskin Seawater (Red) K. Mori:
139°39.8496’E Clear seawater. 1 L for cultivation and
2000 m DNA extraction.
Ny 43°20.2069’N Niskin Seawater (Yellow) K. Mori: 139°39’8499’E Clear seawater slightly 1 L for cultivation and
2956 m containing floating matters DNA extraction. collected just above mat
sediments.
Sample 43°20.2069’N Mat sediments obtained by C. Kato: box 139°39.8499’E dustpan sampler. a few worms
2956 m Mat sediments collected at for DNA extraction. and 2 points, and H2S smell.
43°20.2238’N
139°39.8555’E All samples were used for 2961 m organisms sorting.
No clams and snails. A few worms (?). 4.4. 硫黄酸化細菌、メタン酸化細菌及び硫酸 塩還元菌の分離培養（森） 4.4.1. 目的 低温湧出帯では、嫌気的環境にメタンを嫌 気的に資化する ANME と呼ばれる共生系が存 在する。この嫌気的な環境の上部には、この 共生に関与する硫酸塩還元菌の生成する硫化 水素やメタンを資化する硫黄酸化細菌やメタ ン 酸 化 細 菌 が 存 在 す る 。 遺 伝 子 指 標 （16S rDNA）を用いた過去の微生物学的調査により、 分 類 学 的 に δ Proteobacteria 、 γ -Proteobacteria 及びε--Proteobacteria に属する 菌群が見出されており、系統学的な類縁菌情 報から、それぞれ、硫酸塩還元菌、硫黄酸化 細菌、メタン酸化細菌であると推察できる。 これら微生物群はその系統学的位置づけや環 境情報から、その主立った性状を推察できる のみであり、分離培養によりこれらを明らか にすることは低温湧出帯を理解するうえで非 常に有意義である。また、いったん純粋分離 が確立すれば、その微生物資源を利用した応 用研究も可能である。また、奥尻海嶺に見ら れる低温湧出帯では、相模湾等々の低温湧出 帯で観察される貝類をはじめとする大型生物 の存在が確認されておらず、有機物が希少で あることから、より低温湧出帯に特異的な微 生物が採取できる可能性を秘めている。また、 貝類などに共生するタイプでない硫黄酸化細 菌やメタン酸化細菌がfree living な状態で生育 していることも、これら微生物の分離培養を 行ううえで、奥尻海嶺の低温湧出帯は優位で ある。 本研究では、新規微生物の獲得を目指し、 バクテリアマット帯より採取した堆積物を用 いて硫黄酸化細菌、メタン酸化細菌及び硫酸
塩還元菌の分離培養を試みた。 4.4.2. 方法 Table 4.4.2.に示した試料を用いて分離培養 を行った。堆積物試料は、出来るだけ低温状 態及び嫌気状態で扱い、メタン酸化細菌用培 地、硫黄酸化細菌用培地（電子受容体：硫化 ナトリウム又はチオ硫酸塩）、硫酸塩還元菌用 培地（電子受容体：水素又は乳酸塩）に接種 した。培地はすべて液体のものを使用し、堆 積物試料は 105 までの希釈系列を作製し、4°C にて培養した。
Table 4.4.2. Sample for cultivation Cw-7, 8, 10 MBARI sediments (White) Cbk-6, 8, 10 MBARI sediments (Black)
4.4.3. 結果及び将来計画 4°C にて培養を継続中である。微生物の増 殖が目視で確認できれば、増殖した微生物を 観察するとともに 16S rDNA 解析を行う。目 視にて増殖が確認できなかったものについて も１ヶ月程度の培養の後、顕微鏡観察を行い、 微生物増殖の有無を確認する予定である。16S rDNA 解析の結果から目的とする微生物であれ ば、コロニー形成法又は最大希釈法により微 生物の純粋培養化を行う予定である。 4.5. 日本海奥尻海嶺バクテリアルマットから の新規嫌気性微生物の分離・培養（飯野） 4.5.1. 目的 奥尻海嶺は少なくとも過去 2 回（YK01-06 (2001)、YK03-05 (2003)）、海洋研究開発機構 による生物・微生物学的調査が行われた。本 調査海域は冷水湧出帯（コールドシープ）が 観察され、豊富な栄養源により発達したバク テリアマットが多数確認されている。 本研究では、その冷水湧出帯よ り堆積物や 海水などを採取し、過去に遺伝子を指標とし た群衆構造解析により示された硫酸塩還元菌 と硫黄酸化細菌を含む様々な微生物の網羅的 培養を行うことを目的とした。 4.5.2. 実験材料および実験方法
しんかい6500 に装着した MBARI core sam-pler 3 本、MT core samsam-pler 2 本、ニスキン採 水器 2 本、サンプルボックス 1 本、無菌採泥 器 2 本を用いて、後志海山近辺の M1 サイト (Depth=2,961 m)よりバクテリアルマットおよ び水試料を計 10 点採取した。本研究では、海 域 20.2069’N 39.8499’E, Depth=2956 m で採 取したバクテリアルマットを供試試料とした。 本バクテリアルマットの深さ約15 cm 部分（粘 土質状）をシリンジにて採取し、あらかじめ4°C に冷やした嫌気的基礎培地に移植した。この 試料溶液に別の基礎培地を満たした後、アル ミキャップで密栓し、十分に懸濁した。その 後、本懸濁液を各種嫌気培地に 0.5 ml ずつ移 植した。供試培地にはメタン生成古細菌用、 硫酸塩還元菌用など 48 種類の嫌気培地を用い た。移植後、直ちに4°C にて集積培養した。 4.5.3. 実験結果 現在、4°C にて培養中。 4.5.4. 計画 バクテリアルマットを移植した集積培養物 を 1 ヶ月間培養を行う。その後、新しい培養 液に移植し、再度、4°C にて集積培養を行う。 この作業を計 2 回行う。その後、培養物の 16SrRNA シークエンス解析を行い、新規の微 生物が培養できたか解析を行う。新規の微生 物が存在した場合、純粋分離を試みる。純粋 分離した微生物に関しては、詳細な分類学的 諸性質を明らかにする予定である。また、新 規の微生物、希少な微生物、製品評価技術基 盤機構が保有していない微生物が分離できた 場合、当機構に寄託することを希望する。
4.6. Culturing biodiversity of aerobic and facultatively anaerobic bacterial biodiver-sity of deep sea marine sediment (S. T. Khan).
4.6.1. Purpose
Out of an estimated 105 to 106 microbial spe-cies (Tiedje et al., 1994, Allsopp et al., 1995) only a few thousands have been cultured so far (Staley et al., 1989) which makes only a frac-tion (>1%) of the existing microbial diversity (Amann 1995). Inaccessibility to many
habitats such as deep sea is among the plethora of reasons for the abovementioned problem. JAMSTEC kindly provided access to one of such sites. Previous chemical analysis of this site (M1, details provided in material methods) shows a high concentration of methane indicating the presence of methanogenic bacteria (Arakawa et al., 2005). Target of this study however, is to possibly isolate the aerobic bacterial diversity other than methanogens that might be competing with a dominant population of methanogens, or other populations such as methanotrophs and to study culturable biodiversity in a broader sense.
4.6.2. Materials and methods
Samples were collected by Shinkai 6500 (JAMSTEC) from shiribeshi trough at a depth of 2956 m (N 43°20.2069', E 139°39.8499'). Collected sample (Cw) was suspended in sterile pre-cooled (at 4°C) artificial seawater. Serial dilution of the suspended sample was also performed in the same pre-cooled artificial seawater. An aliquot of 100 µl was spread on 8 different following types of medium.
1. Marine agar (DIFCO 2216).
2. DMA: Diluted marine agar (1/10th marine broth in artificial seawater).
3. cDMA (modified DMA). 4. CoDMA (modified DMA).
5. CSA medium (Using polymers as sole
car-bon source).
6. CSAA medium (Polymers as sole carbon source with antibiotics).
7. FA agar (Single carbon source medium) 8. CCTYG medium (medium for CFB enrich-ment)
Plates were incubated at 4°C till the colonies appeared on the medium.
4.6.3. Preliminary results
Colonies have not appeared on any of the test medium so far and it will take some more time. 4.6.4. Future plan
Processing of the sample collected during this cruise: Colonies from the plates will be picked up and purified on a suitable medium and incu-bation temperature. Cell lysates from purified strains will be prepared and 16S rRNA gene will be amplified and sequenced using the standard protocols (Hiraishi et al., 1994). Further related studies will be performed such as polyphasic characterization of phylogenetically new strains etc.
4.6.5. Future proposal
I would like to join the cruise in future if kindly allowed by JAMSTEC again targeting the aero-bic microbial diversity from environments such as sediments from distant locations, or con-taminated marine environment, or marine envi-ronments that are usually inaccessible.
4.6.6. Reference
J. M. Tiedje. et al., (1994). ASM News 60, 524.
D. Allsopp, et al., (1995). MicrobialDiversity and Ecosystem Function (CAB Interna-tional,Wallingford, UK,).
J. T. Staley, et al. (1989). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Williams& Wilkins, Baltimore, MD).
S. Arakawa, et al. (2005). Extremophiles. (ac-cepted).
Amann, R. I. et al. (1995). Microbiol. Rev. 59:143-169.
Hiraishi, A. et al. (1994). J Microbial Methods 30, 145-154
.
4.7. Microbial diversity of the microbial mat sediments and isolation trial of novel piezo-philic microorganisms from the Shiribeshi Trough at the northeast Japan Sea (C. Kato, R. Ikeda & T. Fukumoto).
4.7.1. Purpose
We have performed the microbial diversity analyses of the Mat sediments in 2001 (Araka-wa et al., 2004) and in 2003 (Araka(Araka-wa et al., 2006), and the results suggested that the mat sediments involved ANME-SRB consortium, and the activity looked like more active in cur-rent years. To analyze the microbial diversity sequentially and the microbial structure of the mat sediment, we have joined the YK06-07 cruise (Chief scientist, Koji MORI, NITE), and additionally, we have tried to isolate the novel piezophiles from the mat sediments. This
work was part of the proposal by Koji MORI, and collaboration with YK06-07 group.
4.7.2. Materials and methods
Microbial mat sediments were obtained from the Shiribeshi Trough at the northeast Japan Sea at a depth of 2961 m (43°20.22’N 139°39.86’E) by using the MBARI core and the sterilized sediment samplers. The list of sam-ples was shown in Table 4.7. The samsam-ples were also shown in Photo 4.7, too.
To extract DNA from the sediment samples directly, Sediment DNA Isolation kit (Bio 101 co.) was used according to the manual provid-ed by the manufactory. Piezophiles cultivation was also performed using the pressure vessels, according to the procedure reported by Yanagibayashi et al., 1999, at
MPa and 4°C. (Mostly no atmospheric pressure adapted microorganisms could grow at over than 50 MPa condition.)
Table 4.7. List of the mat sediments used in this experiment.
Sample Description Purpose MBARI core, Control sediment DNA extraction (Cr) Each 5 cm depth, 0-35 cm
MBARI core, Mat sediment DNA extraction (Cw) Each 5 cm depth, 0-15 cm
MBARI core Mat sediment DNA extraction (Cbk) Each 5 cm depth 0-20 cm
Sterilized Mat sediment
sediment (Sy) With MB2216 medium Piezophiles cultivation Sterilized Mat sediment Piezophiles sediment (Sbl) With MB2216 medium cultivation
Photo. Sediment core samples, Cr, Cw, and Cbk, and sterilized sediment samples,
YK06-07 Cruise Report
4.7.3. Brief results
The DNAs were extracted directly from
the MBARI core samples, and stored them in liquid nitrogen condition. The sterilized sediments were pressured to 55 MPa at 4°C with Marine Broth 2216 media (Difco co.), for high-pressure cultivation. Remained sediment samples were stored at –80°C (MBARI core sediments) and liquid nitrogen condition (sterilized sediments).
4.7.4. Future plans
(1) Microbial diversity analysis.
The obtained DNAs will be used as templates for 16S rRNA gene amplification using PCR procedure by the fluorescent PCR primers. The amplified products will be restricted by HhaI, and tRFLP analysis is
performed using ABI DNA sequencer model 3100 (Perkin Elmer/ABI co.). The results will be compared with former data, and discuss the time changing with community structure, and cold seep activities.
activities.
(2) Isolation procedure for piezophiles.
The pressure cultivation stabs will be continu-ously cultured using the DEEPBATH system operated by JAMSTEC at 55 MPa condition, according to the procedure reported by Ya nagibayashi et al., 1999. If cultivable mi-crobes are recognized, then we will try to purify the strain. 16S rRNA genes and a few tax-onomic identification procedures will be per-formed.
4.7.5. References
Arakawa, S., et al. (2004). Mar. Biotechnol., 6, S185-189.
Arakawa, S., et al. (2006). Extremophiles, 10, on line publication.
Yanagibayashi, M., et al. (1999). FEMS Mi-crobiol. Lett., 170, 271-279 . 4.8. 日本海奥尻海嶺バクテリアマット堆積物 に生息する新規嫌気性微生物の分離培養（服 部） 4.8.1. 目的 奥尻海嶺は冷水湧出帯（コールドシープ） が観察される海域であり、バクテリアマット が観察されている。過去に行われた調査にお いて、これらのマットには硫酸還元細菌や古 細菌に由来する遺伝子が検出される等、嫌気 性微生物が生息する環境であると考えられる。 本調査においては、バイオマット中の構成微 生物と推察される硫酸還元菌やメタン生成古 細菌および、嫌気的メタン酸化・硫酸還元共 生系 (ANME/SRB)を対象として、純粋分離株 を取得・解析を行うことを目的とした。 4.8.2. 実験方法： 採取地点は北海道奥尻海嶺の潜航調査海域 (43°20.2428’N 139°39.8496’E)とした。深海調 査船「しんかい 6500」により調査海域内の海 下約 2960m まで潜航し、海底に存在するバク テリアマットから得られた３つのコアサンプ ル（CW, CBK, MTR）を分離源として使用し た。CW コアは上部の黒色層（CW-7）と下部 の粘土層(CW-10)の２つの深度のものを使用し た。CBK コアも同様に上部黒色層（CBK-6） と下 部粘土層 （CBK-10）を 使用した 。MTR コアは黒色層を使用した。CW コアと CBK コ アは滅菌済みの2.5 ml シリンジで採取し、MTR コアは滅菌済みの 50 ml ピペットにより堆積 物の黒色部を採取した。採取したサンプルは 簡易型クリーンベンチ内でただちに還元剤入 りの人口海水無機塩培地に懸濁、10-5 まで連 続希釈した。培養には以下の基質を用いた。1. H2/CO2、2. H2/CO2/SO4、3. Acetate、4. Ace-tate/SO4、5. CH4/CO2/SO4。希釈したサンプル
はまた、上記の基質を含む 1.5%寒天培地上に
も接種した。これらは4°C で培養を開始した。
なお、海水無機塩培地に懸濁したサンプル(100 希釈)から 0.5 ml 分をパラホルムアルデヒドで
ル/人口海水無機塩培地に懸濁し、-20°C で保 存した。 4.8.3. 実験結果 現在のところ、液体培養も寒天培養も生育 の形跡はみられていない。 4.8.4. 今後の方針 引き続き、液体培地および寒天培地による 集積培養と純粋分離を試みる。集積が進んだ 場合、16S rRNA 遺伝子を対象とした PCR 増 幅を行い、同遺伝子の配列を決定し、分離し た菌株の新規性評価を行う。純粋分離株が得 られた場合は 16S rRNA 遺伝子あるいは各種 機能遺伝子に基づいた系統解析を行うととも に、生理・生化学的解析を行う予定である。 また、分離株は製品評価技術基盤機構に寄託 する予定である。なお、固定したサンプルは、 分離した微生物の局在性の把握のため、in situ ハイブリダイゼーション等に使用する予定で ある。 4.9.日本海奥尻海嶺バクテリアマット堆積物か らの新規微生物の分離培養（持丸） 4.9.1.目的 奥尻海嶺は少なくとも過去２回（2001 年の YK01-06、2003 年の YK03-05）、海洋研究開 発機構による生物・微生物学的調査が行われ ている。これらの調査によりバクテリアマッ ト中に含まれている多くの微生物が系統的に 新規性の高い未培養のものであることが示唆 されている。本研究では新規遺伝子資源の獲 得とそれら微生物の現地生態系における役割 の解明を目的としている。バクテリアマット 近辺の堆積物を採取し、バクテリアマットの 形成に寄与する微生物群集の分離培養、さら に未培養微生物の分離同定を行う。 4.9.2. 方法 バクテリアマット近辺の堆積物を採取し、 好気的メタン酸化細菌、硫化水素酸化細菌、 硝酸還元菌、硫酸還元菌、嫌気的メタン酸化 古細菌、メタン生成古細菌をターゲットとし て液体培地にて希釈培養を行なった。サンプ ルとして用いたのはMBARI core (white: depth 2956 m, 43°20.2069’N, 139°39.8499’E) の No.8 および No.10、MBARI core (black: depth 2956 m, 43°20.2238’N, 139°39.8555’E) No.6、 MT core (red: depth 2956 m, 43°20.2069’N, 139°39.8499’E)のマット部である。サンプルは 基本培地に直ちに接種後、各条件で希釈した。 サンプルを接種したものは 4°C にて保存した。 持ち帰ったものは 4°C あるいは 25°C にて培 養する。 各サンプルとも全菌数測定用に 2%ホルムア ルデヒドで固定し、また DNA 用のサンプルと して少量凍結保存した。 4.9.3. 結果 現在培養中 4.9.4. 計画 今後 1-2 ヶ月間培養し、顕微鏡観察によっ て生育が見られたものについて DNA を抽出し 16S rRNA 遺伝子塩基配列の解析を行い、新規 性の高いものについては詳細な性質を決定す る。
5. まとめ 今回ダイブした M1 サイトは、北海道北西に 位置する日本海奥尻海嶺の後志海山南南東に 位置する南後志海丘の東端である。M1 サイト は、過去にバクテリアマット帯が観察され、 微生物生態学的解析から低温湧出帯特有の活 発な微生物活性が確認されたサイトである。 本調査の目的は、奥尻海嶺低温湧出帯の継続 的な微生物生態学的解析と、微生物資源の探 索を目的として行った。 １回の潜航のみであったが、M1 サイトにお けるバクテリアマットを確認し、柱状採泥を 中心とした採取も順調に行うことができた。 併せて M1 サイトを中心としたバクテリアマッ トがどの程度の大きさであるか潜航観察から 判断し、この結果、M1 サイトを中心としたバ クテリアマット帯は直径 100 m 程度であると 判明した。これは過去の調査と比べて、大き な変化はなく、むしろ縮小した感もある。ま た、おそらく今まで潜航中には見受けられな かったであろう「ぼた雪」状の浮遊 物が何で あるか分からないが、何らかの地形的な変化 が起こり、微生物マットが舞い上がった痕跡 であった可能性もある。 採取された堆積物については、H2S 臭を伴 った堆積物であった。本堆積物中の微生物層 については今後の研究結果を待たねばならぬ が、おそらく過去得られた堆積物と同様なも のが得られたと考えられる。また、堆積物中 にはゴカイのようなものが数匹いただけであ り、潜航中の観察でもゴカイ以外に小さなエ ビが観察されたのみであり、大型生物は全く 確認できなかった。これは、奥尻海嶺低温湧 出帯の大きな特徴といえるが、これが何に起 因するかについては、具体的には分からない。 若い低温湧出帯であるためかもしれないし、 低温湧出帯としての活性が高すぎて酸素が枯 渇しているのかもしれない。いずれにせよ、 今後、生物的・地質的観点から継続的に調査 することが必要であろう。 本調査での主目的として、硫黄酸化細菌等 を中心とした微生物の網羅的培養を行った。 船上において好気的から嫌気的、高圧培養、 液体培養やシャーレ等の固体培地、コロニー 形成や希釈培養法など、様々な微生物培養を それぞれの研究者の経験とアイデアでもって 展開した。本サイトが 0.2°C であったことか ら、主に 4°C にて培養を開始し、今後も継続 的にインキュベーションする。低温性の微生 物は一般に生育が遅いことが推察され、船上 において微生物の増殖は確認できなかった。 今回の網羅的な培養により、どの程度の新規 微生物が獲得できるかは、正直なところ分か らない。今後の研究成果を気長に待たねばな らぬことは確かであるが、今回の経験が低温 湧出帯からの微生物資源獲得への大きな一歩 となることを期待してやまない。 乗船券研究者一同
