NO, PL, PT, RO, SE, SI, SK, TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG). 添付公開書類 国際調査報告条約第 2 1 条 (3))

(12) 特許協力条約に基

づ

て公開さ

_{れた国際出}

願 (19)世界 知的所有 権機関

国際

事務局 (43)国際公開日 (10)国際公開番号 2009 年 10月22 日(22.10.2009)

WO 2009/128461 A l

(51) 国際特 許 分類 ラオ区ス カビバ ン一ワンヒン通り _{1 1 3 1} Cl 2Q 1/48(2006.01) 2 7 Ba 鉢 k (TH)・ビ パ スロジャナメ タクン (21) 国際 出願 番 号 PCT/JP2009/057537 (Vipa Surojanametakul) [TH/TH]; 11140 ノ_ンタブリ 県バ ンヤイ市 バ ン レン9 8 1 4 Nonth乱uri (22) 国際 出願日 2009 年4月 14 日(14.04.2009) (TH). (25) 国際 出願の言語 日本 語 (74) 理人 : 平山 一 幸(HIRAYAMA, Kazuyuki); 〒 開の言語 日木語 1600022 東 京都新宿 区新 宿2 — 3 — 1 O (26) 国際公 _{苑ビル6 階 Tokyo (JP).} 新宿 御 (30) 優先権データ 特願2008-106488 2008 年4月16 日(16.04.2008) JP (81) 定国( 表示のな 限 り_{、全ての種類の国 内保}

可 ) :AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, (71) 出願人 (米国を除< 全ての指定国につ て) :独 BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CN, CO, CR, 立行政法人国際農林 水産業研究セ ンター CU, CZ, DE, DK, DM, Dの, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB,

(JAPAN INTERNATIONAL RESEARCH CENTER GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, FOR AGRICULTURAL SCIENCES) [JP/JP]; T KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS,

3058686 茨城県つ< ば市 大わし 1 一 1 几araki LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX,

(JP). MY, MZ, NA, NG, NI, Nの, NZ, OM, PG, PH, PL, PT, RO, RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY,

(72) 発明者 および TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN,

(75) 発明者

/

願人

(

米国につ てのみ) : 吉 橋 忠、 ZA, ZM, ZW.

(YOSHIHASHI, Ta ashi) [JP/JP]; 〒3050032 茨城県

つ< ば市 竹 園1 丁目1 3 番地2 8 0 3 - 6 0 (84) 国( 表示のな 限り、全ての種類の哀域保

4 几araki (JP)_・ワル—ー バラ—ヤノン(Warun㏄ 可 ) :ARIPO (BW, GH, GM, KE, LS, MW, MZ,

Varanyanond) [TH/TH1; 10900バ ンコク市チ ヤ トゥ NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), --Lーラシア チ ヤック区ラチ ヤタピセク通 り_{3 2 3 6 1} (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), ヨーロ ツパ

4 Ba 鉢 k (TH)・パ チ ヤリ タントラクン

(Patcha-(AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB,

ree Tungtrakul) [TH几 H]; 10230 バ ンコク市ラ_ッフ GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, 続 葉 有] (54) Title: METHOD FOR QUANTIFICATION OF r-AMINOBUTYRIC ACID

(54) 発明の名 称:γ- ア ノ_{酪 酸の定量 方法}

(57) Abstract: Disclosed is a method for quan

tifying γ-aminobutyric acid, which comprises the steps of: producing reduced nicotinamide adenine dinucleotidephosphate by using asp e

cific aminotransferase and a dehydrogenase that n㏄ds to use oxidized nicotinamide ad e

nine dinucleotidephosphate asa coenzyme and deactivating the enzymes, thereby removing any amino acid having a similar structure to that of GABA (e.g., glutamic acid); and acting an electron carrier on NADPH produced in the aforementioned step in the presence of a tetra-zolium salt that can produce a water-soluble formazan dye and measuring the water-soluble formazan dye produced.

(57) 要 約 G A B A と構 造の類似す るグルタ ン酸等のア ノ_{酸を排 除す} るため に 、特異的なア ノ_{基転移 酵} 素、及び補 酵素 として酸 化型二コチン ア ドアデ ン ジ ヌクレオチ ドホス フェー ト_{を要 求す}る脱 水素酵 素 を 用 、還元 型 二コチンア ドアデ ン ジ ヌクレオチ ドホス_{フ ェー}トを生 成さ た後に酵素 を失活 させる せ エ程と、生成 したN A D P Hに水溶性 ホ ルマザ ン色 素 を生 成さ_せる テ ト_ラゾリウム 塩の存 在下、電子伝 達体を作用さ_せ、生成する水溶性 ホ ルマザ ン色 素 を測 定するエ程とからなるγ- ア i の定量 方法 を提供する 。

NO,PL, PT, RO,SE, SI, SK, TR), OAPI(BF,BJ, CF, 添付公開書類

CG, CI, CM,GA, GN, GQ,GW, ML, MR, NE,SN, TD, _{国際調 査 報}

告 条約第2 1条(3))

明

細

書

発

明の

名称

:

ア

一

ア

ミノ

酪

酸

の定

量

方

法

技

術

分野

０００ 本発

明

は

、

ァ一アミノ_酪酸 (以下

、 G

A

A

と

い

う_ことも_ある。) を

、

試 料中に含ま

れ

る各種 アミノ_酸

_の

_{影響を受け}

_ず

_に

_、

_{比色分析によ}

_っ

_て簡易

_・

_迅 速に定量

す

る方法に

関す

る。

背

景技

術

０００

_G

A

A

は天 然界に広 く_存在

_す

_るアミ ノ_酸

_の一

_種であり

_、

_{血圧 降下作用}

_や

、

精神 安定作用など

の

生理機能 性 が 知ら

れ

て

い

る。こ

の

作用を期待 し

、 G

A

A

を添加

、

ある

い

は強化 し

た

食品が多く_製造さ

_れ

_て

_い

_{る (特許 文献 「参照} ) 。ま

た、

穀類種

子

には

G

A

A

は少量 し

か

含ま

れ

て

い

な

い

が

、

種

子

を発 芽 さ

せ

ることにより

_G

_A

_A

_{含有量が 増加}

_す

_{ることが知ら}

_れ

_て

_い

_る (特許 文献

2

参照) 。 ０００3 _穀類種

_{子の G}

_A

_A

_の

_増加は

_、

収穫 後 処理

や

品質により

_異

_なり

_、

_ま

_た、

_発 芽処理等 がさ

れ

G

A

A

含量を強化 し

た

食品に

お

い

ては

、

そ

の

発 芽 処 理によ

っ

て確 実に

G

A

A

が 増加 して

い

ることを消 費者に対 して保証

す

ることが求

め

ら

れ

て

い

る。 ０００ 特許 文献

3

には

、

酸 化 型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌク レオチ ドフ}

_ォ

_スフ ェ

ー

ト又 は酸 化 型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌク レオチ ドフ}

_ォ

_{スフ ェ}

_ー

_トを アルカ リフ

ォ

ス タ

ー

ゼ

によ

_っ

て脱 リン酸 化反 応さ

せ

て

、

酸 化 型二コチンアミ ドアデニ ン ジヌク レオチ ド又 は還元型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌク レオチ} ドヘ変換 し

、

そして

、

還元型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌク レオチ ドを電}

_子

伝達体

の

存在 下 でテ トラゾリ_ウム塩 と反 応さ

_せ

て生成 し

た

ホル マザン色素を 測定

す

るアルカ リフ

ォ

ス タ

ー

ゼ

活性

の

測定法 が開示さ

れ

て

い

る。

先行

技

術 文

献

特

許 文献

０００ 特許 文献 : 特開

2

_００

7

「

_{9 ０}

「

7

号公報

特許 文献 : 特開

_{2 ００3}

_０

「

2

号公報 特許 文献3 _{: 特開}

_{2 ００}

_０

₈

₃

_号公報

発

明が解決

しよ

う

とする

課

題

０００ _し

_か

_し

_、

_{飲 食品}

_の

_ょ

_{ぅに各種 ア}ミノ_酸を含有

_す

_る試料中

_{の G}

_A

_A

_を定量

す

るに

際

し

、

特許 文献

3

の

方法を適用し

た

場 合

、

混在

す

るアミノ_酸

_の

_影響で ホル マザン色素 が沈殿 し

、

正確な測定を行ぅことができな

い

。こ

のため、

飲 食物中

の

ょ

ぅに各種 アミ ノ_{酸が 混在}

_す

_る

_G

_A

_A

_の

_{定量分析 では}

_、

_混合

_す

_る 種

々の

アミ ノ_酸

_の

_{影響を排除}

_す

_る

_ため、

_アミ ノ_酸分析計

_や

」

_C

_等

_の高

_額 機器を用

いた

分離分析 法 が 用

い

ら

れ

て

い

る。 し

か

し

、

こ

の

ょ

ぅな分離分析 法 では

、高

額 機器を必要と

す

るぅえに

、

多検体を同時に分析

す

ることはで きな

い

。そ

のため、

製品に表示さ

れ

る

G

A

A

含量は

、

製品中に実

際

に含ま

れ

て

い

る

G

A

A

含量を必

ず

しも_保証

_す

るには至

_っ

て

い

な

い

と

い

ぅ問題が 指 摘さ

れ

て

い

る。 ０００ _{上記 し}

_た

_ょ

_ぅに

_、

_{飲 食品}

_の

_ょ

_{ぅな各 種 ア}ミ ノ_酸を含有

_す

_る試料中

_{の G}

_A

A

を定量

す

る方法は

、

幾

つかの

課 題を有

す

る。

す

な

わち、

ホル マザン色素を 測定

す

る方法では

、

混在

す

るアミ ノ_酸

_の

_{影響をぅけ}

_、

_{正確な測定がほとん ど} 不可能 で あり

_、

_ま

_た

_{分離分析 法 では}

_、高

_{額 機器を必要と}

_す

_るぅ_えに

、

多検体 を同時に分析

す

ることはで きな

いため

効率 が悪

い

。 ０００8 _本発

_明

_は

_、

_こ

_れ

ら

の

課 題を解決 し

ょ

ぅと

す

るも

_の

_であ

_っ

_て

_、

_アミ ノ_酸分析 計

や

」

C

等

の高

額 機器を用

い

ることなく

_、

_し

_か

_も

_、

_{検体に含ま}

_れ

_る各種 アミ ノ_酸等

_の

_{影響を受けることな}く

_、

_{少量 多検体}

_の

_{試料に含ま}

_れ

_る

_G

_A

_A

を同時に且

つ

簡易

・

迅 速に定量

す

る方法を提 供

す

ることを

目的

として

い

る。 ０００

_G

_A

_A

_e

_は

、

微 生物

や

トマ ト_など様

々

な 生物に存 在

す

る酵 素複合体で あり

_{、 G}

_A

_A

_アミ ノ_{基転移 酵 素活性及びコハク酸脱水素酵 素活性を併}

_せ

_持

つ

。発

明

者等は

、

木酵 素に

ょ

る

G

A

A

か

ら

の

コ_ハク酸 セミ_{アル デヒ ド生成} と

、

生成 し

た

コ_ハク酸 セミ_{アル デヒ ドが酸 化さ}

_れ

_る

_際

_、

_{補酵 素}

_の

_{酸 化 型二コ} チンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドリン酸が}

_、

_還元型

_へ

_定量

_的

_に変換さ

_れ

_る

ことに着

目

し

、

生成 し

た

還元型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドリン} 酸

か

ら

、

電

子

供与体を介 し

た

水 溶性ヒ ドラゾン

の

生成をカ

_ッ

プリングさ

せた

。こ

の

結 果

、 G

A

A

か

ら

の

コ_ハク酸

への

変換 と水 溶性ヒ ドラゾン

の

生成 が カ

_ッ

プリングして行

われ、

比色法によ

_っ

て

G

A

A

の

定量を行う_{ことが可能} とな

_った

。さ らに

、

比色法を利用

す

ることで

、

比較

的

安価なマイクロプレ

ー

ト リ

ー

ダ

ー

を使用

す

ることが可能とな る と ともに

、

反 応 系を縮小

す

ることに 成功し

、

本発

明の

完成に至

った

。

課 題

を解決

する

た

め

の手

段

００ ０

_す

_な

_わち、

_本発

_明

_は

_、

_{飲 食品}

_の

_よう_{に各種 ア}ミノ_酸を含有

_す

_る試料中

_の

_ァ 一アミノ_{酪酸を定量}

_す

_{る方法であ}

_っ

_て

_、

( 「) 試料と

、

ァ一アミノ_{酪酸 ア}ミノ_{基転移 酵 素と}

_、

_{酸 化 型二コチンア}ミ ドアデニ ン ジヌクレオチ ドを補酵 素として要 求

す

る脱水素酵 素とを反 応さ

せ

て還元型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドフ}

_ォ

_{スフ ェ}

_ー

ト_を生成さ

_せ

た

後

、

酵 素を失活

す

るエ程 と

、

(

₂

) 7 溶性ホル マザン色素を生成さ

せ

る テ ト_{ラゾリウム塩}

_の

_{存在 下}

_、

_還 元型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドフ}

_ォ

_{スフ ェ}

_ー

ト_と電

_子

_{伝達体 と} を反 応さ

せ

て水 溶性ホル マザン色素を生成さ

せ

るエ程 と

、

(

₃

) 7 溶性ホル マザンを測定

す

るエ程 と

、

を含

む

ことを特 徴 と

す

る。

発

明の効

果

００ _本発

_明

_は

、 G

A

A

に特

異 的

な アミノ_{基転移 酵 素及びそ}

_の

_{生成 物に特}

_{異 的}

な補酵 素として

N

A

D

を要 求

す

る脱水素酵 素を作用さ

せ、 N

A

D

H

を生 成 し

、つい

で

、 N

A

D

H

に水 溶性テ ト_{ラゾリウム塩}

_の

_{存在 下}

_、

_電

_子

_伝達体 を作用さ

せ、

生成

す

る水 溶性ホル マザン色素を測定

す

ることによ り

_G

_A

_A

を簡易に定量できる

の

で以下

の

効果を有

す

る。 ００ _本発

_明

方法によ

れ

ば

、

アミノ_酸分析計

_や

_H

」

_C

_等

_の高

_{額 機器を必要とし} な

いの

で経済

的

である と共に

、

検体に含ま

れ

る各種 アミノ_酸等

_の

_{影響を受け} ることなく

_、

_{少量 多検体}

_の

_{試料に含ま}

_れ

_る

_G

_A

_A

_{を同時に且}

_つ

_簡易

_・

_{迅 速} に定量

す

ることができる。

００3 _本発

_明

_方法によ

_れ

_ば

_、

_コメなど

_の

_{食品に含ま}

_れ

_る

_G

_A

_A

_{を同時に且}

_つ

_迅 速に定量

す

ることができる

の

で

、

生理機能 が 注

目

さ

れ

て様

々

な食品に添加さ

れ

て

い

る

G

A

A

の

食品中

の

含量を測定

す

ることが可能となり

_、

_こ

_れ

_ら

_の

_製 品中に含ま

れ

る

G

A

A

含量を保証

す

ることができる。 ００ さ らに

、

コメ内在

の

代謝酵 素群を利用し

た

A

の

生成を利用して

G

A

A

を強化 し

た

発 芽玄米 製品に

おい

ても

_、

_A

含量

の

表示をより_正確に 行う_{ことが可能にな}り

_、

_玄米

_の

_{発 芽 処 理}

_の

_失敗により_生じる

G

A

A

含量

の

少な

い

製品

の

検査に利用

す

ることが可能 で ある。ま

た、

本発

明

によ

_っ

て発 芽 処理による

A

含量

の

品種

間

差を容易に検定

す

ることが可能とな る

ため

、

発 芽玄米に向く_品種

_の

_{選抜等に貢献}

_す

_る。 ００

_図

_G

_A

_A

定量

の

原理説

明図

である。

図

A

標準試料を用

いた

検量 線

図

である。

図

3

_{D a}

_b

_誘導化

」

_C

_法で

_の

_{定量 と本発}

_明

_{による定量}

_の

_比較線

_図

である。

図

タ_イ

_国

_に

_お

_{ける各種品種で}

_{の G}

_A

_A

_{生成 能}

_の

_検討

_図

_である。

発

明 を

実

施

す

る

た

め

の最

良

の

形 態

００ 以下

、

本発

明

を実施

す

る

ための

最良

の

形態を実施例により_説

_明す

る。な

お

、

本発

明

は

、

こ

れ

ら実施例に

限

定 さ

れ

るも

_の

_でな

_い

_ことは勿論である。 本発

明の G

A

A

の

定量方法は

、

各種 アミ ノ_酸

_、

_特に

_{、 G}

_A

_A

_{と構 造}

_の

類 似

す

るグルタミ _ン酸等

_の

_アミ ノ_酸を排除

_す

_る

_ため

_に

_、

_特

_{異 的}

_{な ア}ミ ノ_基転 移 酵 素

、

及び補酵 素として酸 化 型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌク レオチ ドホ} スフェ

ー

ト (以下

、 N

A

D

と

い

う_{。) を要 求}

_す

_{る脱水素酵 素 (以下}

_{、 N}

_A

D

要求 性脱水素酵 素とも

_い

う_{。) を用}

_い、

_{還元型二コチンア}ミ _{ドアデニ ン} ジ ヌク レオチ ドホスフェ

ー

ト (以下

、 N

A D

P

と

い

う_{。) を生成さ}

_せた

_後 に酵 素 を失活さ

せ

るエ程 と

、

生成 し

た N

A D

P

に水 溶性ホル マザン色素を 生成さ

_せ

る テ ト_ラゾリ_ウム塩

の

存在 下

、

電

子

伝達体を作用さ

せ、

生成 し

た

水 溶性ホル マザン色素を測定

す

るエ程 と

か

らな る。

[

００

₁

7

_]

_{こ こで}

_、

_{各種 ア}ミノ_{酸 とは}

_、前

_{述 し}

_た

_グルタ ミ _ン酸

_の

_他

_{、 G}

_A

_B

_A

_{と類 似}

す

る構 造を有

す

るアミノ_酸

_、た

_とえば

_、

_グルタ ミ _ン酸

_、

_セ リ_ン

_、

_グリ_{シ ン}

_、

ヒスチジ ンである。

[

００

₁

8

]

アミノ_{基転移 酵 素は}

_{、 G}

_A

_B

_A

_アミノ_{基転移 酵 素 (以下}

_、

_B

_A

_と

い

う_。)

_{、 N}

_A

_D

_p

_要求 性脱水素酵 素は

、

コ_ハク酸 セミ_{アル デ}ヒ ド脱水素酵 素 (以下

、

S

S A

D

H

と

い

う_{。) を例 示}

_す

_{ることができる。}

[

００

₁

9

]

電

子

伝達体は

、

人エ電

子

伝達体

、た

とえば フェナ ジ ンメン ト_{硫 酸 塩} (以下

p

M

S

と

_い

う_。)

_、

「一メ トキシ_{フ ェ}ナ ジ ンメン ト硫 酸 塩 (以下

、

「

e

O

M

S

と

い

う_。)

、

_{フ ェ}ナ ジ ン エ ト_{硫 酸 塩} (以下

、

P

三

_S

_と

_い

う_。) を例 示

す

ることができる。

[

００2０

]

水 溶性ホル マザン色素を生成さ

せ

る テ ト_{ラゾリウム塩は}

_、

_例えば

₂

(

₂

一メ ト_キシー

₄

ナ ニ トロ_{フ ェニル )} ト リウム塩 (以下

、

3

W

(

₄

S

T

ニ トロ_{フ ェニル )} テ ト_{ラゾリウム}

₈

_と

_い

う_{。) を例 示}

_す

2

H

ること ができる。

[

００2

₁

]

本発

明の

原理を

図

「に示

す

。本発

明

は

、

飲 食品

の

よう_{に各種 ア}ミノ_酸を含 有

す

る試料中

の

ァ一アミノ_{酪酸を定量}

_す

_{る方法であ}

_っ

_て

_、

_ァ一アミノ_{酪酸 ア} ミノ_{基転移 酵 素と}

_N

_A

_D

p

_{要求 性脱水素酵 素}

_の

_{二酵 素系で}

_、

_ァ一アミノ_酪酸 アミノ_{基転移 酵 素に特}

_{異 的}

_な

_N

_A

_D

p

_H

_{を生成 し}

_たのち

_{酵 素を失活さ}

_せ

_る第

一

エ程 と

、

テ ト_{ラゾリウム塩を第}

_一

_{エ程で生成 し}

_{た N}

_A

_D

_P

_H

_{で還元 して水} 溶性ホル マザン色素を生成 し

、

水 溶性ホル マザン

の

色を測定

す

る第二エ程

か

らな る。

す

な

わち、

_B

A

及び

S

S A

D

H

で

N

A

D

P

か

ら

N

A

D

p

H

への

変換を行

_った

後

、

酵 素を失活さ

せ

る第

一

エ程 と

、

水 溶性ホル マザン色素 を生成さ

せ

る テ ト_{ラゾリウム塩}

_の

_{存在 下}

_{、 N}

_A

_D

p

_H

_か

_ら電

_子

_{伝達体を介 し} て生成

す

る水 溶性ホル マザンによ り_{生 じる色 (黄色) を測定}

_す

_{る第二エ程 と}

か

ら_{な る。}

[

００2 2

]

第

一

エ程に

おい

て

、

酵 素を失活

せず、

水 溶性ホル マザン色素を生成さ

せ

る テ ト_ラゾリ_ウム塩 と電

子

伝達体を添加

す

る と

、

酵 素反 応 非 特

異 的

な テ ト_ラゾ リウム塩

の

還元反 応が同時に進行 し

、 G

A

B

A

の

正確な測定ができな

い

。

[

００2 3

]

ま

た、

水不溶性

の

ホル マザン色素を生成さ

せ

る テ ト_ラゾリウム塩を用

いた

場 合には

、

還元さ

れ

て生成し

た

ホル マザン色素 が沈殿

す

る

ため、

正確な測定 が困難 とな る。

[

００2 4

]

酵 素

の

失活は

、た

とえば

、

反 応 溶 液を酸性に

す

ることにより_達成さ

_れ

る。 より具体

的

には塩 酸

や

硫 酸等

の

酸を添加 して

p

を

2

以下に

すれ

ばよ

い

。 以下に

、

幾

つかの

実施例を示して木発

明

をさ らに具体

的

に説

明す

る。

実

施

例

]

[

００2 5

]

本発

明の G

A

B

A

の

定量に及ぼ

す

アミ ノ_酸

_の

_影響を調

_べ

_た

_{例を以下に示}

_す

G

A

B

A

S

e

N

A D

P

を含有

す

る 以下

の

ような試薬 「

、

反 応停止液であ る試薬

2

及び「

e

M

S

w

S

T

を含有

す

る試薬

3

を調整 し

た

試薬 「 「

_０

0

T

r

_S緩衝液 (

p

H

₈

.

₉

) 「O

m

M

ひ一ケ ト_グルタ_ル酸

2 m

M

2

メ_ルカプ ト_エタノ

ー

_ル O .

₅

_m

_M

N

0

.

2

₅

U / m

_L

G

A

_B

A

_s

e

(

P

s

e

_{u d o m o}

n a

s

f

o

r

e

s

c

e

n

s

来) 試薬

2

「

M

硫 酸 試薬

3

「

e

M

S

w

S

T

混合試薬 (和光純 製 薬

C

u

n

n

_g

_K

— ₎ こ

れ

ら

の

試薬を使用し

、

以下

の手

順により

_G

_A

_B

_A

_{濃度を測定 し}

_た

_。

_す

_な

わち、

試料として

G

A 日A

の

濃度を

0

・ 「

p

p

、

0

・

5

ppm

、

「

p

p

m

5ppm

1

O

_{p p}

_m

₂

_０

_ppm

₅

_０p

_p

_{m ,}

₁

O

O

_{p p}

_{とな る よ} う_{調 製 し}

_た

_{水 溶液を用}

_い、

_試料 「

_００

L

」

に

9

_０

b t

」

の

試薬 「を加 え

、

そ

の

。 後こ

れ

を

3

０

C

にて「

5

分

間

加温 し

、つ

い

で

、

「 J

」

の

試薬

2

を混合 し

、

さ らに

」

の

試薬

3

を加 え

、

マイクロプレ

ー

トリ

ー

ダ (

e

a

社製

S

a

h

i

e

) にて波長

7

_０

に

お

ける吸光度をエンド法に基

づ

き測定 し

た

。ま

た、

試料にグルタ ミ _ン酸

_、

_セリン

_、

_{グリシ ン}

_、

ヒスチジ ンを 「

００

加 え

た

も

_の

も測定 し

た

。

図

2

に示

す

よう_に

_{、 G}

_A

_A

_は

_０

まで

の間

で相

関

係 数は ・

9

9 9

であり

、高

い

直線性を示し

、

定量

的

に 測定可能 で あ

った

。ま

た、

グルタミ _ン酸

_、

_セリン

_、

_{グリシ ン}

_、

ヒスチジ ン等 他

の

アミ ノ_酸

_の

_影響も受けな

い

ことが

明

ら

か

にな

_った

。

実

施

例

2

００ _食品中

_{の G}

_A

_A

_{を定量 し}

_た

_。 各種 精

白

米

・

玄米

・

発 芽玄米

の

水抽

出

物中

の G

A

A

含量を

、

D

a

b

誘導体 化

」

C

法によ

_っ

て測定 し比較 し

た

ところ

、図

3

の

よう_に

_、

9

9 9

の

非常に

高

い

相

関

が得ら

れた

。こ

の

こと

か

ら

H

」

C

法と同等

の

精 度で

の

比色分析による定量が可能 で あることが分

か った

。

実

施

例

3

００ _{発 芽}玄米中

の G

A

A

を定量 し

た

。 精

白

米

・

玄米を水に浸 漬 し

、

発 芽さ

せた

場 合に

お

ける

G

A

A

の

定量を行

った

。 タイ

国

産

の

各種玄米試料を水 浸 漬処理 し

、

処理

前

後

の G

A

A

含量を 実施例 「に示

す

方法により_測定 し

た

ところ

、

低 温乾 燥 米 と天

日

乾 燥 米では

G

A

A

含量

の

増加が確認さ

れた

。

一

方

、

タイ

国

に

お

い

て雨期に広 く_適用さ

_れ

て

い

る

高

温乾 燥処理さ

れた

コメでは

、 G

A

A

生成酵 素 が 失活 して

い

るが

、

図

の

よう_に

_G

_A

_A

_の

_増加は認

_め

_ら

_れず、

_本法

_の

_{信 頼性 が確認さ}

_れた

_。

実

施

例 4

００8 _チョ コ レ

ー

ト_中

_{の G}

_A

_A

_{を定量 し}

_た

_。 市販 チ ョ コ レ

ー

ト_中に含ま

_れ

_る

_G

_A

_A

_の

_{定量を本法及び}

_H

」

_C

_法で行

った

。

G

A

A

添加 チ ョ コ レ

ー

ト及び通常

の

チョ コ レ

ー

トを熱水抽

出

し

、 G

A

A

含量を実施例 「に示

す

方法によ り_{測定 し}

_た

_。

_G

_A

_A

_{添加 チ ョ コ レ}

_ー

ト_では

₂

_{8 9}

ｱ

8

の G

A

A

が定量さ

れ、

同

一

条件下 では

、

通常

の

チョ コ レ

ー

ト

か

らは

G

A

A

が検

出

さ

れ

な

_{か った}

。

H

」

C

法に

_おい

ては

G

A

A

添加 チ ョ コ レ

ー

トでは

2

9 6

_ｱ

、

通常

の

チョ コ レ

ー

ト_では検

_出

_さ

_れ

_な

_{か った}

_。こ

_れ

_ら

_の

_{結 果}

_か

_ら

_、

_A

_{添加 食品に}

_お

_ける

_G

A

A

含量

の

保証にも

、

本発

明の

方法 が有効であることが確認さ

れた

。

実

施例

００ _{清涼 飲料中}

_の

_A

_{を定量 し}

_た

_。 実施例 「と同様にして

、

市販 清涼 飲料水に含ま

れ

る

A

の

定量を行

_っ

た

。

A

を添加 し

た

清涼 飲料及びアミノ_{酸を添加 し}

_た

_{清涼 飲料に}

_お

_ける

A

含量を測定 し

た

ところ

、

A

添加 清涼 飲料では

9 8

2

9

の

A

が定量さ

れ、

同

一

条件では

、

A

の

含ま

れ

な

い

アミノ 酸 添加 清涼 飲料では

A

が検

出

さ

れ

な

か った

。こ

れ

ら

の

結 果

か

ら

、 G

A

A

添加 清涼 飲料に

お

ける

A

含量

の

保証に

、

本発

明の

方法 が有効であ ることが確認さ

れた

。 こ

れ

ら

の

結 果

か

ら

、

本発

明の

方法によ り_{広範な食品に}

_お

_ける

_A

_含量 を保証

す

ることが可能 で あることが確認さ

れた

。 ００3０ 比較例 水 溶性ホル マザン

W S

T

の

代

わ

り_{に非水 溶性ホル マザンであ}る

T

T

を使用し

た手

法

の

比較を行

った

。 各種 精

白

米

・

玄米

・

発 芽玄米

の

水抽

出

物では

、

T T

(

3

(

e

_h

l

_h

i

_a

l

l

)

d

i

_h

e

l

₂

H

e

a

i

b

e

を使用し

た

場 合には

、

低濃度 に

おい

ても反 応 生成 物 が沈殿 し

、

マイクロプレ

ー

ト_{表面に沈着 し}

_たため、

_分 析を行う_{ことは不 可能 で あ}

_った

_。こ

_れ

_は食品

_の

_水抽

_出

_物に含ま

_れ

_る蛋

_白

_質等 と ホル マザンが共 沈

す

ることによるも

の

と考えら

れ

る。さ らに，

G

A

A

含有 チ_ェコ レ

ー

ト_水抽

_出

_物中

_の

_A

_を分析 し

た

場 合

、

抽

出

物に含ま

れ

る有色物質による可視 部 吸収 が 分析 を妨

害

し

た

。

一

方

、

水 溶性ホル マザンを適用し

た

場 合では

、

溶解 性

の

問題が無 く

_、

_ホル マザン濃度を増加さ

せ

ることによ り

_、

_{問題を解決}

_す

_{ることができ}

_た

_。

[

００3

₁

]

ま

ず

基本

的

には

、 G

A

B

A

と構 造

の

類 似

す

るグルタ ミ _ン酸等

_の

_アミノ_酸を 排除

す

る

ため

に

、

特

異 的

な アミノ_{基転移 酵 素}

_、

_{及び補酵 素として酸 化 型二コ} チンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドホスフ ェ}

_ー

ト (以下

N

A

D

p

と

い

う_。) を要 求

す

る脱水素酵 素を用

い、

還元型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ} ドホス_{フ ェ}

ー

ト (以下

N

A D

P

と

_い

う_{。) を生成さ}

_せ

る第

一

エ程 と生成 し

た N

A D

P

にテ ト_{ラゾリウム塩}

_の

_{存在 下}

_、

_電

_子

_{伝達体を作用さ}

_せ、

_生成

_す

る水 溶性ホル マザン色素を測定

す

る第二エ程 と

か

らな ることを特 徴 と

す

る

G

A

B

A

を簡易に定量

す

る方法を提 供

す

る。

[

００32

]

詳 しく_は

_{、 G}

_A

_B

_A

_{と構 造}

_の

_{類 似}

_す

_るグルタ ミ _ン酸等

_の

_アミノ_酸を排除

_す

る

ため

に

、

特

異 的

な アミノ_{基転移 酵 素}

_、

_{及び補酵 素として酸 化 型二コチンア} ミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドホスフ ェ}

_ー

ト (以下

N

A

D

p

と

い

う_{。) を要 求}

す

る脱水素酵 素を用

い、

還元型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドホス} フ ェ

ー

ト (以下 と

い

う_{。) を生成さ}

_せた

_後

_、

_{硫 酸を添加}

_す

_る第

_一

エ程 と生成 し

た

にテ ト_{ラゾリウム塩}

_の

_{存在 下}

_、

_電

_子

_{伝達体を作用} さ

せ、

生成

す

る水 溶性ホル マザン色素を測定

す

る第二エ程 と

か

らな ることを 特 徴 と

す

る

G

A

B

A

を簡易に定量

す

る方法である。

[

００33

]

さ らに詳 しく_は

_、

飲 食品中

の

ァ一アミノ_{酪酸を定量}

_す

_{る方法であ}

_っ

_て

_、

( 「) 食品

の

水抽

出

液又 は飲料と

、

ァ一アミノ_{酪酸 ア}ミノ_{基転移 酵 素と}

_、

酸 化 型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドを補酵 素として要 求}

_す

_る脱水 素酵 素とを反 応さ

せ

て還元型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドフ}

_ォ

_ス フェ

ー

ト_を生成さ

_せた

_後

_、

_{硫 酸を添加}

_す

_{るエ程 と}

_、

(

₂

) 7

K

溶性ホル マザン色素を生成さ

せ

る テ ト_{ラゾリウム塩}

_の

_{存在 下}

_、

_還 元型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドフ}

_ォ

_{スフ ェ}

_ー

トと電

子

伝達体 と を反 応さ

せ

て水 溶性ホル マザン色素を生成さ

せ

るエ程 と

、

(

₃

) 7

K

溶性ホル マザンを測定

す

るエ程 と

、

を含

む

ことを特 徴 と

す

る

、

飲 食品中

の

ァ一アミノ_酪酸

_の

_{定量方法である。こ こで}

_、

_テ ト_{ラゾリウム塩は}

₂

2

メ ト_キシー

₄

_ニ トロ_{フ ェニル )}

₃

(

₄

_ニ トロ_{フ ェニル )}

₂

テ ト_{ラゾリウムナ} ト リウム塩である。

な

お、

本発

明の

ァ一アミノ_{酪酸を定量}

_す

_る方法は

_、

_{実施例に示さ}

_れた

_{飲 食}

物中

の

ァ一アミノ_酪酸

_の

_定量に

_限

_{定 さ}

_れ

_るも

_の

ではなく

_{、 G}

_A

_A

_{と構 造}

_の

類 似

す

るグルタ ミ _ン酸等

_の

_アミノ_酸を含

_む

_測定試料

_、

_{例えば生体検体試料に}

請

求

の

範

囲

[

請求項

1

]

アミノ_酸を含

_む

_試料中

_の

_ァ一アミノ_{酪酸を定量}

_す

_{る方法であ}

_っ

_て

_、

( 「) 試料と

、

ァ一アミノ_{酪酸 ア}ミノ_{基転移 酵 素と}

_、

_{酸 化 型二コチ} ンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドを補酵 素として要 求}

_す

_{る脱水素酵 素} とを反 応さ

せ

て還元型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドフ}

_ォ

_ス フェ

ー

ト_を生成さ

_せた

_後

_、

_{酵 素を失活さ}

_せ

_{るエ程 と}

_、

(

₂

) 7

K

溶性ホル マザン色素を生成さ

せ

る テ ト_ラゾリウム塩

の

存在 下

、

還元型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドフ}

_ォ

_{スフ ェ}

_ー

_トと 電

子

伝達体 とを反 応さ

_せ

て水 溶性ホル マザン色素を生成さ

せ

るエ程 と (

₃

) _生成し

た

水 溶性ホル マザン色素を測定

す

るエ程 と

、

を含

む

こ とを特 徴 と

す

る

、

ァ一アミ ノ_酪酸

_の

_{定量方法。}

[

請求項 2

]

前

記 テ トラゾリウム塩が

₂

₂

メ トキシー

₄

ニ トロ_{フ ェ}ニル )

3

(

₄

ニ トロ_{フ ェ}ニ_{ル )}

₂

H

テ トラゾリウムナ トリウム 塩である

、

請求

の

範

囲

「記載

の

ァ一アミ ノ_酪酸

_の

_{定量方法。}

[

請求項 3

]

前

記 酸 化 型二コチンアミ _{ドアデニ ン ジヌクレオチ ドを補酵 素として} 要求

す

る脱水素酵 素 がコ_ハク酸 セミ_{アル デ}ヒ ド脱水素酵 素 である

、

請 求

の

範

囲

2

載

の

ァ一アミ ノ_酪酸

_の

_{定量方法。}

[

請求項 4

]

前

記電

子

伝達体が

、

フェナ ジ ンメン ト_{硫 酸 塩}

_、

「一メ トキシ_{フ ェ}ナ ジ ンメン ト_{硫 酸 塩 及び フ ェナ ジ ン エ} ト_{硫 酸 塩}

_か

_ら選ば

_れ

_るも

の

である

、

請求

の

範

囲

3

載

の

ァ一アミ ノ_酪酸

_の

_{定量方法。}

[

_請求項 5

]

前

記 水 溶性ホル マザン

の

測定が

、

波長

4

7

_０

n m

の

吸光度

の

測定で ある

、

請求

の

範

囲

「記載

の

ァ一アミ ノ_酪酸

_の

_{定量方法。}

[

_請求項6

前

記酵 素

の

失活が硫 酸 添 加である

、

請求

の

範

囲

「記載

の

ァ

_一

アミ ノ 酪酸

の

定量方法。

[

_請求項7

前

記試料 が

、

グルタミ _ン酸

_、

_セ リ_ン

_、

_グリシ ン又 はヒスチジ ンを含

む、

請求項

Ⅰ

～

6

の

いずれか

に記載

の

ァ

_一

アミ ノ_酪酸

_の

_定量方法

[

_請求項

前

記試料 が飲 食物である

、

請求項

7

の

いずれか

に記載

の

ァ

_一

アミ ノ

INTERNATIONAL SEARCH REPORT International application No. PCT/JP2009/057537

A . CLASSIFICATIONOFSUBJECT MATTER

C12Ql/48

(2006

. 01) i

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Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols) C12 Q 1 / 4 8

Documentationsearched otherthanminimum documentation totheextentthatsuchdocumentsareincludedin the fields searched

Jitsuyo Shinan Koho 1922-1996 Jitsuyo Shinan Toroku Koho 1996-2009 Kokai Jitsuyo Shinan Koho 1971-2009 Toroku Jitsuyo Shinan Koho 1994-2009

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biosensors for the determination o f γ -aminobutyric acid. Anal Chim Acta., 1996,

Vol.328, p .41-46

J P 2005-304483 A (Asahi Kasei Pharma Corp.), 1 - 8

04 November, 2005 (04.11.05), (Family: none)

J P 2002-355095 A (Toyobo Co., Ltd.), 1 - 8

1 0 December, 2002 (10.12.02),

U S 2002/0119507 A l E P 1213358 A 2

J P 58-129994 A (Toyo Jozo Co., Ltd.), 1 - 8

0 3 August, 1983 (03.08.83),

U S 4556634 A DE 3302743 A l

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INTERNATIONALSEARCH REPORT International application No. PCT/JP2009/057537 C (Continuation). DOCUMENTS CONSIDERED TO BERELEVANT

Category Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages Relevant to claim No. unetaka ISHIYAMA, "NADH-Formazan-kei Suiyosei 1 - !

Formazan", Clinical testing, 1997, Vol.41, No.9 , pages 995 to 1000

SARKER AK., e t a l., Enzymatic assay o f 1 - !

dehydrogenase substrate based on the detection o f superoxide anion. Food Res Int, 2001,

Vol. 34, p .393-399

DUNIGAN DD. e t a l., Aqueous soluble 1 - 8

tetrazolium/f ormazan MTS a s an indicator o f NADH- and NADPH -dependent dehydrogenase

activity. BioTechniques, 1995, Vol. 19, N o .4 ,

p .640-649

国際調査 報告 国際出願 番 号 ノ ノ A_・ 発明 の属する_{分 野 の分類 (国際特許分類 ( I} P C ) ) IntCl C12Ql/48(2006. 01) i B_・ 調査を行 た分 野 調査を行 た最小 限資料 (国際特許分類 ( I P C ) ) IntCl C12Ql/48 最小 限資料以外の資料て調査を行 た分 野 に含 まれるもの 日本国実用新案公報 1 9 2 2 1 9 9 6午 日本国公 開実用新案公報 1 9 7 1 2 0 0 9午 日本国実用新案登録公報 1 9 9 6 - 2 0 0 9午 日本国登録実用新案公報 1 9 9 4 - 2 0 0 9午 国際調査て使用した電子テ タ ス テ タ スの名称、調査に使用した用譜

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C _・ 関連する _{認 め}られる_文献

引用文献の 関連する

カテ ホ 引用文献名 及ひ 部の箇所か関連する きは、そ の関連する箇所の表示 請 求項の番号

MAZZEI F.et al.,

-Peroxidase based amperometric biosensors forthe determination of aminob tyric acid.

Anal Chim Acta., 1996, Vol.328, p.41-46

JP 2005-304483 A 旭 化成 ア - 株式会社) 2005_・11_・4 -( ア なし) 洋 C欄 の続 きにも文献か J挙さ_れて る_{。 ヴ} ト ァ に関する_{別紙 を}参 。 ホ 引用文献の力テ の日の役に公表さ_れた文献 A 特に関連のある文献てはな<、 般的技術水 準を示す ΓT 国際出願日又 は優先日後に公表さ_{れた文献てあ て} もの 出願 矛盾するものてはな 、発明 の原理又 は理 論 ΓE 国際出願日前 の出願または特許 て あるか、国際出願日 の理解 のため に引用するもの 以 後に公表さ_れたもの ΓX 特に関連のある文献てあ て、当該文献のみて発明 L 優先権主張に疑義を提 起する文献又 は他の文献の発行 の新規性 又 は進歩性 かな 考えられるもの 日若し は他の特別な理 由を確立するた めに引用す ΓY 特に関連のある文献てあ て、当該文献 他の 1以 る文献 理 由を付す) 上の文献 の、当業者に て自明 てある組合 に O 口頭による_{開示、使用、展示等 に言及す}る文献 よ て進歩性 かな 考えられるもの p j 国際出願日前 て、か 優先権の主張の基礎 なる_出願 r&j 同 テ ト ア ; 文献 国際調査を完_了した日 国際調査 報告 の発 送日 0 7 . 0 7 . 2 0 0 9 2 1 . 0 7 . 2 0 0 9 国際調査機 関の名称及ひあて先 特許庁審 査官 権限のある職員 4 B 3 7 6 4 日本国特許庁 ( I S AノJ P ) 横田 倫子 郵便番号 1 0 0 - 8 9 1 5 東京 都千代田区霞か関三丁目4番 号 電話番 号 0 3 - 3 5 8 1 - 1 1 0 1 内線 3 4 4 様式P C T ノI S Aノ2 1 0 (第2 ) ( 2 0 0 7午4 月)

国際洞査報告 国際出悼番 号 C (続 き _・ 関連すると沼められる文献 引用文献の 関連する カテ ホ 引用文献名 及ひ 部の箇所か関連するときは、そ の関連する箇所の表示 請大項の番号 Y _{J P 2002-355095 A (}東 伴 紡績株式会社) 2002.12_・10 l -& US 2002/0119507 Al -& EP 1213358A2 J P 58-129994 A (東伴醸造株式会社) 1983 8 3 Y ・ ・ l -& US 4556634 A -& DE 3302743 Al Y 石山宗孝， l -NADH- ホ ザ 系 水溶吐ホ ザ 臨床 検 査,1997, Vol.41,No.9，p.995-1000

SARKE AK., et al.,

Y 1

-Enzymatic assay of dehydrogenase substrate based on the detection of superoxide anion.

Food Res Int, 2001,Vol. 34,p.393 399

DUNIGANDD. et al., 1-8

Aqueous soluble tetrazolium/formazan MTSas an indicator ofNADH-and NADPH-dependent dehydrogenase activity.

BioTechniques, 1995, Vol.19, No.4，p.640 649