改良型神経伝達物質放出測定装置によるE1マウス海馬切片よりの神経伝達物質放出と抗てんかん薬ゾニサミドの影響に関する研究

改 良 型 神 経 伝 達 物 質 放 出測 定 装 置 に よ るElマ

ウ ス 海 馬

切 片 よ りの神 経 伝 達 物 質 放 出 と抗 て ん か ん薬

ゾニ サ ミ ドの影 響 に関 す る研 究

岡山大 学 医学部 附 属分 子細 胞 医学研 究 施設 神経 情報 学部 門(指 導:森

昭 胤教 授)

遠

藤

敦

(平成7年1月9日 受 稿)

Key words: Elマ ウ ス,ア ス パ ラ ギ ン 酸, γ-ア ミ ノ 酪 酸,ゾ ニ サ ミ ド,け い れ ん

緒 言 興 奮 性 ア ミ ノ酸 で あ る グ ル タ ミン 酸 お よ び ア ス パ ラ ギ ン 酸,な らび に,抑 制 性 ア ミ ノ酸 で あ る γ-ア ミノ 酪 酸(GABA)系 の 異 常 が,け い れ ん あ る い は て ん か ん の 発 症 に 重 要 な 役 割 を 演 じ て い る と考 え られ て お り,て ん か ん 患 者 の 他, Elマ ウ ス な ど の 自 然 発 症 て ん か ん モ デ ルや,そ の 他 の 実 験 動 物 に つ い て 様 々 な 研 究 が な さ れ て い る1-6). Elマ ウ ス は, 1959年,今 泉 ら7,8)によ っ て 発 見 さ れ,純 系 化 さ れ た 強 直 性 間 代 性 け い れ ん を 起 こ す 優 性 遺 伝 性 マ ウ スで あ る. Elマ ウ ス の け い れ ん 発 作 は 自然 発 症 性 で あ るが,け い れ ん の 実 験 モ デ ル と し て 使 用 す る場 合 に は 通 常,放 り上 げ 刺 激 や シー ソー 刺 激9)な どの 体 位 変 換 刺 激 を生 後4週 齢 頃 よ り1週 間 に1回 ま た は2回 与 え, け い れ ん 発 現 後 こ の 刺 激 を さ ら に4週 間 継 続 す る こ と に よ り,ほ ぼ100%のElマ ウ ス が,放 り 上 げ 刺 激 に よ りけ い れ ん 発 作 を誘 発 さ れ る よ う に な る.本 研 究 に お い て は 上 記 の 刺 激 を 与 え, け いれ ん 発 作 か容 易 に誘 発 され る もの をstimulat ed Elマ ウ ス(El [s])と し,上 記 の 刺 激 を与 え て い な い も の をnon-stimulated Elマ ウ ス(El

[ns])と し て 区 別 した. El [s]に つ い て は,現 在 ま で 多 くの 研 究 が 行 わ れ て お り,脳 波 記 録 に よ る と, El [s]の 安 静 時 に お い て,両 側 性,散 発 性 の 棘 波 が 出 現 す る こ と10)や,け いれ ん 中 に は 高 振 幅 多 棘 波 あ る い は 発 作 波 が 出 現 す る こ と11)が観 察 さ れ て お り,発 作 型 と して はcomplex partial seizures with sec ondary generalizationあ る い は 側 頭 葉 て ん か ん の モ デ ル と され て い る12).ま た, Elマ ウ ス の け いれ ん 発 現 機 構 に 関 して は,ア ミノ酸 の他, acetyl choline, catecholamine, 5-hydroxy-tryptamine, glutathione, RNA, c-AMP,カ

ル シ ウ ム お よ び グ ル コ ー ス代 謝 な ど の 多 岐 に わ た る 生 化 学 的 異 常 が 認 め ら れ て い る13). そ れ らの 異 常 の う ち,興 奮 性 お よ び 抑 制 性 ア ミ ノ酸 神 経 伝 達 系 の 異 常 は 特 に 注 目 され てお り, い くつ か の 報 告 が な さ れ て い る が14-16),脳 の 部 位 別 分 析 を行 っ た 検 討 に よ る と放 り上 げ 刺 激 を 行 っ て い な い もの,す な わ ちEl [ns]の 大 脳 皮 質 や 海 馬 に お い て は,興 奮 性 ア ミノ 酸 で あ る グ ル タ ミン 酸 お よ び ア スパ ラ ギ ン 酸 が,対 照 マ ウ ス(ddY系 マ ウ ス: Elの 母 系 で け い れ ん 素 因 が な い)に 比 較 して 高 値 で あ る こ と,お よ び 放 り 上 げ 刺 激 を 与 え て け い れ ん を誘 発 させ て い る も の,す な わ ちEl [s]に お い て は そ れ らが,い ず れ もEl [ns]に 比 べ 低 下 して い る こ と な ど が 認 め ら れ て い る.他 方, El [s]の 抑 制 性 ア ミ ノ酸 で あ るGABAはEl [ns]に 比 し,海 馬 お よ び 線 条 体 に お い て 低 下 し て い る こ とが 明 ら か に さ れ て い る17).さ ら に,け い れ ん 直 前 期 に は,脳 の 特 定 部 位 で グ ル タ ミ ン酸 値 が 有 意 に 増 加 し,ア ス パ ラ ギ ン酸 とGABA値 が 有 意 に 減 少 す る こ とが 認 め ら れ て い る17).こ れ ら の 事 実 はElマ ウ ス の 脳 内 に お い て は,け い れ ん 発 現 機 構 に 関 係 69

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して,グ ル タ ミ ン酸 と と も に ア ス パ ラ ギ ン 酸 お よ びGABAの 代 謝 異 常 の あ る こ と を 示 唆 す る もの で あ る. ゾ ニ サ ミ ド(3-sulfamoyl-methyl-1, 2-ben zisoxazole) (Fig. 1)は 臨 床 的 に は 部 分 発 作

(partial-onset generalized seizures, simple partial and/or complex partial seizures)に 有 効 で あ り,強 直,間 代 発 作 を 伴 う 全 般 発 作 の 治 療 に も広 汎 に 使 用 さ れ て い る 抗 て ん か ん 薬 で あ る が18),薬 理 学 的 に は ゾ ニ サ ミ ドは, GABA レ セ プ タ ー の ベ ン ゾ ジ ア ゼ ピ ン あ る い は ム シ モ ー ル 結 合 部 位 に 結 合 す る こ と19)_{,お よび 培 養 脊 髄} 神 経 細 胞 の 発 作 性 活 動 電 位 を抑 制 す るこ と20)など が 知 ら れ て い る.本 研 究 に お い て はElマ ウ ス の 発 作 発 現 機 構 と と もに ゾ ニ サ ミ ドの 抗 け い れ ん 作 用 機 序 解 明 の 一 環 と し て, Elマ ウ スの 海 馬 切 片 か ら のGABA放 出 を新 た に 改 良 し た 神 経 伝 達 物 質 放 出 測 定 装 置 を 用 い て 測 定 し,そ れ ら に 及 ぼ す ゾ ニ サ ミ ドの 影 響 を検 討 す る こ と を 試 み た.さ ら に, Elマ ウ ス の[3H]ア ス パ ラ ギ ン 酸 放 出 に 関 し て わ れ わ れ の 研 究 室 よ りす で に 報 告 が 行 わ れ て い る の で, [3H]ア ス パ ラ ギ ン 酸 の 放 出 に つ い て も一 部 検 討 し た. 材 料 と 方 法 1. 実 験 動 物 Elマ ウ ス は 当 教 室 で 飼 育 保 存 して い る も の を 使 用 し た.実 験 動 物 は12時 間 明 暗 サ イ クル(午 前6時 よ り午 後6時 ま で を 明 期)の も とに 飼 育 し た.飼 料 は オ リエ ン タ ル 酵 母 工 業(株)製の 標 準 飼 料MFを 使 用 し,水 は 自由 に 摂 取 させ た. Elマ ウ ス に け い れ ん を誘 発 さ せ る た め に,生 後4週 目 よ り,放 り上 げ 刺 激(月 曜 と木 曜 の2 回,板 上 で 約10cmの 高 さ に80回 放 り上 げ る)を 毎 週 連 続 して 行 っ た.実 験 に 際 し て は,同 腹 の Elマ ウ ス を2群 に 分 け,そ の1群 に 放 り上 げ 刺 激 を 行 いEl [s]と し,放 り上 げ 刺 激 を行 わ な い も の をEl [ns]と し た.な お,放 り上 げ 刺 激 群 El [s]は,毎 回 の 放 り上 げ 刺 激 に よ り,少 な く て も 連 続 し て5回 以 上 け い れ ん を起 こ す マ ウ ス を 使 用 し た.放 り上 げ 刺 激 は,朝9時 か ら12時 の 間 に 行 っ た. Elの 発 作 の 頻 度 は 雌 雄 に 関 係 な い の で,実 験 に は20-25週 齢 の も の を 性 差 な く 使 用 し た.屠 殺 は 頚 椎 脱 臼 に よ っ た が, El [s] に お い て は 最 終 け い れ ん 誘 発 後,少 な く と も24 時 間 後 の も の を用 い た.全 脳 は 迅 速 に 摘 出 し, 氷 上 で, Glowinski and Iversenの 方 法21)に 従

っ て 両 側 海 馬 を摘 出 した.

Zonisamide (1-Sulfamoylmethyl-1, 2-benzisoxazol: C8H8N2O3S) Fig. 1  Chemical structure of zonisamide.

2. 試 薬

ゾ ニ サ ミ ドは 大 日本 製 薬(株)よ り恵 与 さ れ た. [3H]ア ス パ ラ ギ ン 酸 お よ び[3H] GABAは NEN Research Products社 よ り購 入 し た.そ の 他 の 試 薬 は 市 販 の 最 高 純 度 の もの を使 用 した.

3. 神 経 伝 達 物 質 放 出 測 定 法

摘 出 した 両 側 海 馬 を,秤 量(15-22mg)し た の ち,海 馬 組 織 を 神 経 細 胞 層 の 構 造 が 水 平 面 に 垂 直 に な る よ うに 固 定 し, Mcllwain tissue chop perを 用 い て, 2次 元 的(縦 横)に そ れ ぞ れ0.3 mmの 厚 さ に 切 片 を 作 成 し,た だ ち に4.5mlの Krebs-Ringer-bicarbonate-glucose buffer (KRB液)に 投 入 し た. KRB液 の 組 成(各 々 mM)は 下 記 の ご と く で あ る. NaCl 124 KCl 3.5 KH2PO4 1.2 MgSO4・7H2O 1.3 CaCl2 1.2 NaHCO3 25 glucose 10 (pH: 7.4) 他 方,神 経 伝 達 物 質 放 出 刺 激 に 用 い た 高K+濃 度灌 流 液 に は,上 記 の う ちNaClお よ びKClの 濃度 を 下 記 に 変 え た. NaCl 74 KCl 53.5 実 際 の 神 経 伝 達 物 質 放 出 の 測 定 は 以 下 に 述 べ る 手 順 で 行 っ た.ま ず,海 馬 切 片 は95%O2-5% CO2飽 和 のKRB液 中 で5分 間, 37℃ の 水 槽 中 に て,あ らか じめ イ ン キ ュ ベ ー ト し た.こ の プ レ-イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン の 後, 500μM [3H]ア ス

パ ラ ギ ン酸 あ る い は[3H] GABA(最 終 放 射 能 量,各370KBq/5ml)をKRB液 に加 え,さ ら に37℃ で30分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し,上 記 の[3H] 標 識 ア ミ ノ酸 を切 片 に 取 り込 ませ た.次 い で, 切 片 を特 殊 な ステ ン レ ス ス チ ー ル 製 の チ ェ ン バ ー(シ リ ン ジ)(ア ドバ ン テ ッ ク東 洋(株))を一 部 改 良 し た も の(Fig. 2)に 移 す と共 に,培 養 液 を 濾 過 し た.市 販 品 の シ リン ジ の 内 部 に は1枚 の ス テ ン レ ス ・メ ッ シ ュ(ボ ア-サ イ ズ0.1×0.2 mm)が 配 置 され て い る が,筆 者 は さ ら に も う1 枚 の ス テ ン レ ス ・ メ ッ シ ュ を 挿 入 し,両 メ ッ シ ュ の 間 に 海 馬 組 織 片 を 保 持 で き る よ う に 改 良 し た(Fig. 2).ま ず,下 半 分 を 使 用 し て,下 方 の ス テ ン レ ス ・ メ ッ シ ュ 上 に イ ン キ ュ ベ ー ト後 の 海 馬 切 片 を 含 むKRB液 を 流 し て 培 養 液 の み を 流 出 さ せ た.培 養 液 の 濾 取 後,ス テ ン レ ス ・ メ ッ シ ュ 上 に 均 一 に 置 か れ た 海 馬 組 織 切 片 上 に ポ リ エ チ レ ン テ レ フ タ レ ー ト製 の リ ン グ と さ ら に も う1枚 ス テ ン レ ス ・ メ ッ シ ュ を サ ン ド イ ッ チ 状 に 重 ね,シ リ ン ジ の 上 半 部 分 を 接 続 し た.つ い で,シ リ ン ジ の 上 下 を 反 転 し 気 泡 を 除 い た 後, Fig. 3に 示 す 神 経 伝 達 物 質 放 出 測 定 装 置 に シ リ コ ン チ ュ ー ブ(内 径1.0mm)で 接 続 し,ペ リ ス タ ポ ン プ(Atto Co., Ltd.)を 用 い て 灌 流(流 速: 1.55ml/min)を 行 っ た.灌 流 溶 出 液 は 全 実 験 期 間30秒 ご と に フ ラ ク シ ョ ン ・コ レ ク タ ー(Signal Fracon,東 京 化 学 工 業 産 業)を 用 い て 液 体 シ ン チ レ ー タ ー カ ウ ン タ ー 用 バ イ ア ル に 収 集 し た(1 フ ラ ク シ ョ ン: 35 drops/tube/30 sec).

Fig. 2  Stainless steel syringe holder.

Fig. 3  Experimental apparatus for neurotransmitter release.

切 片 の 灌 流 は(Fig. 4),ま ず, 95%O2-5% CO2飽 和(以 下 い ず れ も同 様)のKRB液 を 用 い て10分 間 行 っ た 後,コ ッ ク を切 り替 え て 高K+ 濃 度 灌 流 液 で2分 間 灌 流 した(Stim. 1).つ い で, コ ッ ク を切 り替 え て,再 びKRB液 で10分 間 灌 流 し た の ち,再 び コ ッ ク を 切 り替 え て 薬 物(ゾ ニ サ ミ ド)を添 加 し た 高K+濃 度 灌 流 液 で2分 間

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遠

藤

敦

灌 流 し た(Stim. 2).上 記 灌 流 の 終 了 後,組 織 切 片 の 放 出 機 能 が 正 常 で あ る こ と を 確 認 す る た め, KRB液 で10分 間,つ い でStim. 1と 同 様 に 高K+ 濃 度 灌 流 液 で2分 間,さ ら にKRB液 で9分 間 の 灌 流 を 行 っ て 灌 流 を 終 了 し た.つ い で,灌 流 期 間 中 に 収 集 し た 溶 出 液 の 各 フ ラ ク シ ョ ン に, 液 体 シ ン チ レ ー タ ー(Clear sol 1.ナ カ ラ イ) を 加 え て,液 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン ・カ ウ ン タ ー (Tricarb-2260, Packard)に よ り,各 フ ラ ク シ ョ ン 中 の 放 射 能 量 を 測 定 し た.そ れ ら の 測 定 値 か らFig. 5上 段 に 示 す よ う な グ ラ フ を 得 る こ と が で き る が,高K+濃 度 灌 流 液(Stim. 1)お よ び ゾ ニ サ ミ ド添 加 高K+濃 度 灌 流 液(Stim. 2)に 対 応 し て 溶 出 し た 全[3H]標 識 ア ミ ノ 酸 の 放 射 能(dpm)か ら 組 織 切 片 の 非 刺 激 性 の 自 発 放 出 量(spontaneous release:そ れ ぞ れSR1お よ びSR2)のdpmを 差 し 引 い た 値,す な わ ち 刺 激 に よ っ て 促 進 さ れ た[3H]標 識 ア ミ ノ 酸 (K+-stimulated release:そ れ ぞ れKR1お よ びKR2)のdpmを 計 算 し た.さ ら に,ゾ ニ サ ミ ド の[3H]標 識 ア ミ ノ酸 放 出 の 効 果 は 次 の よ う にrKR (relative KR)に よ り 判 定 し た. KR1=Stim. 1に よ る[3H]全 放 出 量(dpm)-SR1 (dpm) KR2=Stim. 2に よる[3H]全 放 出 量(dpm)-SR2 (dpm) rKR=KR2 (dpm)/KR1 (dpm)

Fig. 4  Experimental schedule in neurotransmitter release from isolated hippocampal slices.

3. 統 計 処 理

統 計 処 理 はKruskal-Wallis testに よ っ た.

結 果

Fig. 5  Representative patterns of [3H]-amino

acid release from hippocampal slices of

El mice using the new method (upper

panel) and the old method (lower panel).

KR1 and KR2 show [3H]-amino acid

release stimulated by high K+ (50mM)

(Stim. 1) and high K+ with/without

zonisamide (Stim. 2), respectively .

従 来,わ れ わ れ の 研 究 室 に お い て 使 用 し て い た脳 切 片 よ りの 神 経 伝 達 物 質 放 出 測 定 装 置23-25) を,特 に 脳 切 片 灌 流 チ ェ ンバ ー,灌 流 液 切 替 え 用 コ ッ ク お よ び 連 結 チ ュ ー ブ に 改 良 を加 えFig. 2お よ びFig. 3に 示 す よ うな 神 経 伝 達 物 質 測 定 実 験 系 を作 成 した. Fig. 5上 段 に 改 良 型 神 経 伝 達 物 質 放 出 測 定 装 置 を 用 い た と き の[3H]標 識 ア ミ ノ酸 の 放 出 パ ター ン を 示 し,従 来 の 装 置 を 用 い た 場 合 の 結 果(Fig. 5下 段)と 対 比 させ た.本 研 究 で 用 い た 改 良 型 装 置 を 用 い る と,放 出[3H] 標 識 ア ミ ノ酸 量 の 基 礎 値 が 高 く,ま た,高K+刺 激 に 対 し て3回 と も鋭 敏 に 反 応 し て 放 出 さ れ た

(Fig. 5上 段).一 方,従 来 の 装 置 で は 高K+刺 激 に 対 し て[3H]標 識 ア ミ ノ酸 の 放 出 反 応 は1回 の み しか 起 ら ず,し か も ゆ っ く り と した 放 出 反 応 で,刺 激 を終 了 して も[3H]標 識 ア ミ ノ酸 の 放 出 は 直 ち に は 停 止 せ ず,反 応 の 鋭 敏 さ に 劣 っ て い た(Fig. 5下 段). 改 良 型 神 経 伝 達 物 質 放 出 測 定 装 置 が 従 来 の 装 置 よ り優 れ て い る こ とが 確 認 で き た の で,ま ず, Elマ ウ ス 海 馬 切 片 よ りの[3H]ア スパ ラ ギ ン酸 の 放 出 を 測 定 す る と と も に,そ の 放 出 に 対 す る ゾ ニ サ ミ ドの 影 響 を検 討 し た.そ の 結 果,こ の 装 置 を使 用 し たEl [ns]の 海 馬 切 片 よ りの 高K+ 濃 度 灌 流 液(Stim. 1)に よ る[3H]ア スパ ラ ギ ン 酸 放 出 量 は7.62±3.31(×103)dpmで あ っ た. つ い で ゾ ニ サ ミ ド(20お よ び50mg/l)を 添 加 した 高K+濃 度 灌 流 液(Stim. 2)に よ る放 出 を 測 定 し た が,ゾ ニ サ ミ ドの い ず れ か の 濃 度 に お い て も [3H]ア スパ ラ ギ ン 酸 の 放 出 量 に は 有 意 な 影 響 が 認 め ら れ な か っ た(Fig. 6). 次 に, El [ns]の 海 馬 切 片 よ りの[3H] GABA の 放 出 量 を 測 定 し た 結 果, Stim. 1に よ る放 出 量 は51.1±9.61(×103)dpmで あ っ た.ゾ ニ サ ミ ド(25お よ び50mg/l)を 添 加 した 高K+濃 度 灌 流 液 に よ っ て は,ゾ ニ サ ミ ドの 用 量 依 存 的 に[3H] GABAの 放 出 は 亢 進 した(Fig. 7).し か し, El [s]の 海 馬 切 片 に つ い て は,ゾ ニ サ ミ ド添 加 高 K+濃 度 灌 流 液 に よ る,そ の よ う な[3H] GABA 放 出 量 促 進 作 用 は 認 め ら れ な か っ た(Fig. 8).

Fig. 6  Changes in [3H] aspartic acid release

from hippocampal slices of El [ns] mice

(20-25 weeks old) by zonisamide. Each

value represents the mean±SEM of

8-10 animals. 考 察 神 経 伝 達 物 質 放 出 の 研 究 は1970年 代 よ り行 わ れ て い る26,27)が,われ わ れ の研 究 室 に お い て は 従 来, Minchinの 方 法(1983)19)に 準 拠 し,若 干 の 工 夫 を 加 え た 装 置 を 用 い て 脳 切 片 よ りの セ ロ トニ ン,タ ウ リ ン23)およ び ア ス パ ラ ギ ン酸24,25)の 放 出 に 関 す る 研 究 を行 っ て き た.本 実 験 に お い て は,そ れ ら を改 良 し た装 置 を用 い た が,そ の 主 な 改 良 点 は 次 の ご と くで あ る.

Fig. 7  Changes in [3H] GABA release from

hippocampal slices of El [ns] mice

(20-25 weeks old) by zonisamide. Each value

represents the mean±SEM of 6-10

animals. *p<0.05 and **p<0.01 vs. con trol (0mg/l of zonisamide).

74  遠 藤 敦 切 片 灌 流 チ ェ ンバ ー の か わ りに,ス テ ン レ ス ス チ ー ル 製 の ル ア ー ロ ッ ク式 注 射 器 ホ ル ダ ー を用 い て,ス テ ン レ ス 製 メ ッ シ ュ プ レー ト2枚 で 組 織 切 片 を 保 持 し,外 部 よ り密 封 し て,恒 温 槽 内 で 温 度 制 御(37℃)し て 灌 流 が で き る よ うに し た こ と で あ る.こ の こ とに よ り従 来 の 脳 組 織 切 片 の プ レ イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン か ら灌 流 チ ェ ンバ ー へ の 移 動_{,固 定 の 操 作 が,容 易 か つ 迅 速 に 行} わ れ る よ う に な り,ま た,切 片 に 対 す る灌 流 の 流 れ が 均 一 化 され,さ ら に チ ェ ン バ ー 内 容 が 従 来 の もの(内 容 量1.0ml)に 比 し,約1/3 (0.37 ml)に す る こ とが で き た.そ の た め,従 来 の 方 法24,25)によ り放 出 さ れ る[3H]標 識 ア ミ ノ酸(ア ス パ ラ ギ ン酸)の チ ェ ン バ ー 内 で の 拡 散 が 少 な い た めFig. 5(上 段)で 示 さ れ る グ ラ フ 上 で の 立 ち 上 が りが 鋭 くな り,よ り正 確 な 測 定 値 が 得 ら れ る よ うに な っ た.ま た,従 来 法 に お い て は 高K+濃 度 灌 流 液 に よ る刺 激 を1実 験 につ き1回 し か 行 え な か っ た が,本 装 置 に お い て は 脳 切 片 の 放 出 機 能 が 長 時 間 に わ た っ て 安 定 し て お り, 少 な く と も連 続 して3回 の 刺 激(Stim. 1, Stim. 2お よ び 海 馬 組 織 片 の 放 出 機 能 が 正 常 で あ る こ との 確 認 の た め の 再 度 のStim. 1)に 対 応 して, [3H]標 識 ア ミ ノ酸 放 出 の 測 定 が 可 能 で あ っ た. 次 に,灌 流 方 法 に つ い て も改 良 を加 え た.ま ず, Fig. 3に 示 す ご と く, KRB液,お よ び2種 類 の 高K+濃 度 灌 流 液 は 常 に ペ リ ス タ ポ ン プ に よ り連 結 チ ュ ー ブ を 流 れ て い る が,コ ッ クに よ り必 要 の な い 灌 流 液 は ドレ イ ン へ と 流 れ 出 て い る.灌 流 実 験 は メ イ ン コ ッ ク とサ ブ コ ッ クを 併 用 して, 高K+濃 度 灌 流 液(Stim. 1 bottle),あ る い は ゾ ニ サ ミ ド を添 加 し た 高K+濃 度 灌 流 液(Stim. 2 bottle)が,そ れ らの コ ッ ク の 切 替 え に よ り,直 ち に チ ェ ン バ ー に 移 行 す る よ う工 夫 さ れ て い る. ま た,両 コ ッ ク と も 空 気 を 同 時 に 流 して お り, コ ッ ク切 替 え 時 に,連 結 シ リ コ ン チ ュ ー ブ 中 に 小 さ な 気 泡 を挿 入 す る こ と に よ り,切 り替 え ら れ た 灌 流 の 混 合 を 防 ぐよ う に し た.

Fig. 8  Changes in [3H] GABA release from

hippocampal slices of El [ns] mice

(20-25 weeks old) by zonisamlde. Each value

represents the mean±SEM of 8-10

animals. 本 研 究 に お い て は,上 記 の 改 良 型 神 経 伝 達 物 質 測 定 装 置 を用 い て,抗 て ん か ん 薬 で あ る ゾ ニ サ ミ ドが, El [ns]海 馬 切 片 よ りのGABA放 出 を 用 量 依 存 的 に 著 明 に促 進 す る こ と を 見 い だ し た. Elマ ウ ス の 脳 内 ア ミ ノ酸 に つ い て は こ れ ま で に い くつ か の 報 告 が な され て い る.す な わ ち, El [ns]に お い て は, Elの 母 系 で,け い れ ん 素 因 の な いddYマ ウ ス に 比 較 し て,脳 内 ア ス パ ラ ギ ン酸 や ,グ ル タ ミ ン酸 な ど の 値 が 高 い こ とや,安 静 時 のEl [ns]とEl [s〕 を比 べ る と, El [s]で は ア ス パ ラ ギ ン酸,グ ル タ ミン酸, GABA 値 が 低 下 して い る こ と,さ らに, El [s]の け い れ ん 直 前 期 に は,グ ル タ ミン 酸 量 が 増 加 し,ア ス パ ラ ギ ン 酸 やGABAは 逆 に 低 下 し,そ の 変 動 は 特 に 大 脳 皮 質,海 馬,中 脳 に お い て 顕 著 で あ る こ とが 報 告 さ れ て い る17). Elマ ウ ス は 先 天 的 に け い れ ん 素 因 を 有 し,自 然 発 生 的 に け い れ ん 発 生 が 誘 発 さ れ る が,わ れ わ れ は,通 常 実 験 に 便 利 な た め,放 り上 げ 刺 激 を行 い,放 り上 げ 刺 激 に よ っ て け い れ ん 誘 発 さ れ る よ う に な っ たElマ ウ ス,す な わ ちEl [s], を用 い て,実 験 の 必 要 に 応 じ て け い れ ん を誘 発 させ て い る が,こ れ ら の 刺 激 誘 発 発 作 は,毎 週 2回 定 期 的 に 行 っ て お り,て ん か ん 患 者 発 作 頻 度 と して 考 え る と,か な り重 症 な て ん か ん モ デ

ル 動 物 とい え る.そ れ に 対 し て, El [ns]は け い れ ん 発 作 歴 が 短 く,軽 症 の て ん か ん モ デ ル動 物 とい え る. 本 実 験 に お い て ゾ ニ サ ミ ドはEl [ns]に 対 し て は, GABAの 海 馬 よ りの 放 出 を 著 明 に 促 進 し た が,こ れ は 比 較 的 経 過 が 短 く,比 較 的 軽 症 の て ん か ん 症 例 に 対 して は,極 め て 有 効 に 抑 制 性 神 経 伝 達 物 質 す な わ ちGABA神 経 系 を 促 進 さ せ る こ と,す な わ ち機 能 低 下 して い るEl [ns] のGABA神 経 系 を放 出 の 段 階 で 賦 活 す る こ と を示 唆 して い る. Elマ ウ ス に お い て は, GABA 神 経 系 に 異 常 が あ る こ とは 既 に 明 らか で あ り, 特 に 海 馬 に お け るGABA神 経 系 の 機 能 低 下 や GABA神 経 細 胞 の 欠 損 が 明 ら か に さ れ て い る28,29).ま た, Elマ ウ スの け い れ ん は ム シ モ ー ル,バ クロ フ ェ ン,ベ ン ゾ ジ ア ゼ ピン, γ-ビ ニ ー ルGABA _{,バ ル プ ロ酸 な ど のGABAレ セ プ} タ ー やGABA代 謝 に 関 与 す る 薬 物 に よ っ て 抑 制 さ れ る こ と も 明 らか に さ れ て い る30).しか し, ゾ ニ サ ミ ドのElマ ウ ス の け い れ ん に 対 す る 抑 制 作 用 は, GABAの 放 出 機 構 に 直 接 関 係 す る も の に加 え て,ド ー パ ミンや セ ロ トニ ン神 経 系 な どの神 経 伝 達 系 を介 す る抗 け いれん 作 用31)を追 求 す る こ と も今 後 の 研 究 課 題 で あ る. 結 論 1. 従 来,わ れ わ れ が 使 用 して き た 脳 切 片 よ り の 神 経 伝 達 物 質 放 出 測 定 装 置 の 切 片 灌 流 チ ェ ン バ ー お よ び 灌 流 経 路 の 制 御 方 法 を 改 良 し,よ り 正 確 か つ 安 定 にElマ ウ ス 海 馬 切 片 よ りの 神 経 伝 達 物 質(ア スパ ラ ギ ン 酸 お よ びGABA)の 測 定 実 験 を行 っ た. 2. Elマ ウ ス 海 馬 切 片 よ りの ア スパ ラ ギ ン酸 に 及 ぼ す ゾ ニ サ ミ ドの 影 響 を調 べ た 結 果,ゾ ニ サ ミ ド(20mg/lお よ び50mg/lの 濃 度)に よ っ て は 影 響 は 認 め られ な か っ た. 3. Elマ ウ ス海 馬 切 片 よ りのGABA放 出 に 対 す る ゾ ニ サ ミ ドの 影 響 を調 べ た 結 果, El [ns] に お い て は ゾ ニ サ ミ ド(25mg/lお よ び50mg/l) は 用 量 依 存 的 にGABAの 放 出 を促 進 す る こ と が 明 らか と な っ た.し か し, El [s]に お い て は ゾ ニサ ミ ドはGABAの 放 出 に 有 意 な影 響 を 与 え な か っ た. 稿 を終 わ るに臨 み,終 始 御 懇篤 な御 指 導 と御 校 閲 を賜 りま した 森昭 胤 教 授,な らびに 本 研 究の 遂 行 に あ た り,種 々 ご協 力 をい た だ い た教 室 の平 松 緑 博 士 (現,(財)山形 県 テ クノ ポ リス財 団 生 物 ラジ カ ル研 究 室),金 野 郁雄 技 官(現,岡 山大 学 医学 部RI研 究 セ ンター),河 合 元子 研 究 生 に心 か ら御 礼 申 し上 げ ます. 本研 究 の要 旨は,平 成5年10月28日 第20回 日本 脳 研 究会(鹿 児 島)に お い て発 表 した. 文 献

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78  遠 藤 敦

Effect

of zonisamide

on neurotransmitter

release

from

hippocampal

slice

of El mice:

A study

of neurotransmitter

release

using

an improved

experimental

system

Atsushi

ENDO

Department

of Neuroscience,

Institute

of Molecular

and Cellular

Medicine,

Okayama

University

Medical

School,

Okayama

700, Japan

(Director:

Prof. A. Mori)

Using an experimental apparatus for estimating neurotransmitter release from brain slices,

which involved an improved type of perfusion chamber and more well-controlled tube lines

than the previous one were aspartic acid and γ-aminobutyric acid (GABA) release from

hippocampal slices from epileptic El mice estimated more exactly and stably. Zonisamide had

no effect on the aspartic acid release from hippocampal slices of El mice by zonisamide.

However, zonisamide accelerated dose dependently GABA release from hippocampal slices of

non-stimulate dEl mice, though no such acceleration was observed in stimulated El mice, i.e.,