学位論文の要旨
Clarithromycin Suppresses Chloride Channel Accessory 1
and Inhibits Interleukin-13-Induced Goblet Cell
Hyperplasia in Human Bronchial Epithelial Cells
（
クラリスロマイシンは正常ヒト気道上皮細胞においてクロライド
チャネルアセソリー
1 を抑制しインターロイキン 13 誘導杯細胞過形
成を抑制する）
Akimichi Nagashima
長島 哲理
Respiratory Medicine
Yokohama City University Graduate School of Medicine
横浜市立大学 大学院医学研究科 医科学専攻 呼吸器病学
(Doctoral Supervisor: Takeshi Kaneko, Professor)
（指導教員：金子 猛 教授）
学位論文の要旨
Clarithromycin Suppresses Chloride Channel Accessory 1
and Inhibits Interleukin-13-Induced Goblet Cell
Hyperplasia in Human Bronchial Epithelial Cells
（
クラリスロマイシンは正常ヒト気道上皮細胞においてクロライド
チャネルアセソリー
1 を抑制しインターロイキン 13 誘導杯細胞過形
成を抑制する）
http://aac.asm.org/content/60/11/6585.long 1．序論 気管支喘息患者の気道上皮においては，抗原刺激によってTh2 型サイトカインの増加と 気道炎症が引き起こされる．長期罹患患者においては，気道上皮基底膜下の線維化や平滑 筋の肥厚，粘液下腺過形成・肥大などによる気道リモデリングがおこり，非可逆的な気流 制限と持続的な気道過敏性の亢進をもたらす．Th2 型サイトカインのうち，インターロイ キン（interleukin: IL）-13 の刺激によって杯細胞過形成・化生や気道過分泌が引き起こさ れる(Zhu et al., 1999)．また，気道粘液中の糖蛋白の主要構成要素であり，粘稠度を高める 物質としてムチン蛋白が知られている．IL-13 刺激によって杯細胞化成過形成・化生と共に ムチンをコードする遺伝子のひとつである MUC5AC の発現が増加する．IL-13 刺激はIL-13 レ セ プ タ ー か ら janus kinase （ JAK ） / signal transducer and activator of transcription（STAT）6 経路を介して MUC5AC 産生を増加させると考えられている (Kuperman et al., 2002)．JAK/STAT6 を介し MUC5AC 発現へ至るシグナル伝達経路に関 しては，SAM（sterile α-motif) pointed domain containing ETS transcription factor （SPDEF）や chloride channel accessory 1（CLCA1）の関与が考えられている(Chen et al., 2009; Yu et al., 2010)．また，上皮成長因子（epidermal growth factor: EGF）受容体から の刺激がextracellular signal-regulated kinase (ERK1/2)を介し MUC5AC 発現を増強する ことも報告されている (Rose and Voynow, 2006)．
クラリスロマイシンはマクロライド系抗菌薬のひとつであり，抗菌作用の他にも免疫調 整作用や気道粘液過分泌の抑制作用を有することが報告されている(Wong et al., 2014)．正 常ヒト気道上皮（normal human bronchial epithelial: NHBE）細胞やびまん性汎細気管支
抑制することが報告されているが，その機序に関しては不明な点が多い．
今回，NHBE 細胞を用いて，IL-13 刺激により誘導された MUC5AC 産生及び杯細胞過 形成に対するクラリスロマイシンの効果を検討した．さらにそのメカニズムに関して， MUC5AC 産生に関与すると考えられている SPDEF や CLCA1 に対するクラリスロマイシ ンの効果も検討した．
2． 実験材料と方法
NHBE 細胞を IL-13（5ng/mL）存在下あるいは非存在下で，Air-Liquid Interface（ALI）
法を用いて培養した．ALI 開始日を Day0 とし，Day14 まで 14 日間クラリスロマイシンを
（0，8，16，32 μg/mL）の濃度群に分けて添加し各群での効果を検討した．Day0 に刺激
を開始して 30 分後に細胞溶解物を回収し解析した．IL-13 添加群・非添加群において，
STAT6 と ERK1/2 のリン酸化についてウェスタンブロッティング法を用いて測定した．さ
らにクラリスロマイシン投与による STAT6，ERK1/2 のリン酸化への影響を検討した．
Day14 時点でパラフィン標本を作製し，hematoxylin and eosin（HE）染色と MUC5AC
免疫染色を用いて組織学的検討を行った．また，IL-13 刺激による MUC5AC 遺伝子発現誘
導に関与すると考えられているSPDEF，CLCA1 mRNA 発現に関しても検討した．Day14
にRNA を回収しリアルタイム polymerase chain reaction（PCR）を用いて mRNA を測定
した．統計解析はunpaired t-test を用いて行い，p < 0.05 を有意とみなした．
3． 結果
組織学的検討では IL-13 添加によって杯細胞過形成が誘導され，クラリスロマイシン添
加によって杯細胞が抑制された．また，MUC5AC 免疫染色においても IL-13 添加によって
MUC5AC 陽性細胞が増加し，クラリスロマイシンの添加によって MUC5AC 陽性細胞は減 少した．IL-13 添加によって MUC5AC mRNA 発現は有意に増加し，クラリスロマイシン 添加のよって濃度依存的に抑制された． SPDEF と CLCA1 mRNA に関しても，IL-13 刺 激によって発現が増加し，クラリスロマイシンの添加によって濃度依存的に有意に発現が
抑制された．STAT6 に関しては，IL-13 刺激によって STAT6 のリン酸化が増加したが，ク
ラリスロマイシン添加による影響は認めなかった．ERK1/2 に関しては，IL-13 刺激によっ
て ERK1/2 のリン酸化は変化しなかったが，クラリスロマイシンの添加によってコントロ
ール群と比較しERK1/2 のリン酸化は抑制された．
4．考察
NHBE 細胞において IL-13 刺激は杯細胞過形成と MUC5AC mRNA 発現を増加させる．
クラリスロマイシンは IL-13 誘導 MUC5AC と杯細胞過形成を抑制する．その効果は，
引用文献
Chen, G., T. R. Korfhagen, Y. Xu, J. Kitzmiller, S. E. Wert, Y. Maeda, et al. (2009). SPDEF is required for mouse pulmonary goblet cell differentiation and regulates a network of genes associated with mucus production. J Clin Invest 119(10): 2914-2924.
Kuperman, D. A., X. Huang, L. L. Koth, G. H. Chang, G. M. Dolganov, Z. Zhu, et al. (2002). Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med 8(8): 885-889.
Rose, M. C. and J. A. Voynow (2006). Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiol Rev 86(1): 245-278.
Wong, E. H., J. D. Porter, M. R. Edwards and S. L. Johnston (2014). The role of macrolides in asthma: current evidence and future directions. Lancet Respir Med 2(8): 657-670.
Yu, H., Q. Li, V. P. Kolosov, J. M. Perelman and X. Zhou (2010). Interleukin-13 induces mucin 5AC production involving STAT6/SPDEF in human airway epithelial cells. Cell Commun Adhes 17(4-6): 83-92.
Zhu, Z., R. J. Homer, Z. Wang, Q. Chen, G. P. Geba, J. Wang, et al. (1999). Pulmonary expression of interleukin-13 causes inflammation, mucus hypersecretion, subepithelial fibrosis, physiologic abnormalities, and eotaxin production. J Clin Invest 103(6): 779-788.
論文目録
Ⅰ 主論文
Clarithromycin Suppresses Chloride Channel Accessory 1 and Inhibits Interleukin-13-Induced Goblet Cell Hyperplasia in Human Bronchial Epithelial Cells Akimichi Nagashima, Masaharu Shinkai, Masahiro Shinoda, Tadasuke Shimokawaji, Yasuhiro Kimura, Kei Mishina, Takashi Sato, Mariko Toda, Yoshiaki Inayama, Bruce K. Rubin and Takeshi Kaneko:
Antimicrobial Agents and Chemotherapy Vol.60, No.11, Pages 6585-6590, 2016
Ⅱ 副論文 なし
Ⅲ 参考論文
HO-1 inhibits IL-13-induced goblet cell hyperplasia associated with CLCA1 suppression in normal human bronchial epithelial cells
Kei Mishina, Masaharu Shinkai, Tadasuke Shimokawaji, Akimichi Nagashima, Yusuke Hashimoto, Yoriko Inoue, Yoshiaki Inayama, Bruce K. Rubin, Yoshiaki Ishigatsubo, Takeshi Kaneko：
