ダイズ体細胞胚長期懸濁培養におけるマルトースの効果に関する一考察

2015 年 7 月 29 日受理 連絡責任者：畠中知子（thata@kobe-u.ac.jp）

ダイズ体細胞胚長期懸濁培養におけるマルトースの効果に関する一考察

畠中知子・木原由貴・左海庸光・瀬田聡美・深山 浩・三十尾修司

神戸大学大学院農学研究科（〒 657 – 8501 神戸市灘区六甲台町 1 – 1） 要旨：ダイズの組織培養による再分化・植物体再生は，未熟子葉から体細胞胚を誘導し，増殖・形態分化・成熟 の各ステージを経て，植物体を再生させる方法が主流である．このプロトコールはモデル品種である Jack でほぼ 確立されているが，最適な培養方法は現在でも遺伝子型の違いに大きく左右される．代表的な日本産黒ダイズで ある丹波黒ではまだ正式な成功例が報告されていないが，我々の研究室では，Jack のプロトコールを改変するこ とにより，丹波黒ダイズから体細胞胚を誘導・増殖し，効率は低いものの植物体再生にも成功してきた．これら の実験過程で，成熟培養だけでなく増殖培養でも培地に加える糖をスクロースからマルトースに置き換えること で，明らかな再分化促進効果を表すことがわかってきた．通常，増殖培養を 2 年以上も続けると，モデル品種で ある Jack でもその後の体細胞胚成熟効率が下がり，次第に再分化しなくなる．しかし，いったん再分化しなくなっ た懸濁培養細胞をスクロースからマルトースに置き変えた液体増殖培地で培養することにより，3 年以上培養を続 けた細胞でも再分化能が復活した．また，この反応は可逆的であることがわかった． キーワード：ダイズ，体細胞胚成熟，長期懸濁培養，マルトース

緒 言

ダイズ〔Glycine max〕は約 40% のタンパク質と約 20% の脂質を含み，栄養価が高く，世界で広く栽培されている 主要穀物のうちの 1 つである．世界的には油料作物，もし くは飼料作物として取り扱われ，世界の植物油生産量では 今でもアブラヤシに次いで第 2 位であるが，アジア諸国で は重要な食用作物でもある． ダイズの組織培養による再分化は，現在では未熟子葉か ら体細胞胚を誘導し，増殖・形態分化・成熟の各ステージ を経て，植物体を再生させる方法が主流である （Lazzeri et

al. 1985, Lazzeri et al. 1987a, Lazzeri et al. 1987b, Finer and

Nagasawa 1988, Hartweck et al. 1988, Parrott et al. 1988, Bailey

et al. 1993b, Samoylov et al. 1998a, Walker and Parrott 2001）．

この方法はパーティクルガンによる形質転換体作成におい ても有効に利用されている （Finer and McMullen 1991, Hadi

et al. 1996）．ダイズの体細胞胚を介した組織培養では，体 細胞胚が球状型から心臓型・魚雷型・子葉型へと変化して いくことを，形態分化および成熟と言っている．本研究で 検討する増殖・形態分化・成熟培養のためには，液体培地 を使う場合と固体培地を使う場合がある． ダイズ体細胞胚の液体培養の基本となる培地として， Finer and Nagasawa （1988） が MS 培地 （Murashige and Skoog 1962）の KNO3を 18.9 mM か ら 29.9 mM に，NH4NO3 を

20.6 mM から 9.9 mM に置き換えた FN 無機塩を考案し， その後 Samoylov et al. （1998a） によって KNO3を 27.9 mM

に，NH4NO3を（NH4）2SO4に変えて 3.5 mM にした FN Lite 無機塩が作成された．現在のダイズ液体培養ではこの FN Lite 無機塩が主に用いられている．増殖培養ではこれに MS 微量要素，B5 ビタミン （Gamborg et al. 1968），6.7 mM のアスパラギン，22.6 μ M の 2,4-D （2,4-dichlorophenoxyacetic acid），1% （w/v） の ス ク ロ ー ス を 加 え た FN Lite 培 地 （Samoylov et al. 1998a），成熟培養では増殖用培地から 2,4-D

とアスパラギンを抜き，糖としてスクロースを 3% （w/v） 加えたものが使われた （Samoylov et al. 1998b）．この培地 を使用することにより，子葉段階に至る胚数が増加し，再 分化植物の不稔性の回復も見られるようになり，形態分化・ 成熟に要する期間が固体培地を使う時に比べて格段に短縮 できるようになった．また，この培地に 3％ （w/v） のソル ビトールを加えることにより，体細胞胚の発芽率と発芽後 の植物体再生率が上昇した （Walker and Parrott 2001）．この 培地は FNL0S3S3 と呼ばれている．その後，Schmidt et al. （2005） が，この FNL0S3S3 に 30 mM グルタミンと 1 mM メチオニンを添加した培地 （Soybean Histodifferentiation and Maturation Medium, SHaM） でさらに再生率を向上させた． 固体培地を使う方法では，成熟前の体細胞胚細胞塊を 6％マルトースと 0.5％活性炭を添加した成熟固体培地 （MSM6AC） で 28 日間培養して子葉型胚にまで成長させ る．このプロトコールでは形態分化と成熟に要する時間が 長いものの，胚の発芽率は安定している．また，活性炭は しばしば外来オーキシンを吸着除去するために培地に添 加される （Bailey et al. 1993a）．このように有益な効果があ る一方で，活性炭は培地中の必要な成分までも吸着してし まうという報告もある （Pan and Staden 1998）．また，活性 炭を使用しない固体成熟培地 （MSM6） 実験も報告されて いる （Schmidt et al. 2005）．つまり，培地への活性炭添加 は胚成熟過程に必ずしも必須のものではないと言えるだ ろう． これらの改良により品種 Jack では，再分化方法は液体 培地・固体培地を使う両方でほぼ確立されたと言ってよい。

論 文

ただし，再分化効率は現在でも遺伝子型に大きく依存して おり （Komatsuda and Ohyama 1988, Bailey et al. 1993a, Meurer

et al. 2001, Hiraga et al. 2007, Kita et al. 2007），個別の品種

に最適な方法をを見つけなければならない．特に日本の食 用ダイズとして人気のある大粒黒ダイズ，丹波黒では組織 培養による再分化方法は確立しているとは言えない． 筆者らは以前に，組織培養による再分化方法が確立して いない丹波黒は体細胞胚誘導に関してはモデル品種である Jack と同等以上の能力を示すことを報告した （Hatanaka et al. 2004） が，その後の胚成熟，植物体再生では前述のプロ トコールでは成功しなかった．そのため，丹波黒の胚成熟 以降の培養条件については Jack でのプロトコールに固執 せずに検討するべきであると判断した． 本研究では材料として丹波黒の一系統である兵系黒 3 号 とモデル品種である Jack を用い，成熟段階を促す糖の種 類，活性炭，アミノ酸の効果を検討し，再分化効率の向上 を試みた．その結果，成熟培養だけでなく，成熟培養以前 の増殖培養時のスクロースをマルトースに置き換えること により，胚成熟に劇的な効果が見られたことを報告する．

材料および方法

ダイズ〔Glycine max〕の品種，Jack （アメリカ産普通ダ イズ），丹波黒 （日本産黒ダイズ，系統名，兵系黒 3 号） を， 赤玉土：腐植土：バーミキュライトを 1:1:1 で入れたワグ ネルポットに植えて神戸大学農学部内のガラス室において 自然日長下で栽培した．若い莢から未熟種子を取り出し， Walker and Parrott （2001） の方法に従って誘導した体細胞胚 を実験材料として用いた．体細胞胚誘導のためには，未熟 種子を 1% （w/v） の次亜塩素酸ナトリウム水溶液で 30 分 間殺菌し，滅菌水で洗浄した後，Jack では 5 ∼ 7 mm 長， 丹波黒では 6 ∼ 9 mm 長の子葉から胚軸部分を切り離して 平らな面が上になるように体細胞誘導培地［MS 無機塩類， B5 ビタミン類，3% （w/v） スクロース，200 ȝM の 2,4-D に 0.25% のゲランガム］に置床した．約 1 ヶ月後に形成され た体細胞胚を増殖培地に移した． 基本的な増殖培養では Schmidt et al. （2005） の方法を参 考に，25 ȝM の 2,4-D を含む FN Lite 液体培地を用いた． 実験後半で行った長期間増殖培養では， FN Lite 液体培地 と FN Lite の 1% （w/v） スクロースを 1% （w/v） マルトース に置き換えた FN Lite-M 液体培地を使用して比較した．液 体増殖培養の場合，200 ml 容量の三角フラスコに 60 ml の 培地，15 片の細胞塊を入れ，80 rpm で振盪培養した．継 代培養は固体，液体培地共に 4 週間毎に行った． 体細胞胚成熟培養の固体培地としては MSM6［ホルモ ンフリー MS 無機塩，B5 ビタミン，6% （w/v） マルトース， 0.25% （w/v） ゲランガム］と MSM6AC［MSM6 + 0.1% （w/v） 活性炭］を使用した．丹波黒の液体成熟培地としては Jack で方法が確立されている SHaM （Schmidt et al. 2005） を参 考とし，ホルモンフリーの FN Lite 培地に糖として 3% （w/ v） スクロース＋ 3% （w/v） ソルビトールを加えた S3S3 を 基本とし，スクロースをマルトースに置き換えた M3S3， 6% （w/v） マルトースの M6 の 3 種類に，アミノ酸 （30 mM グルタミン，2 mM メチオニン） 添加の影響を検討した． 液体成熟培養では 100 ml 容量の三角フラスコに 30 ml の 各成熟培地と 10 片の細胞塊を入れて 80 rpm で振盪した． Jack の液体成熟培養では，アミノ酸を加えない S3S3 と M3S3 だけを用いて比較した．成熟培養は固体培地，液体 培地共に Jack では 1 ヶ月間，丹波黒では 6 週間行った後， 胚の発達の様子を観察した．培養条件は全て 25℃，16 時 間日長，光強度 50 ȝmol m-2 _s-1 であった． 成熟した子葉型胚はホルモンフリーの MS 固体培地［MS 無機塩類，B5 ビタミン類，3% （w/v） スクロース，0.25% ゲランガム］で本葉が 3 ∼ 4 枚出るまで上記培養条件で育 成した後，培養瓶から取り出してバーミキュライトを入れ たビニールポットに移植した． 順化した植物体は赤玉土： 腐植土：バーミキュライトを 1:1:1 で入れた 1/5000 a ワグ ネルポットに移植してガラス室で栽培した．

結果および考察

丹波黒，兵系黒 3 号の成熟培養 丹波黒である兵系黒 3 号の体細胞胚誘導は緒言に記述し たように比較的容易であった （Hatanaka et al. 2004） が，成 熟培養は Jack ほど容易ではなかった．液体成熟培養で， S3S3 単独培地では子葉型胚が全く形成されなかったが， スクロースをマルトースに置き換えた M3S3 培地では正常 な子葉型胚がフラスコ当たり平均 5 個形成された （Fig. 1）． アミノ酸添加の効果は高く，胚成熟がみられなかった S3S3 培地でもグルタミン添加でわずかではあるが子葉型 胚が形成された（フラスコ当たり平均 1.25 個）．M3S3 培 地では更に顕著な効果があり，グルタミンとメチオニンを 添加した培地で最も多くの子葉型胚が形成され，S3S3 培 地にアミノ酸を添加した場合の 10 倍近い子葉型胚（平均 12.1 個）が得られた．ただし M6 培地ではアミノ酸添加に よるはっきりした傾向は見られなかった． Fig. 2 の観察結果より，糖としてスクロースよりマルトー スを使用した方が細胞の緑色が濃く，明らかに正常な子葉 胚が多く形成された．しかし，これらの子葉型胚は培養瓶 の中では植物体として再生したものの，順化に至る前にほ とんどがホルモンフリー培地で培養中に枯死してしまっ た．結果として固体成熟培地 MSM6 で再生した 1 個体の みが順化・開花・結実まで生育した．固体成熟培地への活 性炭の添加は，有意な効果を示さなかった．成熟培養では 液体培地でも固体培地でも糖としてマルトースが有効であ ることはわかったが，丹波黒［兵系黒 3 号］の再分化培養 の効率化にはまだ改善の必要がある． Jack の長期増殖培養と再分化 丹波黒での結果を踏まえ， Jack でも成熟培養におけるマ

ルトースの効果を検討した．スクロースとマルトースの影 響をよりはっきり観察するため，アミノ酸添加は行わな かった．約 2 年間，FN Lite 培地で増殖培養してきた細胞 を S3S3 もしくは M3S3 液体培地に移して成熟培養を試み たところ，糖としてスクロースを推奨した Samoylov et al. （1998b） の報告とは違って，マルトースを使用した M3S3 培地の方が子葉型胚形成率が有意に高くなった （Fig. 3）． 固体成熟培地への活性炭添加では，丹波黒と同様，子葉 型胚形成率に有意差はなかったが，活性炭を入れた方が若 干多く形成される代わりに胚が小さくなる傾向がみられた． 通常，増殖培養を 2 年以上も続けると，ダイズのモデル 品種である Jack でもその後の胚成熟効率が下がり，次第 に植物体再生しなくなる．丹波黒での実験経過中，2 年以 上液体増殖培養を続けた後では生育が悪くなり，成熟培地 に移植しても子葉型胚にまで発達しなくなった．この時期 の液体増殖培地の糖をスクロースからマルトースに置き換 える試みを行ったところ，細胞の緑色が濃くなり，生育が 良くなる傾向が見られた．その細胞塊を固体成熟培地に移 植して観察すると，細胞の形態が球状から細長くなる変化 は見られたが正常な子葉型胚の形状には至らなかった． 約 2 年間の増殖培養を行って植物体再生能力が低下した Jack の細胞でも同様の実験を行った．増殖継代培養を続け る過程で FN Lite 培地のスクロースをマルトースに置き換 えた FN Lite-M 培地に移植して培養した．その結果，体細 胞胚誘導から 3 年間以上増殖培養を経ていったん再分化し なくなった懸濁培養細胞であっても，FN Lite-M 培地で 3 ヶ 月以上培養してから固体成熟培地に移すと子葉型胚に発達 することがわかった． Fig. 4 の上段はスクロースの FN Lite 培地で 25 ヶ月，その後にマルトースの FN Lite-M 培 地で 17 ヶ月間，下段は FN Lite 培地で 20 ヶ月，FN Lite-M 培地で 8 ヶ月，FN Lite 培地に戻して 14 ヶ月間，それぞれ 合計 42 ヶ月間増殖培養した後に MSM6 固体培地で 1 ヶ月 の成熟培養を行った結果である．これらの実験に使われた 細胞は，2009 年 8 月に未熟子葉から誘導された体細胞胚で， 全く同じ 42 ヶ月間増殖培養を行い，同時に同じ固体成熟 培地に移植したものである．下段の FN Lite 培地由来の細 胞 塊 は 全 く 子 葉 型 胚 に 発 達 し な か っ た が， 上 段 の FN Lite-M 培地由来の細胞塊では全てから正常な子葉型胚が 発達した． 増殖培養中の細胞を顕微鏡下で観察すると，FN Lite 培 地の体細胞塊が典型的なラズベリー状の形態をしているの に対し，FN Lite-M 培地の体細胞胚塊は魚雷型胚に近い形 に変化していた （Fig. 5）．その状態のまま次々と二次胚を 形成しながら増殖し，成熟培地に移すと Fig. 4 に示すよう に 1 ヶ月以内に子葉型胚に発達した．こうして FN Lite-M 培地での増殖培養で再分化能が復活した細胞を，FN Lite

Number of cotyeonry-stage embryos / flask

0 2 4 6 8 10 12 14 S3S3 M3S3 M6 Control +Gln +Gln +Met

Fig. 1. Effects of carbohydrate source and amino acids on Tanbaguro somatic embryo maturation.

S3S3, 3% sucrose + 3% sorbitol; M3S3, 3% maltose + 3% sorbitol; M6, 6% maltose; +Gln, 30 mM glutamine; +Gln+Met, 30 mM glutamine + 1 mM methionine. Values represent the average of eight replicates ± S.E.

Fig. 2. Appearances of somatic embryos of

Fig. 2. Appearances of somatic embryos of Tanbaguro after six weeks of maturation culture in nine different liquid media.

A, S3S3; B, S3S3+Gln; C, S3S3+Gln+Met; D, M3S3; E, M3S3+Gln; F, M3S3+Gln+Met; G, M6; H, M6+Gln; I, M6+Gln+Met. Bars = 1 cm.

Cotyledonary embryo formation / inoculated cell mass (%) 0 5 10 15 20 25 30 S3S3 M3S3 Fi 3 Eff t f lt i li id

Fig. 3. Effect of sucrose or maltose in liquid maturation medium on somatic embryo development of Jack after two years of proliferation culture. Values represent the average of three replicates ± S.D.

培地に戻して 3 ヶ月以上経つと次第にラズベリー状の細胞 塊 に な り， 再 分 化 し な く な っ た． そ の 細 胞 を 再 び FN Lite-M 培地に移して 3 ヶ月以上経つと，また細胞の形状 が変化し，再分化能が復活して子葉型胚に発達した．特に データは示していないが，これは常に可逆的な反応である 可能性が高い． 42 ヶ月（3 年 6 ヶ月） 間増殖培養していた細胞から成熟 した子葉型胚は植物体へと発達し，Fig. 6 に示すように， 再生した植物体は正常に生育して稔性も維持しており，開 花・結実し，種子を収穫することができた．収穫された種 子も発芽力があり，次世代を生産する稔性も維持していた． 写真は示していないが，発芽した次世代は現在でも温室内 で成長し，莢が形成されている． 他の報告を検証すると，アルファルファの体細胞胚から の形態形成・植物体再生で，炭水化物源としてスクロース やグルコースよりマルトースの効果が高く，これは浸透圧 の影響ではないという報告がある （Strickland et al. 1987）． 本研究でも同じ二糖類であるスクロースとマルトースを同 じ濃度で比較しており，短時間で浸透圧の差が生じたとは 考えにくい．イネ科植物の組織培養，特に葯培養では炭化 水素源としてスクロースではなくマルトースを用いること が一般化しており，外生のマルトースがスクロースより生 体内での加水分解に時間がかかること，それによって弱い 浸透ストレスが長期に渡って続くことが何らかのシグナル と し て 働 い て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る （Last and Brettell 1990, Orshinsky et al. 1990, Lentini et al. 1995, Indrianto et al. 1999, Nageli et al. 1999, Trejo-Tapia et al. 2002, Aguado-Santacruz et al. 2011）．イネ科植物以外では，メロン （Debeaujon and Branchard 1992），白クローバー （Weissinger and Parrott 1993）， ア ス パ ラ ガ ス （Kunitake et al. 1997）， キャッサバ （Li et al. 1998），いくつかの針葉樹 （Norgaard 1997, Blanc et al. 2002, Choudhury et al. 2008, Lara-Chavez et

al. 2011），柑橘類 （de Castro et al. 2010），野生ワタ （Yan et al. 2010） などでもスクロースよりマルトースの方が再分

化に関して効果が高いこと，近年ではイネ形質転換実験で アグロバクテリウムとの共存培養培地の糖としてスクロー スよりマルトースを使う方が形質転換効率が上がったとい う報告もある （Patel et al. 2013）．また，サトウキビ （Brisibe

et al. 1994） やオオムギ （Aguado-Santacruz et al. 2011） の長

期間培養で再分化能を維持するのには糖としてマルトース が役立つ，と報告されている．ダイズ，Jack の長期間培養 でも同様の現象が起こっている起こっているのかもしれ ない． Upper
Lower

Fig. 4. Status of somatic embryos of Jack after 42 months of proliferation culture and 1 month of maturation culture on MSM6 medium. Their proliferation culture conditions were, Upper , 25 months of sucrose medium followed by 17 months of maltose medium;

Lower , 20 month of sucrose medium followed by 8 months of maltose medium and 14 months of sucrose medium again.

A white bar = 1 cm.

A

B

Fig. 5. Somatic embryos after 45 months of proliferation culture. A, FN Lite, sucrose medium; B, FN Lite-M, maltose medium. Bars = 1 cm.

A

B C

Fig. 6. A, Regenerated plants; B, flowers and pods; C, harvested seeds.

マルトースがダイズの再分化における代謝の何に影響し ているのかは未だ不明である．しかし，毎年未熟種子から 体細胞胚を誘導することなく，3 年以上の長期間に渡って 再分可能を維持したまま増殖培養が続けられること，また， その反応は可逆的であるという特性は，今後の形質転換や 生理学実験を行うのに利用できるものと考えられる．

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A Study on the Effect of Maltose in Improving Somatic Embryo Maturation

from Long-term Suspension Culture of Soybean

Tomoko Hatanaka, Yuki Kihara, Tsunemitsu Sakai, Satomi Seta, Hiroshi Fukayama, Syuji Misoo

Graduate School of Agricultural Science, Kobe University

（1-1, Rokkodai, Nada, Kobe, 657-8501, Japan）

Summary: For micropropagation of soybean, somatic embryo induction from immature cotyledons followed by proliferation,

maturation, and conversion culture method is widely used in the world. This protocol is well established with the model cultivar, Jack, however it is also known that the optimal conditions are highly depending on the genotypes. The Japanese elite black soybean, Tanbaguro is one of those recalcitrant varieties. We have been modifying Jack s protocol and obtained regenerated plants even though the ef¿ ciency was still low. During these experiments, we found replacing sucrose to maltose is ef¿ cient for not only maturation culture but also proliferation culture. In general, Jack s embryogenic cells will gradually lose the regeneration potential over two years of proliferation culture. However replacing sucrose to maltose in proliferation culture showed a remarkable recovery of regeneration potential of Jack cells that had completely lost the potential once after long-term （over three years） suspension culture. And this response caused by sucrose-maltose exchange was found to be reversibly occurring.

Keywords: Soybean, long-term suspension culture, maltose, somatic embryo maturation

Journal of Crop Research 60: 47-53（2015） Correspondence: Tomoko Hatanaka (thata@kobe-u.ac.jp)