気 管 支 喘 息 お よ び ア レ ル ギ ー 性 鼻 炎 に お け る 過 敏 性 亢 進 発 症 機 序 に 関 す る 比 較 解 析
西 村 友 枝
東 京 薬 科 大 学 博 士 学 位 論 文
略 語 一 覧
本 学 位 論 文 で 使 用 し た 略 語 を 以 下 に 示 す 。
Ig; Immunoglobulin
BAL; Bronchoalveolar lavage
BALF; Bronchoalveolar lavage fluid
BHR; Bronchoalveolar hyperresponsiveness BSA; Bovine serum albumin
DMEM; Dalbecco’s modified eagle medium ELISA; Enzyme linked immune solvent assay EPO; Eosinophil peroxidase
FBS; Fetal bovine serum
GAPDH; Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
GM-CSF; Granulocyte macrophage colony stimulating factor HV; High volume IFN; Interferon IL; Interleukin IN; Intranasal IT; Intratracheal LV; Low volume
Mfsd10; Major facilitator super family domain containing 10 NALF; Nasal lavage fluid
NALT; Nasal associated lymphoid tissue N.D.; Not detectable
NHR; Nasal hyperresponsiveness OVA; Ovalbumin
PBS; Phosphate-buffered saline
PBST; Phosphate-buffered saline with tween 20 Tg; Transgenic
TGF; Transforming growth factor WT; Wild type
材 料 と 方 法 1. 実 験 動 物 6 週 齢 の 雌 Balb/c マ ウ ス は 日 本 SLC (Shizuoka、Japan)よ り 購 入 し た 。 す べ て の 動 物 実 験 は 東 京 都 医 学 総 合 研 究 所 の 動 物 実 験 指 針 に 従 っ て 行 わ れ た 。 2. 全 身 抗 原 感 作 お よ び 抗 原 投 与 実 験 ス ケ ジ ュ ー ル を Fig 1 に 示 す 。 具 体 的 に は 、 全 身 抗 原 感 作 は 20 µg OVA (Sigma-Aldrich、MO、USA)、2.25 mg alum (Thermo Fisher Scientific、 MA、USA) を 200 µL 生 理 食 塩 水 に 懸 濁 し 、マ ウ ス に 腹 腔 内 投 与 し た 。こ れ を Day 0, 7, 14 お よ び 21 に 各 日 1 回 ず つ 行 っ た 。 抗 原 投 与 は 下 記 の い ず れ か の 方 法 に よ り 行 い 、 ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル は 生 理 食 塩 水 を 投 与 し た 。 高 容 量 点 鼻 投 与(High-volume/intranasal (IN/HV)) 5 % イ ソ フ ル ラ ン で マ ウ ス を 麻 酔 し 、 15 mg/mL OVA を 25 µL 点 鼻 投 与 し た 。 こ れ を Day 35 か ら 38 ま で 、 各 日 1 回 ず つ 行 っ た 。 低 容 量 点 鼻 投 与(Low-volume/intranasal (IN/LV)) マ ウ ス に 無 麻 酔 下 で 、15 mg/mL OVA を 5 µL ず つ 4 回 点 鼻 投 与 し た 。 こ れ を Day 35 か ら 38 ま で 、 各 日 1 回 ず つ 行 っ た 。 下 気 道 投 与 (Intratracheal (IT)) 5 % イ ソ フ ル ラ ン で マ ウ ス を 麻 酔 し 、 マ イ ク ロ ス プ レ イ ヤ ー (Penn-Century, Inc、 PA、 USA) を 用 い て 15 mg/mL OVA を 25 µL、 下 気 道 に 直 接 噴 霧 し た 。 こ れ を Day 35 か ら 37 ま で 、 各 日 1 回 ず つ 行 っ た 。
3. 血 清 採 取
Day 0 お よ び 28 に マ ウ ス の 頬 を 23G シ リ ン ジ (Terumo、Tokyo、Japan) で 2mm 程 度 刺 し て 出 血 さ せ 、ヘ パ リ ン を あ ら か じ め 分 注 し た 1.5 ml チ ュ ー ブ に 末 梢 血 を 回 収 し た 。 遠 心 分 離 に よ り 上 清 を 回 収 し 血 清 を 得 た 。
4. 血 清 中 OVA 特 異 的 IgE、 total IgG お よ び IgG サ ブ ク ラ ス の 検 出 OVA 特 異 的 IgE、 total IgG お よ び IgG サ ブ ク ラ ス の 検 出 は ELISA 法 に て 行 っ た 。 具 体 的 に は 以 下 の 方 法 で 行 っ た 。96well プ レ ー ト (Thermo Fisher Scientific) に 10 µg/mL OVA を 50 µL/well ず つ 添 加 し 、 37 度 で 2 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 次 い で PBST で 200µL/well ず つ 3 回 洗 浄 後 、 PBST で 4 倍 希 釈 し た ブ ロ ッ ク エ ー ス (雪 印 メ グ ミ ル ク 、Hokkaido、Japan) を 200µL/well ず つ 添 加 し 4 度 で 一 晩 ブ ロ ッ キ ン グ し た 。 PBST で 3 回 洗 浄 後 、Can Get Solution 1 (TOYOBO、 Osaka、 Japan) で 希 釈 し た 血 清
(IgE 検 出 ; 10 倍 、 IgG 検 出 ; 500 倍 、 IgG サ ブ ク ラ ス 検 出 ; 100 倍 ) を 50 µL/well ず つ 添 加 し 37 度 で 2 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。PBST で 3 回 洗 浄 後 、Can Get Solution 2 (TOYOBO)で 4000 倍 希 釈 し た HRP 標 識 ヤ ギ 抗 マ ウ ス IgE 抗 体 、IgG 抗 体 、IgG1抗 体 、IgG2a抗 体 、IgG2b抗 体 お よ び IgG 抗 3抗 体 (Southern Biotech、AL、USA) を 50 µL/well ず つ 添 加 し た 。37
度 で 2 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後 PBST で 洗 浄 し 、テ ト ラ メ チ ル ベ ン ジ ジ ン 溶 液 を 100 µL/well ず つ 添 加 し て 暗 所 で 発 色 さ せ た 。 2N 硫 酸 を 50 µL/well ず つ 添 加 し て 発 色 反 応 を 停 止 さ せ 、 450nm の 吸 光 度 を 測 定 し た 。 5. く し ゃ み 反 応 の 計 測 最 終 抗 原 投 与 直 後 か ら 5 分 間 、 く し ゃ み 回 数 を 計 測 し た 。 6. BALF お よ び NALF の 回 収 と 細 胞 数 の 算 出 最 終 抗 原 投 与 か ら 6 時 間 後 、 マ ウ ス を 頸 椎 脱 臼 に よ り 安 楽 死 さ せ て 気 道 切 開 し た 。BALF は サ ー フ ロ ー フ ラ ッ シ ュ を 下 気 道 に 向 け て 挿 入 し 、0.5 mL PBS を 注 入 し て 直 後 に 回 収 す る こ と を 3 回 反 復 し た 。 NALF は 切 開 し た 箇 所 か ら 鼻 に 向 か っ て 200 µL PBS を 注 入 し 、鼻 腔 か ら 回 収 し た 。得 ら れ た BALF お よ び NALF を 5000 rpm、 4 度 で 5 分 間 遠 心 し て 上 清 を 除 き BALF 中 お よ び NALF 中 に 含 ま れ る 細 胞 を 単 離 し た 。細 胞 数 を 多 項 目 自 動 血 球 計 数 装 置(pocH-100iV Diff；Sysmex、Shizuoka、Japan) に よ り 計 測 し た 後 、 サ イ ト ス ピ ン(Thermo Fisher Scientific) に 供 し て 細 胞 標 本 を 作 製 し Diff-Quick (Sysmex) に て 染 色 し た (Fig 2)。細 胞 標 本 を 顕 微 鏡 下 で 観 察 し て リ ン パ 球 、好 酸 球 、好 中 球 お よ び マ ク ロ フ ァ ー ジ を 計 200 個 カ ウ ン ト し た 。 そ れ ぞ れ の 細 胞 分 画 の 比 率 を 算 出 し 、 こ れ を 細 胞 数 に 乗 じ る こ と で 各 細 胞 分 画 の 細 胞 数 を 算 出 し た 。 7. 下 気 道 過 敏 性 試 験 最 終 抗 原 投 与 72 時 間 後 、 ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル 麻 酔 し た マ ウ ス の 下 気 道 に 19G カ ニ ュ ー レ を 挿 管 し て 小 動 物 用 ベ ン チ レ ー タ ー (FlexiVent ； SCIREQ、 QC、Canada)と 接 続 し 、メ サ コ リ ン 刺 激 に よ り 誘 発 さ れ た 非 特 異 的 下 気 道 過 敏 性(BHR)の 亢 進 レ ベ ル を 解 析 し た 。 8. 統 計 解 析 得 ら れ た 値 は 各 郡 の 平 均 値 ±標 準 誤 差 と し て 示 し た 。 有 意 差 検 定 は 統 計 解 析 ソ フ ト Graph Pad Prism 5 (Graph Pad Software、 CA、 USA)で 解 析 し た 。 解 析 方 法 は t 検 定 を 使 用 し 、 p 値 が 0.05 未 満 を 統 計 学 的 に 有 意 で あ る と し た 。
結 果
1. 血 清 中 OVA 特 異 的 IgE、 total IgG お よ び IgG サ ブ ク ラ ス の 評 価 OVA で 全 身 抗 原 感 作 し た マ ウ ス 血 清 中 の OVA 特 異 的 IgE 、 total IgG お よ び IgG サ ブ ク ラ ス を ELISA 法 に よ り 検 出 し た 。OVA 特 異 的 IgE レ ベ ル は 全 身 抗 原 感 作 し た マ ウ ス で naive マ ウ ス に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た 。 OVA 特 異 的 total IgG お よ び IgG サ ブ ク ラ ス に 関 し て は 、全 身 抗 原 感 作 し た マ ウ ス で の み 高 い レ ベ ル と な り 、naive マ ウ ス で は 検 出 限 界 以 下 で あ っ た(Fig. 3)。以 上 よ り OVA/alum 腹 腔 内 投 与 に よ り OVA 全 身 抗 原 感 作 が な さ れ た こ と が 示 さ れ た 。
2. 好 中 球 お よ び 好 酸 球 数 の 評 価
Fig. 1 炎 症 細 胞 サ イ ト ス ピ ン 標 本
OVA で 全 身 抗 原 感 作 し OVA を 投 与 し た マ ウ ス の BALF お よ び NALF を サ イ ト ス ピ ン に 供 し Diff-Quick に て 染 色 し た 。 図 中 バ ー ； 10 µm
Fig. 2 疾 患 特 異 的 マ ウ ス モ デ ル 構 築 お よ び 病 態 評 価 方 法
Day 0, 7, 14 お よ び 21 に Balb/c マ ウ ス に 20 µg OVA、 2.25 mg alum を 腹 腔 内 投 与 し て 全 身 抗 原 感 作 し た 。 最 終 感 作 2 週 間 後 か ら 、高 容 量 点 鼻 投 与(IN/HV)、 低 容 量 点 鼻 投 与 (IN/LV)ま た は 下 気 道 投 与 (IT)に よ り OVA を 投 与 し た 。 最 終 抗 原 投 与 0 分 後 に く し ゃ み 回 数 の 計 測 、 6 時 間 後 に BALF お よ び NALF の 回 収 お よ び 72 時 間 後 に BHR 試 験 を そ れ ぞ れ 行 い 病 態 を 評 価 し た 。
Fig. 3 OVA 全 身 感 作 マ ウ ス の 血 清 中 OVA 特 異 的 IgE, total IgG お よ び IgG サ ブ ク ラ ス の 評 価
血 清 中 OVA 特 異 的 IgE、 total IgG お よ び IgG サ ブ ク ラ ス を ELISA 法 に よ り 検 出 し た 。 デ ー タ は 一 群 あ た り 4-8 匹 の マ ウ ス か ら 得 ら れ た 測 定 値 の 平 均 値 ±標 準 誤 差 で 示 し た 。*p < 0.05； Naïve マ ウ ス 群 と の 比 較 (t 検 定 )。
材 料 と 方 法 1. 実 験 動 物 6 週 齢 の 雌 Balb/c マ ウ ス は 日 本 SLC よ り 購 入 し た 。OVA 特 異 的 T 細 胞 受 容 体 を 恒 常 的 に 発 現 す る DO11.10×Rag-2 欠 損 マ ウ ス は 東 京 都 医 学 総 合 研 究 所 花 粉 症 プ ロ ジ ェ ク ト に て 管 理 ・ 維 持 さ れ て い る も の を 使 用 し た 。 す べ て の 動 物 実 験 は 東 京 都 医 学 総 合 研 究 所 の 動 物 実 験 指 針 に 従 っ て 行 わ れ た 。 2. 抗 体 M2 の 樹 立 は 既 報 に 従 っ た [32]。ラ ッ ト IgG モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 は Inter-Cell Technologies (FL、 USA)、 抗 Siglec-F モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 は R&D systems (MN、 USA)よ り 、 そ れ ぞ れ 購 入 し た 。
3. DMEM-F12HAM コ ン プ リ ー ト メ デ ィ ウ ム の 調 整
DMEM-F12HAM (Sigma-Aldrich) に 56 度 で 30 分 間 非 働 化 し た FBS を 10 % (V/V) 添 加 し 、 さ ら に 55 μM 2-メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル 、 20mM HEPES (Thermo Fisher Scientific)、 1mM ピ ル ビ ン 酸 、 ×1 MEM 非 必 須 ア ミ ノ 酸 溶 液 、×1 ペ ニ シ リ ン -ス ト レ プ ト マ イ シ ン 混 合 溶 液 (ナ カ ラ イ テ ス ク 、Kyoto、 Japan) と な る よ う そ れ ぞ れ 添 加 し た 。 4. In vitro で の OVA 特 異 的 Th2 細 胞 の 分 化 ・ 増 殖 頸 椎 脱 臼 に よ り 安 楽 死 さ せ た DO11.10×Rag-2 欠 損 マ ウ ス よ り 脾 臓 を 摘 出 し 、DMEM-F12HAM コ ン プ リ ー ト メ デ ィ ウ ム 中 に て す り つ ぶ し 、 脾 臓 細 胞 懸 濁 液 を 得 た 。CD4 に 対 す る 抗 体 を 結 合 し た 磁 気 ビ ー ズ (Miltenyi、 Bergisch Gladbach、Germany)を 用 い て 、磁 気 細 胞 分 離 シ ス テ ム (Miltenyi) に よ り 、 脾 臓 細 胞 懸 濁 液 中 か ら CD4 陽 性 ナ イ ー ブ T 細 胞 を ポ ジ テ ィ ブ セ レ ク シ ョ ン し た 。ポ ジ テ ィ ブ セ レ ク シ ョ ン 以 外 の 画 分 は X 線 照 射 に よ り 抗 原 提 示 細 胞 と し た 。CD4 陽 性 ナ イ ー ブ T 細 胞 が 1×105細 胞/mL、抗 原 提 示
細 胞 が 2×105 細 胞/mL と な る よ う DMEM-F12HAM コ ン プ リ ー ト メ デ ィ
ウ ム で 調 整 し 、 さ ら に 0.3 μM OVA323-339 ペ プ チ ド 、 10 U/mL リ コ ン ビ ナ ン ト 2 (塩 野 義 製 薬 、 Osaka、 Japan)、 10 U/mL リ コ ン ビ ナ ン ト IL-4 (PeproTech、 NJ、 USA)、 10 μg/mL 抗 IFN-γ モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (e-Bioscience、CA、USA)を そ れ ぞ れ 添 加 し 、5% CO2存 在 下 、37 度 で 培 養 し
た 。 培 養 7 日 後 に 遠 心 分 離 に よ り 上 清 を 除 き 、 細 胞 を 回 収 し た 。 5. サ イ ト カ イ ン 濃 度 の 測 定
マ ウ ス 脾 臓 細 胞 が 2×107 細 胞/mL と な る よ う DMEM-F12HAM コ ン プ リ
ー ト メ デ ィ ウ ム で 調 整 し た 。 さ ら に 0.3μM OVA323-339 ペ プ チ ド を 添 加 し 、100 uL /well、5% CO2 存 在 下 、37 度 で 培 養 し た 。24 時 間 後 に 培 養 上 清 を 回 収 し 培 養 上 清 中 に 含 ま れ る サ イ ト カ イ ン の 濃 度 を ビ ー ズ サ ス ペ ン シ ョ ン ア レ イ シ ス テ ム(Bio-plex Pro Mouse Cytokine Assay ； Bio-Rad Laboratories、CA、 USA) に て 測 定 し た 。操 作 は 付 属 の 使 用 説 明 書 に 従 っ て 行 っ た 。
6. マ ウ ス 気 管 支 喘 息 モ デ ル 全 身 抗 原 感 作 モ デ ル
実 験 ス ケ ジ ュ ー ル を Fig 1A に 示 す 。 具 体 的 に は 、 第 一 章 に 記 載 し た 方 法 で Day 0, 7, 14 お よ び 21 に OVA 全 身 抗 原 感 作 し 、 Day 35-37 に OVA を IT 投 与 し た 。 抗 体 処 置 は Day 34 と Day 37 に 各 日 １ 回 行 っ た 。
Th2 細 胞 移 入 モ デ ル
実 験 ス ケ ジ ュ ー ル を Fig 1B に 示 す 。 細 胞 移 入 は Day 0 に in vitro で 分 化 さ せ た Th2 細 胞 を 1×108 細 胞 /mL と な る よ う PBS に 懸 濁 し 、 正 常 な
Balb/c マ ウ ス に 200 µL ず つ 尾 静 脈 注 射 し た 。 Day 1 に OVA を 1 回 IT 投 与 し た 。 抗 体 処 置 は Day 1-3 に 各 日 1 回 行 っ た 。 抗 体 処 置 は い ず れ の モ デ ル で も M2 は 20 mg/kg、 抗 Siglec-F モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 は 4 mg/kg、ラ ッ ト IgG モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体（ ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル ） は 20 mg/kg で 尾 静 脈 注 射 し た 。 7. 気 管 支 喘 息 病 態 の 評 価 最 終 抗 原 投 与 か ら 72 時 間 後 、 第 一 章 に 記 載 し た 方 法 で 下 気 道 過 敏 性 試 験 を 行 い 、BALF 中 炎 症 細 胞 数 を 計 測 し た 。 8. IL-5 濃 度 の 測 定
BALF 上 清 中 の IL-5 濃 度 を ELISA 法 に て 測 定 し た 。 操 作 は Mouse IL-5 ELISA kit (eBioscience) 付 属 の 使 用 説 明 書 に 従 っ て 行 っ た 。
9. 統 計 解 析
得 ら れ た 値 は 各 郡 の 平 均 値±標 準 誤 差 と し て 示 し た 。 有 意 差 検 定 は 統 計 解 析 ソ フ ト Graph Pad Prism 5 (Graph Pad Software)で 解 析 し 、 解 析 方 法 は 一 元 配 置 分 散 分 析 お よ び Dunnett’s 多 重 比 較 検 定 を 使 用 し 、 p 値 が 0.05 未 満 を 統 計 学 的 に 有 意 と し た 。
結 果 1. OVA 特 異 的 Th2 細 胞 の 評 価 In vitro で 樹 立 し た OVA 特 異 的 Th2 細 胞 の 分 化 レ ベ ル を 評 価 す る た め 、 Th2 細 胞 の サ イ ト カ イ ン 産 生 パ タ ー ン を 解 析 し た 。 Th2 細 胞 と 抗 原 提 示 細 胞 に 抗 原 を 加 え て 24 時 間 培 養 し た 後 に 培 養 上 清 を 回 収 し 、 上 清 中 の 各 種 サ イ ト カ イ ン 濃 度 を 測 定 し た 。 そ の 結 果 、 抗 原 刺 激 し た Th2 細 胞 で は IL-4、 IL-5、IL-13 が 高 濃 度 で あ っ た が 、抗 原 刺 激 な し で は こ れ ら の サ イ ト カ イ ン は 検 出 さ れ な か っ た 。IL-17A は 抗 原 刺 激 し た Th2 細 胞 で の み 、 極 僅 か に 検 出 さ れ た 。 抗 原 刺 激 の 有 無 に 関 わ ら ず 、IL-1β が 僅 か に 検 出 さ れ た が 、IFN-γ 濃 度 は 検 出 限 界 以 下 で あ っ た (Fig. 2)。 2. 全 身 抗 原 感 作 マ ウ ス に お け る 好 酸 球 浸 潤 に 対 す る M2 の 効 果 OVA で 全 身 抗 原 投 与 し て OVA を IT 投 与 し た マ ウ ス に M2、 お よ び 比 較 用 コ ン ト ロ ー ル と し て 抗 Silec-F モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を そ れ ぞ れ 投 与 し 、 BALF 中 炎 症 細 胞 数 を 比 較 し た 。 そ の 結 果 、 抗 原 投 与 に よ り 有 意 に 増 加 し た 好 酸 球 数 は M2 処 置 に よ り 有 意 に 減 少 し た が 、 リ ン パ 球 数 、 好 中 球 数 お よ び マ ク ロ フ ァ ー ジ 数 に 影 響 は な か っ た 。抗 Siglec-F モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 処 置 マ ウ ス で も 好 酸 球 数 が 有 意 に 減 少 し た が 、 好 中 球 数 に 関 し て も 、 有 意 差 は な い も の の や や 減 少 傾 向 に あ っ た(Fig. 3)。 3. Th2 細 胞 移 入 モ デ ル に お け る 好 酸 球 浸 潤 お よ び BHR 亢 進 に 対 す る M2 の 効 果
In vitro で 樹 立 し た OVA 特 異 的 Th2 細 胞 を 移 入 し て OVA を IT 投 与 し た マ ウ ス に M2、 お よ び 抗 Silec-F モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を そ れ ぞ れ 投 与 し 、 BALF 中 炎 症 細 胞 数 を 比 較 し た 。 そ の 結 果 、 抗 原 投 与 に よ り 有 意 に 増 加 し た 好 酸 球 数 は M2 処 置 に よ り 有 意 に 減 少 し た が 、 リ ン パ 球 数 、 好 中 球 数 お よ び マ ク ロ フ ァ ー ジ 数 に 影 響 は な か っ た 。抗 Siglec-F モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 処 置 マ ウ ス に お い て も M2 処 置 と 同 程 度 に 好 酸 球 数 が 減 少 し た (Fig. 4A)。 ま た 、抗 原 特 異 的 Th2 細 胞 を 移 入 し た マ ウ ス に 抗 原 投 与 す る と コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 比 較 し て BHR が 有 意 に 亢 進 し た が 、M2 処 置 に よ り 有 意 差 は つ か な か っ た も の の 、や や 強 い 抑 制 傾 向 が 見 ら れ た 。一 方 、抗 Siglec-F 抗 体 処 置 に よ る BHR の 亢 進 抑 制 は 見 ら れ な か っ た (Fig. 4B)。 4. IL-5 産 生 に 対 す る M2 の 影 響 M2 に よ る 好 酸 球 浸 潤 抑 制 お よ び BHR の 亢 進 抑 制 効 果 に 対 し 、 IL-5 が 関 与 し て い る か を 検 討 し た 。BALF 中 の IL-5 濃 度 は 、 OVA 投 与 に よ り 生 理 食 塩 水 投 与 と 比 較 し て 強 く 上 昇 し た 。 一 方 、M2 処 置 お よ び 抗 Siglec-F
モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 処 置 マ ウ ス で は コ ン ト ロ ー ル 抗 体 処 置 マ ウ ス と 比 較 し て IL-5 濃 度 の 顕 著 な 変 化 は 見 ら れ な か っ た (Fig. 5)。
Fig. 1 気 管 支 喘 息 の 惹 起 、 抗 体 投 与 お よ び 病 態 評 価 方 法
Day 0, 7 14 お よ び 21 に Balb/c マ ウ ス に 20 µg OVA、 2.25 mg alum を 腹 腔 内 投 与 し 全 身 抗 原 感 作 し た 。Day 35-37 に OVA を IT 投 与 し 、Day 34 と 37 に 抗 体 処 置 し た 。 Day 40 に BHR 試 験 お よ び BALF を 回 収 し 、病 態 を 評 価 し た(A)。Day 0 に in vitro で 樹 立 し た OVA 特 異 的 Th2 細 胞 を Balb/c マ ウ ス に 移 入 し 、Day 1 に OVA を IT 投 与 し た 。 Day 1-3 に 抗 体 処 置 後 、 Day 4 に BHR 試 験 お よ び BALF を 回 収 し 、 病 態 を 評 価 し た (B)。
Fig. 2 Th2 細 胞 に よ る サ イ ト カ イ ン 産 生
In vitro で 分 化 ・ 増 殖 し た OVA 特 異 的 Th2 細 胞 を OVA323-339 ペ プ チ ド で 24 時 間 刺 激 し 、 培 養 上 清 中 の 各 種 サ イ ト カ イ ン 濃 度 を ビ ー ズ サ ス ペ ン シ ョ ン ア レ イ シ ス テ ム に て 測 定 し た 。 デ ー タ は 一 群 あ た り 3 well の 測 定 値 の 平 均 値 ±標 準 誤 差 で 示 し た 。
Fig. 3 全 身 抗 原 感 作 マ ウ ス に お け る 好 酸 球 浸 潤 に 対 す る M2 の 効 果
OVA 全 身 抗 原 感 作 マ ウ ス に 、 Day 35-37 に OVA を IT 投 与 し た 。 Day 34 お よ び Day 37 に そ れ ぞ れ の 抗 体 を 静 脈 注 射 し 、 Day 40 に BALF 中 炎 症 細 胞 数 を 評 価 し た 。 デ ー タ は 一 群 あ た り 4-8 匹 の マ ウ ス か ら 得 ら れ た 測 定 値 の 平 均 値 ± 標 準 誤 差 で 示 し た 。*p < 0.05、 **p < 0.01 お よ び ***p < 0.001； OVA 投 与 /ラ ッ ト IgG 抗 体 処 置 マ ウ ス 群 と の 比 較 (Dunnett’s 多 重 比 較 検 定)。
Fig. 4 Th2 細 胞 移 入 モ デ ル に お け る 好 酸 球 浸 潤 お よ び BHR 亢 進 に 対 す る M2 の 効 果
Day 0 に OVA 特 異 的 Th2 細 胞 を マ ウ ス に 移 入 し 、 Day1 に OVA を IT 投 与 し た 。IT 投 与 2 時 間 前 、24 時 間 後 お よ び 48 時 間 後 に そ れ ぞ れ の 抗 体 を 静 脈 注 射 し た 。Day 4 に BALF 中 炎 症 細 胞 数 を 計 測 し (A)、 BHR 試 験 を 行 っ た (B)。 デ ー タ は 一 群 あ た り 4-8 匹 の マ ウ ス か ら 得 ら れ た 測 定 値 の 平 均 値 ±標 準 誤 差 で 示 し た 。**p < 0.01、 ***p < 0.001；OVA 投 与 /ラ ッ ト IgG 抗 体 処 置 マ ウ ス 群 と の 比 較(Dunnett’s 多 重 比 較 検 定 )。
Fig. 5 Th2 細 胞 移 入 モ デ ル マ ウ ス の 下 気 道 に お け る IL-5 産 生
OVA 特 異 的 Th2 細 胞 移 入 モ デ ル マ ウ ス の BALF 中 IL-5 濃 度 を ELISA 法 に て 測 定 し た 。 デ ー タ は 一 群 あ た り 4-8 匹 の マ ウ ス か ら 得 ら れ た 測 定 値 の 平 均 値 ±標 準 誤 差 で 示 し た 。
材 料 と 方 法 1. 実 験 動 物 6 週 齢 の 雌 Balb/c マ ウ ス は 日 本 SLC よ り 購 入 し た 。OVA 特 異 的 T 細 胞 受 容 体 を 恒 常 的 に 発 現 す る DO11.10×Rag-2 欠 損 マ ウ ス 、マ ス ト 細 胞 欠 損 マ ウ ス(W/Wv)、 好 酸 球 欠 損 マ ウ ス (∆dblGATA) お よ び 抗 OVA-IgE Tg マ ウ ス は 東 京 都 医 学 総 合 研 究 所 花 粉 症 プ ロ ジ ェ ク ト に て 管 理 ・ 維 持 さ れ て い る も の を 使 用 し た 。 す べ て の 動 物 実 験 は 東 京 都 医 学 総 合 研 究 所 の 動 物 実 験 指 針 に 従 っ て 行 わ れ た 。 2. In vitro で の OVA 特 異 的 T 細 胞 の 分 化 ・ 増 殖 T 細 胞 の 分 化・増 殖 は 既 報 に 従 っ て 行 っ た [58, 59]。第 二 章 に 記 載 し た 方 法 で CD4 陽 性 T 細 胞 と 抗 原 提 示 細 胞 を DMEM-F12HAM コ ン プ リ ー ト メ デ ィ ウ ム で 調 整 し 、 さ ら に Th1 細 胞 へ の 分 化 に は 10 U/mL リ コ ン ビ ナ ン ト マ ウ ス IL-12 (Peprotech)お よ び 10 μg/mL 抗 IL-4 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (Peprotech) を そ れ ぞ れ 添 加 し た 。 Th17 細 胞 へ の 分 化 に は 10 ng/mL IL-1β、 20 ng/mL IL-6、 1 ng/mL TGF-β (Peprotech)、 10 ng/mL IL-23 (R&D systems)、 10 μg/mL 抗 IL-4 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (Peprotech) お よ び 10 μg/mL 抗 IFN-γ モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (e-Bioscience) を そ れ ぞ れ 添 加 し た 。 Th2 細 胞 へ の 分 化 は 第 二 章 に 記 載 し た 方 法 で 行 っ た 。す べ て の T 細 胞 サ ブ セ ッ ト は 5% CO2存 在 下 、37 度 で 7 日 間 培 養 し 、遠 心 し て 培 養 上 清 を 除 い た 後 に 以 降 の 実 験 に 使 用 し た 。 3. 樹 立 し た 細 胞 の サ イ ト カ イ ン 産 生 の 解 析 In vitro で 樹 立 し た OVA 特 異 的 Th1 細 胞 、 Th2 細 胞 お よ び Th17 細 胞 を 評 価 し た 。細 胞 内 IFN-γ、IL-4、IL-10 お よ び IL-17A レ ベ ル の 測 定 は 既 報 に 従 い 5 nM PMA お よ び 1 µM イ オ ノ マ イ シ ン で 6 時 間 刺 激 後 、抗 体 で 染 色 し て フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 解 析 し た[59]。 培 養 上 清 中 の サ イ ト カ イ ン 濃 度 の 測 定 は 第 二 章 に 記 載 し た 方 法 で 行 っ た 。 4. 全 身 抗 原 感 作 お よ び IN/LV 投 与 OVA 全 身 抗 原 感 作 は 第 一 章 に 記 載 し た 方 法 で Day 0, 7, 14 お よ び 21 に 行 っ た 。Day 35-38 (一 部 は Day 5-38 お よ び 41-43) に 各 日 1 回 、30 mg/mL OVA、 BSA お よ び カ ゼ イ ン (Sigma-Aldrich) を IN/LV 投 与 し た 。
5. T 細 胞 移 入 お よ び IN/LV 投 与
In vitro で 樹 立 し た OVA 特 異 的 Th1 細 胞 、 Th2 細 胞 お よ び Th17 細 胞 の 移 入 は 、第 二 章 に 記 載 し た 方 法 で 行 っ た 。T 細 胞 移 入 24 時 間 後 、4 日 連
続 で 各 日 1 回 、 30 mg/mL OVA を IN/LV 投 与 し た 。 6. 鼻 粘 膜 過 敏 性 試 験 最 終 抗 原 投 与 6 時 間 後 、 30 mg/mL OVA、 BSA お よ び 100 mM ヒ ス タ ミ ン を 点 鼻 し 、 く し ゃ み の 回 数 を 5 分 間 計 測 し た 。 7. 鼻 粘 膜 炎 症 の 評 価 最 終 抗 原 投 与 6 時 間 後 、NALF中 炎 症 細 胞 の 解 析 を 第 一 章 に 記 載 し た 方 法 で 行 っ た 。病 理 組 織 学 的 解 析 は 、マ ウ ス を4 % パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド で 固 定 後 に 鼻 組 織 を 採 取 し て 脱 灰 し 、 パ ラ フ ィ ン 包 埋 後 、 厚 さ5 µm に 薄 切 し て ヘ マ ト キ シ リ ン ・ エ オ シ ン 染 色 に て 行 っ た 。好 酸 球 に つ い て は 、40倍 の 対 物 レ ン ズ で 左 右 鼻 甲 介 を 6-10 視 野 観 察 し 、1 mm2 あ た り の 細 胞 数 を 計 測 し た 。 鼻 粘 膜 上 皮 傷 害 は 好 酸 球 と 同 様 の 範 囲 で 観 察 し 、Ponikauら の 方 法[60] を 改 変 し た ス コ ア で 評 価 し た 。 傷 害 ス コ ア を Table 1 に 示 す 。 8. 血 清 中 OVA 特 異 的 IgE、 total IgG お よ び IgG サ ブ ク ラ ス の 検 出 血 清 採 取 お よ び 血 清 中OVA特 異 的 IgE お よ び IgGの 検 出 は 第 一 章 に 記 載 し た 方 法 で 行 っ た 。
9. T 細 胞 集 積 の 確 認
NALF 細 胞 お よ び NALT 細 胞 に 抗 DO11.10-TCR-PE 抗 体 (BD Bioscience、 CA、USA) お よ び 抗 CD4-APCeFluor780 抗 体 (eBioscience) を そ れ ぞ れ 加 え て 1 時 間 4 度 で 染 色 し 、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー (FACS Canto2; BD Bioscience) に て 解 析 し た 。 10. 抗 体 処 置 に よ る CD4 陽 性 T 細 胞 除 去 最 終 抗 原 投 与 の 9 お よ び 6 日 前 に 、抗 CD4 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (GK1.5； eBioscience) を 50 mg/kg、 ラ ッ ト IgG モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 （ ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル ） を 50 mg/kg で 尾 静 脈 注 射 し た 。 抗 体 処 置 の 効 果 を 確 認 す る た め 、マ ウ ス 脾 臓 細 胞 に 抗 CD3-PECy7 抗 体 (BioLegend、CA、USA) お よ び 抗 CD4-APCeFluor780 抗 体 (eBioscience) を そ れ ぞ れ 加 え て 1 時 間 4 度 で 染 色 し 、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー に て 解 析 し た 。 11. mRNA 発 現 レ ベ ル の 解 析 最 終 抗 原 投 与 6 時 間 後 、 マ ウ ス 鼻 組 織 を 回 収 し ISOGEN (ニ ッ ポ ン ジ ー ン 、 Tokyo、Japan) 中 で 懸 濁 し た 。得 ら れ た 懸 濁 液 か ら 、ISOGEN 添 付 の プ ロ ト コ ル に 従 っ て mRNA を 抽 出 し 、 ラ ン ダ ム プ ラ イ マ ー (Toyobo) と SuperScript 3 逆 転 写 酵 素 (Thermo Fisher Scientific) を 用 い て 逆 転 写
し 、反 応 産 物 と IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、EPO お よ び GAPDH の プ ロ ー ブ(TaqMan MGBprobe; Thermo Fisher Scientific) を そ れ ぞ れ 用 い て CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad、 CA、 USA) に て 解 析 し た 。
12. 統 計 解 析
得 ら れ た 値 は 各 郡 の 平 均 値±標 準 誤 差 と し て 示 し た 。 有 意 差 検 定 は 統 計 解 析 ソ フ ト Graph Pad Prism 5 (Graph Pad Software) で 解 析 し 、 2 群 間 の 比 較 は Mann-Whitney U test、 多 群 間 の 比 較 は Kruskal-Wallis test お よ び Dunn’s 多 重 比 較 検 定 を 使 用 し 、 p 値 が 0.05 未 満 を 統 計 学 的 に 有 意 で あ る と し た 。
結 果
1. 全 身 感 作 マ ウ ス に お け る 抗 原 誘 発 NHR 亢 進 の 発 症
OVA で 全 身 抗 原 感 作 し 、 OVA を 7 回 投 与 し た Balb/c マ ウ ス で は 、 8 回 目 の OVA 投 与 直 後 に 強 い く し ゃ み 反 応 が 誘 発 さ れ た (Fig. 1A, B)。 生 理 食 塩 水 お よ び 非 特 異 抗 原 で あ る BSA を 8 回 投 与 し た マ ウ ス で は く し ゃ み 反 応 は 誘 発 さ れ な か っ た 。そ こ で OVA を 7 回 投 与 し た マ ウ ス に BSA を 投 与 す る と 、OVA の み を 投 与 し た マ ウ ス と 同 程 度 の く し ゃ み 反 応 が 誘 発 さ れ た (Fig. 1B)。 詳 細 に 解 析 す る と 、 抗 原 非 特 異 的 な タ ン パ ク で あ る BSA 投 与 に よ り 誘 発 さ れ る く し ゃ み 反 応 の 増 加 は 2 回 の 抗 原 投 与 に よ り 既 に 確 認 さ れ 、 同 様 の 反 応 は 代 表 的 な く し ゃ み 誘 因 物 質 で あ る ヒ ス タ ミ ン の 投 与 で も 誘 発 さ れ た(Fig. 1C)。 ま た BSA 同 様 、 抗 原 非 特 異 的 な タ ン パ ク 質 で あ る カ ゼ イ ン 投 与 で も く し ゃ み 反 応 は 誘 発 さ れ た(Fig. 1D)。抗 原 投 与 後 の マ ウ ス に 対 す る ヒ ス タ ミ ン 誘 発 く し ゃ み 反 応 の 増 加 は 、 ヒ ス タ ミ ン 濃 度 依 存 的 に 誘 発 さ れ た(Fig. 1E)。以 上 の 結 果 よ り 、全 身 抗 原 感 作 し た マ ウ ス に 特 異 抗 原 を 投 与 す る と NHR 亢 進 が 発 症 し 、 抗 原 非 特 異 的 な 刺 激 に も 反 応 し て く し ゃ み 反 応 が 増 加 す る よ う に な る こ と が 示 さ れ た 。4 回 抗 原 投 与 し た マ ウ ス の NHR 亢 進 反 応 の 経 時 変 化 を 追 う と 、 最 終 抗 原 投 与 3 時 後 に は 強 く NHR が 亢 進 し て 6 時 間 後 に ピ ー ク を 迎 え 、 48 時 間 後 に は ほ ぼ 消 失 し た (Fig. 1F)。 以 上 の 結 果 か ら 、 以 降 の 実 験 に お け る NHR 亢 進 の 評 価 （ 鼻 粘 膜 過 敏 性 試 験 ）は 、 抗 原 投 与 6 時 間 後 に ヒ ス タ ミ ン 誘 発 く し ゃ み 反 応 を 計 測 す る こ と で 行 う こ と と し た 。 2. 全 身 感 作 マ ウ ス に お け る 抗 原 誘 発 鼻 粘 膜 炎 症 の 評 価
ウ ス の い ず れ も 抗 原 特 異 的 に NALF 中 リ ン パ 球 数 、 好 中 球 数 お よ び 好 酸 球 数(Fig. 3B)、 血 清 中 の 抗 原 特 異 的 IgE レ ベ ル (Fig. 3C) が 増 強 し た が 、 W/Wv マ ウ ス と+/+ マ ウ ス と で は ほ と ん ど 差 は な か っ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 NHR 亢 進 発 症 に 対 す る マ ス ト 細 胞 の 関 与 は 比 較 的 小 さ い 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 4. 好 酸 球 の 関 与 次 に NHR 亢 進 発 症 に 対 す る 好 酸 球 の 関 与 に つ い て 解 析 し た 。OVA で 全 身 抗 原 感 作 し 、8 回 OVA 投 与 し た ∆dblGATA マ ウ ス で は 生 理 食 塩 水 投 与 マ ウ ス と 比 較 し て 有 意 に NHR が 亢 進 し て い た が 、 抗 原 投 与 し た 同 腹 の WT マ ウ ス も 同 程 度 に NHR が 亢 進 し て い た (Fig. 4A)。 同 様 に ∆dblGATA マ ウ ス お よ び WT マ ウ ス の い ず れ も 抗 原 特 異 的 に NALF 中 リ ン パ 球 数 お よ び 好 中 球 数 (Fig. 4B)、血 清 中 の 抗 原 特 異 的 IgE レ ベ ル (Fig. 4C) が 増 強 し た が 、∆dblGATA マ ウ ス と WT マ ウ ス と で は ほ と ん ど 差 は な か っ た 。好 酸 球 数 の 増 加 は 抗 原 投 与 し た WT マ ウ ス で の み 確 認 さ れ た (Fig. 4B)。こ れ ら の 結 果 か ら 、NHR 亢 進 発 症 に 対 す る 好 酸 球 の 関 与 は 比 較 的 小 さ い 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 5. CD4 陽 性 T 細 胞 の 関 与 CD4 陽 性 T 細 胞 の 関 与 に つ い て 解 析 す る た め 、 抗 CD4 抗 体 処 置 に よ る T 細 胞 除 去 実 験 を 行 っ た 。OVA で 全 身 抗 原 感 作 し 4 回 OVA 投 与 し た Balb/c マ ウ ス に 抗 CD4 抗 体 処 置 す る と 、 抹 消 の CD3 陽 性 /CD4 陽 性 細 胞 は ほ ぼ 消 失 し た(Fig. 5A)。 NHR は 抗 原 投 与 に よ り 生 理 食 塩 水 投 与 マ ウ ス と 比 較 し て 有 意 に 亢 進 し た が 、 抗 体 処 置 に よ り 強 く 抑 制 さ れ た(Fig. 5B)。 NLAF 中 リ ン パ 球 数 、 好 中 球 数 お よ び 好 酸 球 数 も 同 様 に 抗 体 処 置 に よ り 有 意 に 減 少 し た(Fig. 5C)。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 NHR 亢 進 発 症 に 対 す る CD4 陽 性 T 細 胞 の 強 い 関 与 が 示 唆 さ れ た 。 6. 樹 立 し た 抗 原 特 異 的 Th1 細 胞 、 Th2 細 胞 お よ び Th17 細 胞 の 評 価 NHR 亢 進 発 症 に 対 す る 抗 原 特 異 的 T 細 胞 の サ ブ セ ッ ト 間 で の 比 較 解 析 を 行 う た め 、OVA 特 異 的 Th1 細 胞 、Th2 細 胞 お よ び Th17 細 胞 を in vitro で 分 化 ・ 増 殖 し 、 得 ら れ た 細 胞 の 分 化 レ ベ ル を 評 価 し た 。 細 胞 内 サ イ ト カ イ ン を 解 析 す る と 、 抗 原 刺 激 に よ り Th1 細 胞 は 主 に IFN-γ を 、 Th2 細 胞 は 主 に IL-4 を 、 Th17 細 胞 は 主 に IL-17 を そ れ ぞ れ 強 く 産 生 し て い た (Fig 6A)。培 養 上 清 中 の サ イ ト カ イ ン 量 に つ い て も 、抗 原 刺 激 に よ り 細 胞 内 サ イ ト カ イ ン と 同 様 の パ タ ー ン を 示 し た(Fig 6B)。 以 上 、 そ れ ぞ れ の T 細 胞 サ ブ セ ッ ト に 特 徴 的 な サ イ ト カ イ ン が 抗 原 特 異 的 に 産 生 さ れ た こ と か ら 、 そ れ ぞ れ の T 細 胞 サ ブ セ ッ ト へ の 分 化 が な さ れ た こ と が 確 認 さ れ た 。
Fig. 1 抗 原 誘 発 NHR 亢 進 の 発 症
Day 0, 7 14 お よ び 21に Balb/cマ ウ ス に 20 µg OVA、 2.25 mg alumを 腹 腔 内 投 与 し 全 身 抗 原 感 作 し た 。Day 35-38お よ び Day 41-43に 、OVA、BSAお よ び 生 理 食 塩 水 をIN/LV投 与 し 、 Day 44 に も 図 に 示 し た 組 み 合 わ せ で 投 与 し た (A)。Day 41-43 に 投 与 直 後 の く し ゃ み 回 数 を 計 測 し た (B)。Day 34 (0)-38 (4) 各 日 の OVA 投 与 6 時 間 後 に BSAお よ び ヒ ス タ ミ ン を 点 鼻 し て 誘 発 し た く し ゃ み 回 数 を 計 測 し た(C)。 Day 35-37 に OVA投 与 し た マ ウ ス に 対 し 、Day 38 に OVA、 BSAお よ び カ ゼ イ ン を 投 与 し 、 直 後 の く し ゃ み 回 数 を 計 測 し た(D)。 く し ゃ み 反 応 に お け る ヒ ス タ ミ ン 濃 度 依 存 性 (E)。
Day 35-38 に OVAを 投 与 し た マ ウ ス に 対 す る ヒ ス タ ミ ン 誘 発 く し ゃ み 反 応 の 経 時 変 化(F)。 デ ー タ は 一 群 あ た り 4-8匹 の マ ウ ス か ら 得 ら れ た 測 定 値 の 平 均 値 ±標 準 誤 差 で 示 し た 。*p < 0.05、**p < 0.01 お よ び ***p < 0.001； 生 理 食 塩 水 投 与 マ ウ ス 群 と の 比 較(t検 定 )。
Fig. 2 抗 原 誘 発 鼻 粘 膜 炎 症 反 応
Fig. 3 マ ス ト 細 胞 欠 損 マ ウ ス に お け る NHR 亢 進 の 発 症
Day 0, 7 14 お よ び 21 に OVA で 全 身 抗 原 感 作 し た W/Wv マ ウ ス ま た は
Fig. 4 好 酸 球 欠 損 マ ウ ス に お け る NHR 亢 進 の 発 症
Day 0, 7 14 お よ び 21 に OVA で 全 身 抗 原 感 作 し た ∆dblGATA マ ウ ス ま た は WT マ ウ ス に 、Day 35-38 お よ び Day41-44 に OVA を IN/LV 投 与 し た 。 最 終 抗 原 投 与 6 時 間 後 、NHR 亢 進 レ ベ ル (A)、NALF 中 リ ン パ 球 数 、好 中 球 数 お よ び 好 酸 球 数(B)お よ び 血 清 中 抗 原 特 異 的 IgE レ ベ ル (C)を 評 価 し た 。 *p < 0.05 お よ び **p < 0.01；生 理 食 塩 水 投 与 マ ウ ス 群 と の 比 較 (Dunn’s 多 重 比 較 検 定)。
Fig. 5 NHR 亢 進 発 症 に 対 す る 抗 CD4 抗 体 の 効 果
Fig. 6 Th1 細 胞 、 Th2 細 胞 お よ び Th17 細 胞 に よ る サ イ ト カ イ ン 産 生 In vitro で 樹 立 し た OVA 特 異 的 Th1 細 胞 、 Th2 細 胞 お よ び Th17 細 胞 の サ イ ト カ イ ン 産 生 パ タ ー ン を 評 価 し た 。5 nM PMA お よ び 1 µM イ オ ノ マ イ シ ン で 6 時 間 刺 激 し 、 細 胞 内 IFN-γ、 IL-4、 IL-10 お よ び IL-17A を そ れ ぞ れ 染 色 し て フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 測 定 し た(A)。 OVA323-339 ペ プ チ ド で 24 時 間 刺 激 し 、 培 養 上 清 中 の IFN-γ、 IL-4 お よ び IL-17A 濃 度 を ELISA 法 に よ り 測 定 し た (B)。デ ー タ は 一 群 あ た り 3 well の 測 定 値 の 平 均 値 ±標 準 誤 差 で 示 し た 。**p < 0.01 お よ び ***p < 0.001； OVA 刺 激 し た 他 の T 細 胞 サ ブ セ ッ ト と の 比 較 (Dunn’s 多 重 比 較 検 定 )。
Fig. 7 T 細 胞 移 入 マ ウ ス に お け る NHR 亢 進 の 発 症
In vitro で 樹 立 し た OVA 特 異 的 Th1 細 胞 、 Th2 細 胞 お よ び Th17 細 胞 を 正 常 マ ウ ス に 移 入 し た 。 移 入 24 時 間 後 か ら 1 日 1 回 、 3 日 間 、 OVA を IN/LV 投 与 し 、 最 終 抗 原 投 与 6 時 間 後 に NHR 亢 進 レ ベ ル (A)、 NALF 中 リ ン パ 球 数 、好 中 球 数 お よ び 好 酸 球 数(B)、Th2 細 胞 移 入 マ ウ ス の NALF お よ び NALT 中 に 集 積 し た DO11.10-TCR 陽 性 /CD4 陽 性 細 胞 (C)お よ び 鼻 組 織 中 IFN-γ、 IL-4 お よ び IL-17A mRNA 発 現 レ ベ ル (D)を 評 価 し た 。 デ ー タ は 一 群 あ た り 4-8 匹 の マ ウ ス か ら 得 ら れ た 測 定 値 の 平 均 値 ±標 準 誤 差 で 示 し た 。*p < 0.05、 **p < 0.01 お よ び ***p < 0.001； Naïve T 細 胞 移 入 /OVA 投 与 マ ウ ス 群 と の 比 較 (Dunn’s 多 重 比 較 検 定 )。
Fig. 8 抗 OVA-IgE Tg マ ウ ス 、 全 身 抗 原 感 作 マ ウ ス お よ び T 細 胞 移 入 マ ウ ス に お け る NHR 亢 進 発 症 の 比 較
Day 0, 7 14 お よ び 21 に OVA で 全 身 抗 原 感 作 し た Balb/c マ ウ ス 、in vitro で 樹 立 し た OVA 特 異 的 Th1 細 胞 、 Th2 細 胞 お よ び Th17 細 胞 を 移 入 し た 正 常 マ ウ ス お よ び 未 感 作 の 抗 OVA-IgE Tg マ ウ ス に 1 日 1 回 、 3 日 間 、 OVA を IN/LV 投 与 し た 。最 終 抗 原 投 与 6 時 間 後 に 血 清 中 OVA 特 異 的 IgE、 total IgG お よ び IgG サ ブ ク ラ ス (A)、 NHR 亢 進 レ ベ ル (B) お よ び NALF 中 リ ン パ 球 数 、好 中 球 数 お よ び 好 酸 球 数(C)を 評 価 し た 。デ ー タ は 一 群 あ た り 4-8 匹 の マ ウ ス か ら 得 ら れ た 測 定 値 の 平 均 値 ±標 準 誤 差 で 示 し た 。 *p < 0.05、 **p < 0.01； OVA 全 身 感 作 /OVA 投 与 マ ウ ス 群 と の 比 較 (Dunn’s 多 重 比 較 検 定)。
論 文 目 録
本 博 士 学 位 申 請 論 文 は ， 以 下 の 論 文 お よ び そ の 未 発 表 結 果 の 内 容 を 総 括 し た も の で あ る 。
第 一 章
Antigen-induced mixed and separated inflammation in murine upper and lower airways. Saeki M, Nishimura T, Mori A, Kaminuma O and Hiroi T. Allergol Int. 2014;63:59-61.
第 二 章
Selective suppression of th2 cell-mediated lung eosinophilic inflammation by anti-major facilitator super family domain containing 10 monoclonal antibody. Nishimura T, Saeki M, Motoi Y, Kitamura N, Mori A, Kaminuma O and Hiroi T. Allergol Int. 2014;63:29-35.
第 三 章
Existence of antigen-specific immunoglobulin E is not sufficient for allergic nasal eosinophil infiltration in mice. Nishimura T, Saeki M, Kaminuma O, Matsuoka K, Yonekawa H, Mori A and Hiroi T. Int Arch Allergy Immunol. 2013;161:125-8.
Essential contribution of CD4+ T cells to antigen-Induced nasal
hyperresponsiveness in experimental allergic rhinitis. Nishimura T, Kaminuma O, Saeki M, Kitamura N, Matsuoka K, YonekawaH, Mori A and Hiroi T. PLOS ONE. 2016;11:e0146686.
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