長 崎 大 学 水 産 学 部 研 究 報 告 第40号,35「38(1975) 23
ヒ ト エ グ サ の 生 体 凍 結 冷 蔵
右 田 清 治 ・ 潮 田 卓 三*
Freeze-Preservation of Monostroma nitidum, Chlorophyta,
in Viable State
Seiji MIGITA and Takuzo SHIOTA*
From the results of many investigations, it is well known that several species of the algae grown in littoral belt show high frost-resistance. Recently, the freeze- preservation of young thalli has been put into practical use for Porphyra cultivation in Japan. The present report deals with the freeze-preservation of the thalli of Monostroma nitidum using half-dried and wet materials. The results obtained are summarized as follows:
When the thalli were frozen at various cooling velocities ranging from 0.4°C/
min to 110°C /min and thawed in room temperature, they showed, high frost-resist- ance, but the survival-rate of cells frozen in extremely rapid cooling more or
less decreased. In freezing at the low temperatures of 一10。C〜‑70℃ , the cells of thalli could tolerate without any injury above ‑20℃, but survived cells gradually decreased below 一30℃ . The water content of thalli was closely icorrelated with the survival of cells in freeze-preservation. Materials that dried up to about 40 per cent in water content showed high resistance against freeze-injury and many cells of them survived after 8 months' freeze-preservation.
海 藻の 凍結 に 関 す る研 究 は,外 国で はKylin1),Biebl2)など に よ り古 くか ら行 な われ て お り,日 本 で も照 本3〜6)に よ る 一連 の 業 績 が あ り,潮 間帯 に生 育 す る 種 類 の うちに は か な り強 い 耐 凍性 を示 す もの が 知 られて い る。と く に,ア マ ノ リ葉 体 は 凍 結 冷蔵 に よ り長 期 商生 存 す る ので,ノ リ養 殖 の 分 野で は 海 苔網 上 の 発 芽胞 子 や 幼 葉 を 冷凍 し て,一 定 期間 冷 蔵 し た 後 で 海 に 出 し養 殖 す る 冷凍 網 の 活 用や 成 葉 を 冷 凍 保 存 し て 解 凍 後に 果 胞 子 を得 る 技 術 が 開 発 され7〜10),す で に 業 界 に 普 及 し てい る。
一 般 に海 藻 類の凍 結 冷 蔵 で は ,葉 体 よ り水分 が 奪 わ れ る ため,乾 燥 に 強 い海 藻は 凍結 に も強 く,潮 間 帯 上 部 で 干 出 を受 け生 育 す る ヒ トエ グサ も ア マ ノ リ同様 強 い 耐 凍牲 を 示す と考 え られ る 。
そ こで,著 者 らは1971年 と1974年 に 養 殖 種 で あ る緑 藻 ヒ トエ グ サを 凍 結 冷 蔵 し て,冷 却速 度,冷 凍温 度,葉 体 の 含 水 率や 冷 蔵 期 間 な ど と耐 凍 性 との 関 係 に つ い て実 験 した の で,そ れ らの結 果 を報 告 す る。
＊山 口県水産 部(山口 市滝町)
材料と方法
材料のヒトエグサは長崎市茂木沿岸に自生しているものを用いた。実験はおもに1971年4月に採集した 葉体で行ない，材料はできるだけ早く研究室に持ち帰り，当日か翌日までに実験を開始するようにした。ま た，冷蔵期間と耐凍性に関する実験は1974年に補足して実施した。
凍結処理の方法としては，個体による誤差を少なくするため，数個体の葉体を切断して，各個体の1葉片
・づっを他の葉体と共に小管瓶に入れ，・海水中と半乾燥の状態で冷凍したが，解凍後の生存率は試験個体の切 断葉片について判定するようにした。半乾燥状態での凍結は含水率40％に蔭干した材料を管瓶中で密封して 冷凍した。
急速冷却や一30℃以下の冷凍温度の実験ぱ，ドライアイス・アルコールを用い，冷却速度は試料を2重，
3重壁の容器に入れたりドライアイスの量を加減したりして変えた。また，約5 Oc／m in以下の冷却速度や 一20℃以上の凍結冷蔵の実験はi温度を調節した冷凍庫を使用した。なお，温度は容器内の試料の中心に熱 電帯を設置してサーミスタ温度計で記録し，冷却速度は過冷却の再反転点以下の一50Cより所定の温度まで の平均速度で表わした。
葉体の含水率は，倉ra 7）がアマノリで提唱したWet・：Base
W−w W圏
Wは半乾燥の重量
× 100％
wは完全乾燥の重量
で示したが，実際には葉体の余分の水分を布でふきとって，室内に広げて乾燥し，あらかじめ対照の完全乾 燥重量を測定し計算で求めておいた所定の含水率まで轍・した後で，小管瓶に入れ密封し冷凍するようにし
た。
葉体細胞の生死は）f試験個体の切断葉片の任意の10視野を検鏡して生存率を出しその平均値で示したが，
短期冷蔵の場合は容易に判定できるので無処理のまま調べ，長期冷蔵した場合で解凍直後の生死判定がやや 困難なものでは1旧間通気培養後に識別した。
実 験 結 課
冷却速度の影響 ヒトエグサ葉体を海水申でドヲィアィス・アルコールまたは電気冷凍庫を用いて，4段 階の冷却速度で凍結し，直ちに解凍した結果はTable1のようになった。
ヒトエグサの栄養細胞の生存率は，冷却速度40・・2（re／mi nで高い値を示し・ O．ngC／4n i nでやや低く・110。C
／minの過度の急速凍結で凍死が多い傾向がみられた。また，冷凍温度一20℃までと一4（PCまでとでは，前者 の生存率がかなり高くなっている。しかし，ヒトエグサの葉縁部で配偶子を形成した細胞の耐凍性は栄養細 胞に比べかなり小さく，一20℃までの冷凍ではいずれの冷却速度でも生存率は栄養綱胞の場合の約1／2，
一一S0 ℃までの凍結で1は冷却速度2091100・（）／mintsほとんど凍死し・4QC／minで約10％が生存したにすぎな かった。
一方，葉体を含水率40％の半乾燥状態にして，同様な実験を行なった結果は，Table 2のようになの・
一2（PCまでの冷凍ではほとんどすべての細胞が生きており，一4（PCまでの冷凍で生存率は4。，2（PC／miri
で P00％に近い値であったが，a40Cノ血inと110 oC ／minではそれぞれ95，92％とやや低くなっている。また，
配偶子嚢細胞は半乾燥状態の凍結でも弱いが，海水中の場合に地べ・ると生存率はやや高い値を示した。
ところで，ヒトエグサの栄養細胞が凍死すると，細胞が萎縮し角ばって青緑色を呈するが，生存細胞は中 央に1個まれに2個のピレノイドをもち色は黄緑色で凍結前とほとんど変らない。しかし，長期の凍結冷蔵 ではやや色が淡くなる。解凍後の葉体には，一般にこの生死2種の形態の細胞が散在するが（：Fig．2， D）
短時澗冷凍し，解凍直後の凍死過程を詳細に観察すると，アマノリと同様に色素体の分離，拡散，さらに細 胞の膨大がみられる。しかレ，この一連の形態変化はアマノリの場合ほど顕著ではない。その後，原形質の 凝固と萎縮が引続いておき，前述のように萎縮した青緑色の死細胞となる。なお，まれに細胞間に液胞を生
長崎大学水産学部研究報告 第40号（1975）
じた後，萎縮して凍Table 1． ：Effect of cooling velocity on cell−survival of 死する例も観察され Monost「omαthalli f「ozen in sea wate「●
た。配偶子嚢細胞が 凍死したときの形態 egl，生存細胞と類似 し区別が困難である が，細胞の配列が乱 れ配偶子嚢の縁辺部 が細かく凹凸して．い る（：Fig。2， B）。
ただ，これだけでは ce Number in P，arentheses gametangia1 ce−lls生死の判定は容易で
はなく，死細胞がエ リスロシン（1／1000
水溶液）染色で赤変Table 2．
することや培養後の
25
Minimum Cooling veloc正ty
temp． α4℃／min． 4。C／min． 2〔fc／min． 110t／min．
％
一2（地 99 100 100 85
（45）苦 （60） （50） （35）
一4（船
一 88 85 75
（一） （12） （0） （0）
shows survival−rate of
Effect of cooling veloc｛ty on cell一・survival of Monostroma thalli fro zen under ．half−dr ied state．
色の退色で識別でき るよう・であった。
冶凍温度の影響 過慶の低温での凍結 が，ヒトエグサ葉体 の凍死にどのような 影響を及ぼすかを知
）e Number in parentheses shows surv，ival−rate of るため，ドライアイス
gametangial cells・アルコールを用い
て一70℃の温度まで冷却速度49110℃／min（ 冷凍した：。 所定の温度に達した後で，直ちに解凍した結果は Fig．1 のようになった。半乾燥状態での凍結では（Fig．，1， A、：B），一一2 O。Cまでは凍死細胞はほとんどみ
．られず，一30℃でも 95％以上の高い生存率を示すが，それ以下の温度では低温になるほど凍死細胞が増加し ている，また，冷却ffEgi・4・C／nii・とti・・C如n計較すると，儲の過廊急速凍結の方がやや凍死が増え ている。
一方，海水中での凍結では（：Fig．1，c， D），一2び℃までは高い生存率を示しだが，一3（Pc以下の温度 では低温になるほど急激に凍死細胞が増えている。この場合も110。Cl血i恥の急速凍結が4℃／ni inより生存率 は低くなっている。
含水率と耐凍性 アマノリ葉体の男体凍結冷蔵やヒトエグサの前項の実験でも・あらかPめ葉体を半乾燥 状態にして冷凍すると，その耐凍性が高くタることが明らかにされている．ので・ヒ トエグサ葉体を乾燥し含 水率を幾段階かに変えて凍結冷蔵してみた。
その結果，葉体の含水率と耐練性との関係はTable 3のよう．になり・一20℃で1ヵ月凍結冷蔵した場合，
栄養細胞の生存率は葉体の水分量でかなり違っている。すなわち〜含水率40％で生存率は98％と最も高く，
含水率20％が95％でそれに次ぎ，含水率60，8Q％のより多く水分を含む状態ではそれぞれ80，72％と生存率 が低くなる傾向がみられた。さらに，対照の海水中凍結では凍死細胞が極摩に増えている。まtq，冷蔵3カ 月後では・ほぼ同じ傾向がみられ・生存率はやや低下したが・とくに水分を多く含む状鰐での生存率の低下・
が鎖著であった。
冷蔵期間と生存率 前実験で含水率を40％にして凍結冷蔵した場合，3ヵ月後でもかなり高い生存率を示し
．たので，さらに長期聞一2σ℃で冷蔵して，冷蔵期間と生存率との関係を調べてみた。
その結果はTable 4に示すように，実験した3例で幾らか差があり・栄養細胞の生存率はびずれも凍結冷
Mi n imum Cooling，velocity
teml｝． 0．4℃／min． 40C／min． 20煽nin。 1．1 0（b／min．
％
一20℃ ioO 100 100 100
苦i・80） （80） （75） （60）
一40℃ 95 99 96． 92
（10） （25） （15） （5）
蔵の；期間が長く．なると徐々に低下ず る。しかし，．2ヵ月以内では生存率 は各例ともに90％以上の高い恒を示 し（：Fig．2，A）・4，6：カ月を経過 しても平均値では70％，8ヵ月後で も60％以上生き残． oた（Fig・・2，，C
D）d
また，一1げCでも凍結冷蔵してみ 元が，2々月以内の冷蔵で一200Cの 場合と．ほとんど差ぽなく，それより 長期になると生存率は一2〔fCの冷蔵
よりかなり低下するようであった。
なお，海水申凍結では栄養細胞は・
1．，2ヵ月間でほとんど死滅し，配 偶子嚢細胞の半乾燥状態（含水率40
％）でめ凍結でも．1ヵ月以上の冷蔵 に耐えるものはきわめて少なく，2 ヵ月以内に凍死した。
考 察
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凍結の際の冷却速度について1ま・
冷却速度が小さいと氷晶が大きく成 長するので，魚肉など食品の凍結冷 蔵では急速凍結がよいが，細胞の生
o ：i ／O 一一20 一30 一40 一一50 一一60 一70
Temperature Oc
Fig， 1． Ch an ge in ce 1．1−surviyal of Mo TL os−t ro M．．，a t ch alli fro zen at 16区画tem pet atur es of一 ？， ．O O． 一一
丁700 C．
A， Bs freezing of half−dried materials （30 90water content）， C， D； frqezing of wet materials in sea water． A， C； coolin g at about 4 OC ／min． B， D； cooli ng． at ab out 11 00C ／m in．
Table 3． Relation between cell−survival and water cQntent of Monostr6ma thalli freeze−preserved at 一20fic．
Period of
垂窒?唐?窒魔≠狽奄盾氏E
Water content Q0 40 60
％
芙
W0 cont．
1month Rmonths
95 98 80
@ 駐
X0 93 75．
72 10
S0 0 一）e Wet materials frozen in sea water
Table 4． Change in cell−survival of Monostrgma thalli
dur i ng ・ free ze一 pre serva t i on a ir・， 一2 CtC ・ under
half−dried state．
Exp． Period of preservation （months）．
No． 1 2 4 6 8
％．
1 98 95 93 85 70
2 ・100 98 95 88 75
．3 99 92 78 57 53
Average 99 95 88 76 66
存能力を保持するには 冷却速度は或る程度小 さい方がよいと考えら れている11，12）。この実
験結果からも，ヒト エグサ葉体を海水中で 冷凍した場合，栄養細 胞の耐凍性は冷却速度 110。C／minの過度の急 速凍結は40 C／minより
ゃや低くなっている。
また，0，4ac／in inの遅い．
冷却速度でも生存率．は 幾らか小さくなってい
る。ただ，．この実験で は一200，一 40℃に達し た直後に解凍している のでi，，急速凍結ほど猿 結時間が短いといった、
長崎大学水産学部研究報告 第40号（1975） 27
ので・ヒトエグサ の凍結でも生存率
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あり，それより速 度が速くても遅く
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するようで，この 凝 を
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海水中凍結でも適
当な冷却速度であFig・2・層Survived cells of Monostr・mathalli after freeze 一preservation at−20。C under half−dried state．れば，一20。，一40。
A；survived vegetative cells after l months freeze−preservation．
Cでそ・れそれ100・B、dead g。m。・。ngi。l cell。 af・・，・m・n・h． C、・・g・…i・e cell・
88％とかなり高い after 4 months． D； survived and dead cells（d）after 8 months．
値を示すが，配偶 ×670．
子嚢細胞の生存率
は60，12％と低くなっており，半乾燥状態の凍結でも萌らかに凍結に弱いといえる。また，配偶子嚢細胞を 1ヵ月間凍結冷蔵すると生存細胞はきわめてまれであり，配偶子嚢細胞は長期の冷蔵には耐えないものと考
えられる。
冷凍温度の影響をみると，半乾燥状態の凍結で一20℃までは葉体細胞はほとんど100％生存したが，それ 以下の温度では低温になるほど凍死が増え，とくに一50℃以下の温度で急増している。また，海水中凍結の 場合はいずれの温斐でも半乾燥状態の凍結に比べて生存率が低下している。このような傾向はアマノリ葉体 の凍結でも知られており9），ヒトエグサの場合も凍死の少ない安全な冷凍温度は約一20℃以上の温度と考え
られる。
葉体の含水率と耐凍性の関係は，アマノリの凍結冷蔵の場合と同様に深い相関がみられ，葉体の含水率40
％で生存率が高く，含水率80％や海水中凍結の湿った葉体で明らかに凍死が増加するようである。アサクサ ノリ・スサビノリなどの養殖アマノリの冷凍で，生存率の高い含水率は20〜30％とされているが ，ヒトエ グサでは20％になると長期冷蔵でやや凍死が多い傾向がみられるようで，この実験では含水率40％の生存率 が高かったが，最適含水率は今後さら にi検討する必要があろう。
凍結冷蔵の期間が長くなると，凍死細胞は徐々に増加するが，それでも8ヵ月間の冷蔵で60％以上の生存 率を示しており，ヒトエグサ葉体はアマノリとほぼ同じ程度かそれに近い強い耐凍性をもつものと推測され 今後凍結前処理を改善することによりさらに安全に長期間の生体凍結冷蔵ができるものと考えられる。
摘 要
緑 藻 ヒ トエ グ サ 葉 体 の 凍 結 冷 蔵 に お い て,冷 却 速 度,冷 凍 温 度,葉 体 の含 水 率 な どの 条 件 が 細 胞 の 耐 凍 性 に 及 ぽ す 影 響 に つ い て 実 験 し た 。
1
.ヒ トエ グ サ葉 体 を 種 々 の 冷 却 速 度 で 凍 結 した場 合,4℃/minで 最 も生 存率 が 高 く,110℃/minの 過 度 の 急 速 凍 結 で は や や 凍死 が多 か った 。 ま た,配 偶 子嚢 細 胞 の 耐 凍 性 は低 か った 。
2.‑70℃ ま で 段 階 的 な低 温 で 冷 凍す る と,‑20℃ まで は 生 存 率 は 高 い が,‑30℃ 以 下 で は 低 温 に な るほ ど凍 死 細 胞 が 増加 した 。
3.葉 体 の 含 水率 は耐 凍 性 と深 い 関係 が 認 め られ,含 水 率40%で 生 存 細 胞 が 多 く,そ れ 以 上 の 含 水 率 で は 凍 死 が 増 え る 傾 向 が み られ た 。
4.半 乾 燥状 態(含 水 率40%)で 長 期 間‑20℃ の 冷 蔵 で は,期 間 が 長 くな る と徐 々 に 生 存 率 が 低 下 し た が 8ヵ 月 後 で も60%以 上 の 細 胞 が 生 き残 っ た。
文 献
1) Kylin, H. :Uber die Kilteresistenz der Meeresalgen.J3er .Deutsch.
Bat . Ges. 35, 370 — 384 (1917)
2) Biebl , R. : Tiber die Temperature— resistenz von Meeresalgen Versehiedener Klimazonen und Verschieden Tifer Standorte.
J abrb. Wiss. Bat. 88 389 — 420 (1939)
3)照 本 勲:藻 類 の 凍死(綜 説).藻 類,6,99‑106(1958)
4)照 本 勲:ボ ウア オ ノ リの 耐 凍 性.低 温 科 学,生 物 篇,19,23‑28(1961) 5)照 本 勲:冬 の 潮 間 帯 に 生 育 す る海 藻 の耐 凍 性.同 誌,22,19‑28(1964) 6)照 本 勲:ス サ ビノ リの 凍 結 と乾 燥.同 誌,23,11‑20(1965)
7)倉 掛 武 雄 二海 苔 網 冷 蔵 の 手 引.全 海 苔 連,東 京(1966)
8)右 田 清 治:ア マ ノ リ葉体 の 生 体 凍 結 保 存 一1.本 誌,17,44‑54(1964) 9)右 田清 治:ア マ ノ リ葉 体 の 生 体 凍結 保 存 一 皿.本 誌,21,131‑138(1966)
10)右 田清 治 ・山 口 正 市 ・田 中 修 一:ス サ ビノ リ発 芽 殼 胞 子 の 凍 結 冷 蔵.本 誌,3ユ,69‑76(1971) 11)兼 平 信 一:生 物 学 的 材 料 の 凍結 乾 燥 法.第7報.低 温 科 学,生 物 篇,10,137‑162(1953)
12)根 井 外 喜 男 他:生 物 学 的 材 料 あ 凍 結 乾燥 法.第9報.同 誌,12,63‑70(1954)
