553 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.47No.5(2002)
Review
筋肉収縮 ・弛緩における分子スイ ッチ機構
アイデアと方法論開発
若林健之
筋 収 縮 は細 胞 内Ca2+濃
度 で 制 御 さ れ る.骨 格 筋 ・心 筋 で はCa2+シ
グ ナル は トロ ポ ニ ン→ 卜ロ
ポ ミ オ シ ン → ア クチ ンと 伝達 され る.今 回,ク ラ イ オ 電 子 顕 微 鏡 像 を単 粒 子 解 析 し,“ 細 い フ ィ
ラ メ ン ト”の 全 構 造 を35Å 分解 能 で立 体 構 造 を解 い た.低Ca2+濃
度 で は トロ ポ ニ ン の 頭 部 は分
岐 し トロポ ニ ン ・
ア ー ム が ア ク チ ン と 結 合 す る.そ の 結 果 と して,高Ca2+濃
度 で は ア ク チ ン の
内側 ドメ イ ン に結 合 して い た トロポ ミ オ シ ンの うちC末
端 側 の 約130OÅ の 長 さの 部 分 が 移 動 す
る様 子 を3次 元 的 に 可視 化 で きた.ミ オ シ ンの 構 造 変 化,変 異 ア ク チ ン の 結 晶 構 造 も あわ せ,収
縮 ・
弛 緩 の 新 しい 分子 メ力 ニ ズ ム を提 唱 した.
筋収縮
カルシ ウムシグナ リング
トロポニ ン 単粒子 解析
ア クチ ン変 異体
X線 結晶解析
は じめ に
骨 格 筋 と心 筋 で は,細 胞 内Ca2+濃 度 が1μMを こ え る と カ ル シ ウ ム は “細 い フ ィ ラ メ ン ト”に 結 合 し,そ の 主 要 構 成 蛋 白 質 で あ る ア ク チ ン と “太 い フ ィ ラ メ ン ト”を 構 成 す る ミ オ シ ン と の 相 互 作 用 が 活 性 化 さ れ る1).そ の 結 果,2種 類 の フ ィ ラ メ ン トは 滑 り あ っ て 筋 収 縮 が 生 じ る2,3).そ こ で ア ク チ ン ・ ミ オ シ ン の 結 合 様 式 の 決 定 は, 筋 収 縮 の 基 本 反 応 を 分 子 レベ ル で 明 ら か に す る た め に 必 須 で あ る.ま た カ ル シ ウ ム の 標 的 は “細 い フ ィ ラ メ ン ト” に 組 み 込 ま れ た ト ロ ポ ニ ン で あ り,カ ル シ ウ ム に よ る “細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 構 造 変 化 は 収 縮 制 御 メ カ ニ ズ ム を 分 子 レ ベ ル で 解 明 す る た め の 鍵 を 与 え る.Klugら が 開 発 し た 電 子 顕 微 鏡 像 か ら の3次 元 像 再 構 成 法4,5)に よ り,“ 細 い フ ィ ラ メ ン ト”(ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン ト)の 立 体 構 造 の 研 究6∼9)が 可 能 と な っ た. “細 い フ ィ ラ メ ン ト”は お も に ア ク チ ン ,ト ロ ポ ミ オ シ ン,ト ロ ポ ニ ン で 構 成 さ れ,そ の 分 子 比 は7:1:1で あ る10).カ ル シ ウ ム の 標 的 蛋 白 質 は ト ロ ポ ニ ン で あ る が,制 御 に は ト ロ ポ ミ オ シ ン も必 須 で あ る.そ の 理 由 と し て,ト ロ ポ ミ オ シ ン は 棒 状 分 子 で あ り 分 子 長(約400 Å)が7分 子 の ア ク チ ン の 長 さ(55Å ×7＝385Å)と ほ ぼ 等 し い こ と が あ げ ら れ て き た.そ こ で カ ル シ ウ ム ・シ グ ナ ル は ト ロ ポ ニ ン→ トロ ポ ミ オ シ ン → ア ク チ ン と 伝 搬 す る と 想 定 さ れ て き た.し か し,そ の ス イ ッ チ ン グ の 構 造 的 詳 細 は こ れ ま で 不 明 で あ っ た. カ ル モ ジ ュ リ ン は トロ ポ ニ ンの カ ル シ ウ ム 結 合 サ ブ ユ ニ ッ トで あ る ト ロ ポ ニ ンCと 相 同 で あ り,そ の シ グ ナ ル 伝 達 と も 共 通 の 分 子 機 構 が 予 期 さ れ る. こ れ ま で “細 い フ ィ ラ メ ン ト”の3次 元 像 を 再 構 成 す る 際,ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン トが 二 重 らせ ん11)で あ る こ と に 着 目 し,そ の らせ ん 対 称 性 が 利 用 さ れ て き た.ト ロ ポ ミ オ シ ン は 分 子 内 に7回 の 擬 似 的 く り返 し モ チ ー フ が あ る.こ の モ チ ー フ は ア ク チ ン と1:1に 対 応 す る の で, ア ク チ ン の ら せ ん 対 称 性 を 仮 定 し て も ア ク チ ン と トロ ポ ミ オ シ ン の 立 体 構 造 が 再 構 成 で き る と 考 え ら れ て き た. し か し,ト ロ ポ ニ ン に は こ の よ う な 分 子 内 の く り返 し モ チ ー フ は な い の で,制 御 機 構 の 主 役 で あ る ト ロ ポ ニ ン の 所 在 は わ か ら な か っ た. 最 近,筆 者 ら は らせ ん 対 称 性 に 依 存 し な い 新 し い 画 像 解 析 法 を 導 入 し,ト ロ ポ ニ ン を 含 む “細 い フ ィ ラ メ ン ト”Takeyuki Wakabayashi,帝 京 大 学 理 工学 部 バ イ オ サ イ エ ン ス 学 科 E-mail : wakabayashi@nasu.bio.teikyo-u.ac.jp, wakabayashi @spn l.speednet.ne.j p
Structural basis for the molecular switching in regulatory mechanism of muscle contraction
554 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.47No.5(2002)
全 体 の 立 体 構 造 を初 め て解 い た12).そ の結 果,ト
ロ ポ ニ
ンが カ ル シ ウ ム に よ って ス イ ッチ ング す る様 子 を立 体 的
に可 視 化 で きた.ト
ロポ ミオ シ ンが 予 想 外 の構 造 変 化 を
して お り,さ らに ア クチ ン自 身 が ス イ ッチ 機 構 の 重 要 な
一部 で あ る こ と が 判 明 した
.
ア ク チ ンの 突 然 変異 体 の 研 究 も,ア ク チ ン の ス イ ッチ
機 構 へ の 関 与 を 支 持 し て い る13∼16).筆者 ら は カ ル シ ウ
ム に よ る 活性 化 が 野 生 型 の 約10倍
に な る 変 異 体 をX線
結 晶 解 析 し,ア クチ ンの 第4サ
ブ ドメ イ ンの 疎 水 ポ ケ ッ
トに 注 目 して い る15).こ の 疎 水 ポ ケ ッ トは ア ク チ ンの ト
ロ ポ ミオ シ ン結 合 部 位 に近 い.こ
れ まで,低
カ ル シ ウ ム
濃 度 で の 制 御 蛋 白質 に よ る抑 制 が,カ
ル シ ウム に よ っ て
外 れ る こ と(脱 抑 制)が 活 性 化 を も た らす と考 え られ て き
たが,変
異 体 で は 脱抑 制 に留 ま らず ア クチ ンだ けの 場 合
よ り強 い 活 性 化 が起 こ る.制 御 蛋 白質 は ア ク チ ン ・ミオ
シ ンの相 互 作 用 に積 極 的 に 関与 す る よ うで あ る.
本 稿 で は,ミ
オ シ ン との 関 係 も含 め た研 究 の歴 史 を た
ど り,“ 細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 全 構 造 決 定 に よ っ て 明 ら
か に な っ た トロポ ニ ンの動 き と ア クチ ン変 異 体 の 原 子 構
造 に 基 づ い た 収 縮 制 御 モ デ ル につ い て も触 れ た い.
Ⅰ.“
細 いフィラメン ト”のモデルとステ リック・
ブロック説
1.“ 細 い フィラ メン ト”
の モデ リング
図1(a)は ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン トの 二 重 ら せ ん モ デ ル で あ り,電 子 顕 微 鏡 観 察 に 基 づ い て 提 唱 さ れ11),筋 肉 の X線 回 折 パ タ ー ン を よ く説 明 で き る.図1(b)は 二 重 ら せ ん を 巻 き戻 し た もの で あ る.フ ィ ラ メ ン トの 軸 方 向 の ア ク チ ン 分 子 の 長 さ は 約55Aで あ る.片 方 の ス ト ラ ン ド を た ど る と13個 の ア ク チ ン で 右 巻 き に1ピ ッ チ 進 む.も う1本 の ス ト ラ ン ドは 分 子 半 個 分 ず れ て い る.矢 印 で 示 し た よ う に2本 の ス ト ラ ン ド は ア ク チ ン 分 子6.5 個 ご と に ク ロ ス オ ー バ ー す る.ク ロ ス オ ー バ ー 間 の 距 離 は55A×6.5＝ 約360Aで あ り,ハ ー フ ピ ッ チ と も よ ば れ る.図1(a)の 下 の パ ネ ル に は,5gAの 短 い ピ ッ チ の らせ ん が 点 線 で 描 い て あ り,こ れ と 区 別 す る た め 約360 Aの ピ ッ チ の ら せ ん は 長 い ピ ッ チ の ら せ ん と よ ぶ.(a) と(b)を 比 較 す る と 矢 印Aと 矢 印Bの 問 で 二 重 ら せ ん は180。 回 転 す る こ と が わ か る.そ こ で1つ の ス ト ラ ン ド に 沿 っ て 隣 接 す る ア ク チ ン は180。 ÷6.5≒27.7° ず つ 長 軸 回 り に 回 転 す る.こ の よ う な 軸 方 向 に 進 む 距 離(約55 ア ク チ ン 単 量 体(分 子 量42K)が 重 合 しフ ィ ラ メ ン ト(二重 らせ ん, 図1a)と な る と,ミ オ シ ン と結 合 しそ のATPaseを 約100 倍 に 活 性 化 す る,RNaseHフ ォー ル ドを も つ2つ の 相 同 ドメ イ ン か らな り(図7a),HSP70と 共 通 のATP結 合 モ チ ー フ を も つ,す べ て の 真 核 細 胞 に あ り,細 菌 の 分 裂 関与 蛋 白 質FtsZと も 相 同 で あ る,ゲ ル ゾ リン,プ ロ フ ィ リ ン, DNaseⅠ な ど 多 数 の 蛋 白質 が 結 合 す る, 卜ロ ポ ミ オ シ ン 単 量 体(分 子 量33K×2)は 重 合 して 〔コー プ 状 と な り,ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン トに結 合 す る(図7b),ほ ぼ 全 長(約400A) が αヘ リ ッ ク ス で あ り,2本 が巻 き つ き あ っ て 超 ヘ リ ッ ク ス(コ イル ドコ イル:ミ オ シ ン尾 部 と 同 じ超2次 構 造)と な る.脳 型 ア イ ソ マ ー は 短 い.ト ロ ポ ニ ン と1:1に 結 合 す る. 卜ロ ポ ニ ン ヘ テ ロ3量 体(TnT30∼35K;Tnl21∼23K;TnC18K)で あ り(図7b),江 橋 ら1)が収 縮 へ の カ ル シ ウ ム感 受 性 付 与 因 子 と して 単 離 した.TnTを 介 して トロ ポ ミ オ シ ン と 結 合 し,そ の ア クチ ン結 合 能 を 約 千 倍 強 く す る,Tnlは 収 縮 を 阻 害 し,TnCにCa2+が 結 合 す る と 阻 害 能 は 抑 制 さ れ る, TnCは ミ オ シ ン 軽鎖 や カ ル モ ジ ュ リ ン と相 同 で あ る. 図1“ 細 い フ ィ ラ メ ン ト”構 造 の 模 式 図 (a)ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン トの 二 重 ら せ ん モ デ ル11),(b)二 重 ら ぜ ん を 巻 き 戻 し た 模 式 図,(c)“ 細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 模 式 図(初 版)17),(d)“ 細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 模 式 図(三 訂 版)22).矢 印 は ク ロ ス オ ー バ ー を 示 す.555 蛋 白質 核 酸 酵 素Vol.47No.5(2002) AÅ)と 軸 周 りの 回 転 角(約27.7°)の 関 係 を ら せ ん 対 称 性 と よ ぶ. 細 い フ ィ ラ メ ン ト”で は,ト ロ ポ ミ オ シ ン や ト ロ ポ ニ ン は ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン トの ど こ に 結 合 し て い る の で あ ろ う か.1969年 に 筆 者 ら が 描 い た モ デ ル が 図1(c) で あ る17).ト ロ ポ ミ オ シ ン は 長 さ400Å の 棒 状 分 子 で, 分 子 の 長 軸 方 向 にhead-to-tail結 合 し て ロ ー プ を 形 成 す る こ と に 着 目 し,そ れ を ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン トの2本 の ス ト ラ ン ドの 間 の 溝 に 巻 き つ け た.ト ロ ポ ニ ン は ト ロ ポ ミ オ シ ン の 特 定 の 個 所 に の み 結 合 す る の で18),結 合 分 子 比 を1:1と 想 定 し た.ト ロ ポ ニ ン を こ の よ う に 配 置 す る と “細 い フ ィ ラ メ ン ト” 上 で 抗 ト ロ ポ ニ ン 抗 体 が 約400Å の 周 期 で 結 合 す る こ と19)も 説 明 で き た.そ の 後,こ の モ デ ル は2本 の ア ク チ ン ・ス ト ラ ン ドの ア ク チ ン 分 子 半 個 分(約27.5Å)の ず れ に 応 じ て ト ロ ポ ニ ン の 位 置 も 同 じ 距 離 ず れ る と の 推 測 に 基 づ き 改 訂 さ れ20),抗 ト ロ ポ ニ ン抗 体 が ト ロ ポ ミ オ シ ン 分 子 の 端 か ら約270Å の 部 位(逆 の 端 か ら は 約130Å)に 結 合 す る こ と か ら211, ト ロ ポ ミ オ シ ン 分 子 の 間 の 継 ぎ 目 と トロ ポ ニ ン の 関 係 が わ か る よ う 再 改 訂 さ れ た22)(図ld).カ ニ の 筋 肉 のX線 回 折 パ タ ー ン は トロ ポ ニ ン の ず れ を 支 持 す る23). 細 い フ ィ ラ メ ン ト”の モ デ ル は2つ の 方 向 で 研 究 の 流 れ を 刺 激 し た.第1は,モ デ ル を 直 接 的 に 実 証 し よ う と す る 方 向 で あ り,第2は こ の モ デ ル に 基 づ い て 筋 肉 の X線 散 乱 パ タ ー ン を 解 釈 し よ う と す る 方 向 で あ る.後 者 の 方 向 か ら は ス テ リ ッ ク ・ブ ロ ッ ク 説 が 現 わ れ た.
2.ス テ リック ・ブ ロ ック仮 説
筋 肉 のX線 回 折 パ タ ー ン の う ち で,“ 細 い フ ィ ラ メ ン ト” に 由 来 す る も の は ア ク チ ン 反 射 と よ び,1/5gÅ-1 の “場 所 ” と1/380Å-1の “場 所 ” に 強 く現 わ れ る.“ 細 い フ ィ ラ メ ン ト”で は ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン トの 巻 き 方 が よ り緩 や か で,ピ ッ チ が360Å で は な く380Å と な り, 1ピ ッ チ の らせ ん に は14個 の 単 量 体 が 含 ま れ る. 図2に は “細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 電 子 顕 微 鏡 像(白 い 部 分 が 蛋 白 質)と そ の 回 折 パ タ ー ン を 示 し た.1/380Å-1 の “場 所 ”に 現 わ れ る 第 一 層 線 は 長 い ピ ッ チ の ら せ ん か ら 反 射 し て く る 基 本 波 に よ る も の で,1/58.8Å-1に 現 わ れ る の は 短 い ピ ッ チ の ら せ ん か ら の 反 射 で あ る.1/27.3 AÅ-1に 現 わ れ る の は2本 の 長 い ピ ッ チ の ら せ ん の 間 の ず れ に 対 応 して お り,子 午 線 反 射 と よ ば れ る. 弛 緩 し て い た 筋 肉 が 収 縮 す る と,“ 細 い フ ィ ラ メ ン ト” か ら のX線 回 折 パ タ ー ン が 変 化 す る.1/380Å-1の 第 一 層 線 を 基 本 波 と し て,1/190Å-1,1/127Å-1に は2倍 波 (380Å/2＝190Å:第2層 線)と3倍 波(380Å/3＝ 約127 Å :第3層 線)に 対 応 す る 反 射 が 観 察 で き る.収 縮 す る と 第2層 線 が 強 く な り,第3層 線 は 弱 く な る24∼26).電 子 顕 微 鏡 像 か らの 回 折 パ タ ー ン も 同 様 に 変 化 す る(図2a は 弛 緩,bは 収 縮).こ の 観 察 と 図1c,dの モ デ ル を 結 び つ け る と,収 縮 の 際 に は ト ロ ポ ミ オ シ ン が ア ク チ ン の 溝 の 中 央 に あ り,弛 緩 時 は そ こ か ら 移 動 す る と 推 測 で き る.Huxley25),Haselgrove26),ParryとSquire27)は モ デ ル 計 算 し,ト ロ ポ ミ オ シ ン が ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン ト の 上 を 長 軸 に 垂 直 方 向(方 位 角 方 向)に シ フ トす る と 仮 定 す れ ばX線 観 察 を 説 明 で き る こ と を 示 し た. ア ク チ ン と ミ オ シ ン の 結 合 部 位 を 電 子 顕 微 鏡 像 か ら の 3次 元 再 構 成 法 に よ っ て 示 し たMooreら28)の 結 果 に よ 図2“ 細 い フ ィ ラ メ ン 卜”の ク ラ イ オ 電 子 顕 微 鏡 像 と そ の 回 折 パ タ ー ン12) (a)低Ca2+濃 度,(b)高Ca2+濃 度.左 は “細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 無 染 色 凍 結 水 和 標 本 の ク ラ イ オ 電 子 顕 微 鏡 像(長 さ770Å,白 が 蛋 白 質),下 が ＋端(barbedend).右 は3次 元 像 か ら プ ー リ工 変 換 して 求 め た 回折 パ ター ン.556 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.47NO.5(2002) れ ば,ア ク チ ン 上 で の ミ オ シ ン結 合 部 位 は 溝 か ら 離 れ て い る の で,ト ロ ポ ミ オ シ ンが 溝 の 中 央 に あ れ ば ア ク チ ン と ミ オ シ ン の 結 合 は 邪 魔 さ れ な い.も し溝 の 中 央 か ら 移 動 す れ ば,ア ク チ ン と ミ オ シ ン の 結 合 が 立 体 障 害 を 受 け る よ う に な る 可 能 性 が あ る.こ う し て,弛 緩 は ト ロ ポ ミ オ シ ン の シ フ トに よ り ア ク チ ン-ミ オ シ ン の 結 合 が 阻 害 さ れ る と 考 え る ス テ リ ッ ク ・ブ ロ ッ ク 仮 説 が 誕 生 し た25∼27). こ の 説 は 大 き な 仮 定 が 証 明 さ れ な い ま ま 見 切 り発 車 的 に 提 唱 さ れ た が,単 純 明 快 な の で1970年 代 を 支 配 す る こ と に な っ た.す な わ ち,弛 緩 時 の ト ロ ポ ミ オ シ ン が 本 当 に ミ オ シ ン結 合 を ブ ロ ッ ク す る 位 置 に シ フ トす る の か ど う か,ま た ト ロ ポ ミ オ シ ン が 収 縮 時 に ア ク チ ン の 溝 に あ る の か ど う か に つ い て も 定 か で は な か っ た29).
3.ト ロポ ミオ シンの所 在を 求め て
ア ク チ ン,ト ロ ポ ミ オ シ ン,ト ロ ポ ニ ン か ら な る “細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 立 体 構 造 を 解 い て,ト ロ ポ ミ オ シ ン と トロ ポ ニ ン か ら な る 制 御 蛋 白 質 と ア ク チ ン の 関 係 を 確 か め よ う と す る 研 究 は ケ ン ブ リ ッ ジ で 始 め ら れ た28,30). トロ ポ ミ オ シ ン と し て 期 待 さ れ る よ う な 棒 状 の 分 子 は 見 え ず,そ の 一 部 か も し れ な い"塊"が 見 え た が,説 得 力 が 強 い と は い え な か っ た.A.収
縮 時 の トロ ポ ミ オ シ ン の 所 在
個 別 の 電 子 顕 微 鏡 像 か ら 得 た ア ク チ ン と ト ロ ポ ミ オ シ ン の 複 合 体 の3次 元 像 を 互 い に 比 較 し,仲 間 と 似 て い る も の を 選 び 出 し て 観 察 し た と こ ろ,ト ロ ポ ミ オ シ ン ら し い “塊 ”の 位 置 が 像 ご と に フ ィ ラ メ ン トの 軸 方 向 に 変 動 し て い た.こ れ ら を 平 均 す る と “塊 ”は 互 い に つ な が り ロ ー プ の よ う に 見 え る よ う に な っ た31)(図3a).図3(b) は そ の 模 式 図 で あ り,赤/榿 と 赤 紫 は ア ク チ ン,青 と 濃 緑 は ト ロ ポ ミ オ シ ン と 解 釈 し た 部 分 で あ る.ア ク チ ンー ト ロ ポ ミ オ シ ン 複 合 体 は ミ オ シ ン のATPaseを 活 性 化 で き る の で,収 縮 時 の ト ロ ポ ミ オ シ ン の 所 在 が 求 め ら れ た こ と に な る.興 味 深 い こ と に,こ れ ま で 縦 に 長 い 提 灯 の よ う に 見 え た28,30)ア ク チ ン が 横 長 に 見 え る だ け で な く,下 の 方 向(筋 肉 の サ ル コ メ ア のz帯 の 方 向)に 尖 っ て 見 え る な ど,構 造 の 異 方 性 が 明 白 に な っ た31).12個 の3 次 元 像 の 平 均 を と っ た に す ぎ な か っ た が,こ の 方 法32)は 効 果 的 で あ っ た.Hendersonら は500万 個 の バ ク テ リ オ ロ ドプ シ ン 分 子 の 電 子 顕 微 鏡 像 を 平 均 化 し て,原 子 構 造 を 解 く こ と に 成 功 し た33).B.弛
緩 時 の トロ ポ ミオ シ ンの 所 在
弛 緩 時 の トロ ポ ミ オ シ ン の 所 在 の 決 定 は,ア ク チ ン-ト ロ ポ ミ オ シ ン-ン-ト ロ ポ ニ ン の 複 合 体 の 電 子 顕 微 鏡 像 を 0.1μMよ り低 い カ ル シ ウ ム 濃 度 条 件 下 で 撮 影 し 解 析 す れ ば よ い.し か し,1970年 代 に は 次 の よ う な 技 術 的 問 題 が あ っ た.蛋 白 質 を 観 察 す る に は 酢 酸 ウ ラ ニ ル に よ る ネ ガ テ ィ ブ 染 色 が 用 い ら れ て い た が,ウ ラ ニ ル イ オ ン は EGTA(カ ル シ ウ ム キ レ ー ト剤)にCa2+よ り 強 く結 合 し て し ま う.せ っ か くEGTAで 低Ca2+濃 度 に して も,酢 酸 ウ ラ ニ ル を 加 え る とEGTAは ウ ラ ニ ル イ オ ン を 結 合 しCa2+を 放 出 し て し ま う で あ ろ う, こ れ を 克 服 す る ア イ デ ア は 生 化 学 か ら き た.ト ロ ポ ニ ン は ヘ テ ロ3量 体 で あ り34,35),ア ク チ ン ・ミ オ シ ン の 相 互 作 用 を 阻 害 す る ト ロ ポ ニ ン1(分 子 量21∼23K)36), Ca2+を 結 合 す る トロ ポ ニ ンC(18K)37),ト ロ ポ ミ オ シ ン と 結 合 す る ト ロ ポ ニ ンT(30∼35K)34,38)か ら な る(分 子 重 量 に 幅 が あ る の は ア イ ソ マ ー の 存 在 に よ る).ト ロ ポ ニ ン か ら トロ ポ ニ ンCを 除 い て,残 っ た ト ロ ポ ニ ン(T 図3ア ク チ ン-ト ロ ポ ミ オ シ ン(活 性 状 態)と ア ク チ ト ロ ポ ミ オ シ ン-トロ ポ ニ ン(T＋1)(阻 害 状 態)の3次 元 像31) 活 性 状 態 の3次 元 像(a)と そ の 模 式 図 (b).阻 害 状 態 の3次 元 像(d)と そ の 模 式 図(c).赤/榿 ・赤 紫 は ア ク チ ン,青 ・ 濃 緑 は トロ ポ ミ オ シ ン,像 の縦 方 向 の長 さ は150Å,下 が ＋端(barbedend). *の 領 域 で ア ク チ ンと トロ ポ ミオ シ ンの 結 合 が 変化 する.557 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.47No.5(2002) +Ⅰ)はCa2+濃 度 に 無 関 係 に ア ク チ ン ・ ミ オ シ ン の 相 互 作 用 を 阻 害 す る.そ こ でEGTAを 使 わ ず に 弛 緩 状 態 を 実 現 で き る. ア ク チ ン-ト ロ ポ ミオ シ ン-ト ロ ポ ニ ン(T＋Ⅰ)の3次 元 構 造 は こ う し て 得 ら れ た(図3d;図3cは そ の 模 式 図).こ の 構 造 は 弛 緩 状 態 を 代 表 し て い る.ト ロ ポ ミ オ シ ン の 位 置 は シ フ ト し,*で 示 し た 領 域 で は と く に 緊 密 に ア ク チ ン と 結 合 し て い る. こ う し て“細 い フ ィ ラ メ ン ト”の モ デ ル に は 裏 づ け が 得 ら れ,収 縮 ・弛 緩 の 際 に そ の 立 体 構 造 が 変 化 し て い る 確 か な 証 拠 が 得 ら れ た.し か し ス テ リ ッ ク ・ブ ロ ッ ク 仮 説 の 吟 味 の た め に は,ア ク チ ン の ミ オ シ ン結 合 部 位 と ト
ロ ポ ミオ シ ン結 合 部 位 の 関 係 を 明 ら か に す る 必 要 が あ
る.ア
ク チ ン と ミオ シ ンの 結 合 部 位 の 詳 細 は,筋 収 縮 の
分 子 メ カ ニ ズ ム の解 明 に も不 可 欠 で あ る.
Ⅱ.ア クチンとミオシンの結合部位の決定:電 子顕
微鏡法による
1.ア クチンとミオシンの結合様式
ミ オ シ ン のATPaseは ア ク チ ン と 相 互 作 用 す る と 約 100倍 に 活 性 化 さ れ る.ATPが ミ オ シ ン に 結 合 し加 水 分 解 さ れ て も,分 解 産 物 で あ るADPと 無 機 リ ン'酸(Pi; inorganic phosphate)は ミ オ シ ン 上 に 留 ま る.リ ン酸 の 解 離 ・ 放 出 が 律 速 過 程 に な っ て い て, ATPaseサ イ ク ル は 回 ら な い が,ア ク チ ン と 相 互 作 用 す る と こ の 過 程 が 加 速 さ れ 収 縮 が 起 こ る.そ こ で ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン ト と ミ オ シ ン の 結 合 の 様 式 の 決 定 は,収 縮 の 分 子 メ カ ニ ズ ム を 明 ら か に す る う え で も 重 要 で あ る. ミ オ シ ン 分 子 は2つ の 頭 部 と 1本 の 尾 部 か ら な る.頭 部 に は ATPaseの 活 性 部 位 と ア ク チ ン 結 合 部 位 が あ る.頭 部 は キ モ ト リ プ シ ン 切 断 で 得 ら れ,サ ブ フ ラ グ メ ン ト1(S1)と も よ ば れ る.ATPが な い 場 合 は,頭 部 と ア ク チ ン は 分 子 比1:1の 複 合 体 を 形 成 し,そ の 構 造 は ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン ト と 同 じ ら せ ん 対 称 性 を も つ の で,こ れ を 利 用 し て3次 元 像 を 電 子 顕 微 鏡 像 か ら 再 構 成 で き る.Mooreら6) の 結 果 で は,結 合 部 位 の 様 子 が よ くわ か ら な い の で,分 解 能 の 向 上 の た め 最 小 電 子 線 量 法 を 使 う こ と に し た.電 子 線 に よ る 試 料 の 損 傷 を 最 小 化 し 詳 し い 構 造 を み る の に 効 果 的 だ っ た39，40). 図4ア ク チ ン ートロ ポ ミ オ シ ン ーミ オ シ ン 頭 部 複 合 体 に お け る ア ク チ ン-ミ オ シ ン 結 合 部 位 の 決 定41) (a)複 合 体 の3次 元 像 の 一端(polntedend)か らの 鳥瞰 図41),(b)筆 者 らの 解釈41),(Q)欧 米 グル ー プ の 解 釈43),(d)複 合体の3次 元像(f)ミ オ シ ン 頭 部 を 含 ま な い複 合 体 の3次 元 像45),(e)d とfの 相 力口平均 像.d→e→fで 領 域AもBも 保 たれ ア クチ ンで あ る こと を示 す.558 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.47No.5(2002)
2,ア クチ ンと ミオ シン は2:1で
結合 するの か?
図4dは 得 ら れ た ア ク チ ン-ミ オ シ ン 頭 部 複 合 体 の3 次 元 像 で あ り41),中 心 部 に ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン トが あ り周 辺 に バ ナ ナ の よ う な ミ オ シ ン 頭 部 が 結 合 し て い る. こ の 像 を 真 横 か ら 見 る と 上 側 に 尖 っ た 矢 じ り構 造 が 観 察 で き,上 方 を 尖 端(pointedend)と よ ぶ.下 方 を 棘 端 (barbedend)と よ び,ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン ト は こ の 方 向 に 速 く伸 長 し ＋端 と も よ ば れ る.筋 肉 の な か で は 棘 端 側 にz帯 が あ り,ア ク チ ン は 収 縮 時 に は 上 向 き に 進 む. ア ク チ ン-ミ オ シ ン頭 部 複 合 体 の 像 を 尖 端 側 か ら み る と 図4(a)の よ う に み え る.ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン トの 直 径 は70∼100Aな の で,緑 と 青 の 領 域 は ミ オ シ ン頭 部 で あ る.ア ク チ ン の 同 定 は 分 解 能 が 向 上 した た め に か え っ て む ず か し く な っ た.Mooreら の 像 で はB領 域(橙 色) は 小 さ く,A領 域(赤)を ア ク チ ン と 同 定 で き た が,Tay-lorとAmos42,43)は,領 域Bは ア ク チ ン で,領 域Aは ア ク チ ン で は な く ミ オ シ ン 頭 部 の 一 部 で あ る と 解 釈 し た (図4c).領 域Bは フ ィ ラ メ ン ト軸 か ら 近 く(15A),領 域Aは 外 側(25Å)な の で 自 然 な 選 択 で あ り,ミ オ シ ン 頭 部 を 浸 み 込 ま せ た 筋 肉 か ら 得 たX線 回 折 を 手 本 と し て,電 子 顕 微 鏡 像 を 選 ぶ 手 法 も 説 得 力 を 増 し た43).こ の 解 釈 に 従 っ て ア ク チ ン 部 分 を 切 り出 す と 直 径 が 約90Å と な り,Egelmanが 提 唱 し た ア ク チ ン 単 量 体 を2つ の 球 で 近 似 し た ア ク チ ン モ デ ル の 直 径(90∼100Å)と も 近 い44)。 ア ク チ ン と ミ オ シ ン 頭 部 の 複 合 体 を 架 橋 す る と, SDS電 気 泳 動 的 に 分 子 量 の 異 な る2種 類 の 架 橋 産 物 が 得 ら れ る45).領 域Bの み を ア ク チ ン と 解 釈 す る と,ミ オ シ ン頭 部 は2分 子 の ア ク チ ン と 接 触 し て い て 都 合 が よ い.大 半 の 研 究 者 が 図4cを 信 じ た.3,ア クチ ン ・
ミ オ シン結 合 は1:1で
あ り結 合面 は広 い
筆 者 ら は 別 の ア プ ロ ー チ を 行 な っ た.ミ オ シ ン 頭 部 を 結 合 さ せ た フ ィ ラ メ ン ト(図4d)と 結 合 さ せ な い フ ィ ラ メ ン ト46)(図4f)の2つ の 構 造 の3次 元 密 度 関 数 の 相 互 相 関 関 数 を 系 統 的 に 計 算 し,両 者 が 最 も よ く重 な りあ う 配 置 を 決 定 し た.図4(e)は 両 者 を こ の よ う に 配 置 し た 平 均 像 で あ る.ミ オ シ ン頭 部 は(d)で は100%,(e)で は 50%,(f)で は0%な の で,矢 印 を た ど る と ミ オ シ ン 頭 部 は 徐 々 に 消 え て ゆ く.し か し ア ク チ ン 領 域 は3つ の 像 で 共 通 な の で 保 た れ る.領 域Aも 領 域Bも 保 た れ て い る の で 両 方 と も ア ク チ ン で あ る こ と が わ か っ た(図4b). 筆 者 ら の モ デ ル4Pで は,ア ク チ ン は 領 域A(outerdo-main)と 領 域B(innerdomain)の2つ の ド メ イ ン か ら な り,2球 モ デ ル と よ く 一 致 す る.直 径 も80∼100Aで 申 し 分 が な い.ア ク チ ン と ミ オ シ ン 頭 部 は1:1で 横 に 広 い 範 囲 で 結 合 し て い る.で は 架 橋 実 験 は ど う 説 明 す る の か.架 橋 産 物 のSDS電 気 泳 動 の バ ン ド を 分 析 す る と,2 本 と も ア ク チ ン と ミ オ シ ン頭 部 を1:1の 分 子 比 で 含 ん で い る と 報 告 さ れ た47,48).架 橋 個 所 が2つ あ り,そ れ に 依 存 し て 泳 動 度 が 変 化 し た の で あ る.筆 者 ら の モ デ ル は 架 橋 実 験 を む し ろ よ く説 明 で き る こ と に な っ た. 蛍 光 標 識 し た ミ オ シ ン 頭 部 を 浸 透 度 を モ ニ タ ー しつ つ 十 分 に 浸 み 込 ま せ る と,ア ク チ ン の 長 い ピ ッ チ(380Å) か ら の 反 射 に フ ィ ラ メ ン ト間 の 干 渉 効 果 が 現 わ れ て し ま う49).欧 州 グ ル ー プ が 気 づ か な か っ た の は,ミ オ シ ン 頭 部 の 浸 透 が 不 十 分 だ っ た た め ら し い.結 局,ミ オ シ ン 頭 部 の 結 合 が 十 分 で も不 十 分 で も,そ れ ぞ れ 別 の 理 由 で 手 本 と し て 相 応 し く な い.Ⅲ.ミ オ シ ン のATPに
よ る構 造変 化:電 子顕微鏡
X線 結晶解析,蛍 光エネルギー移動の情報統合
1.ア クチ ン とミオ シン頭部 のX線 結 晶解 析
ア ク チ ン-DNaseⅠ 複 合 体 の 結 晶 解 析 に よ りア ク チ ン
の 原 子 モ デ ル が 得 られ50),つ い で ミオ シ ン頭 部 の 原 子 構
造 が 報 告 さ れ51),筋 収 縮研 究 は原 子 時 代 に 入 っ た.こ
れ
らの 原 子 モ デ ル は 図4bに
す っ ぽ りと収 め る こ とが で き
るの で,筆 者 らの モ デ ル は 原子 レベ ル で も確 認 され た.
図5で
は,ミ
オ シ ン と結 合 して い る ア クチ ンは 黄 色 で示
しそ れ 以 外 の ア クチ ン は茶 色,ミ
オ シ ン頭 部 の お もな部
分 は灰 白 色 と赤 紫 で あ る.ミ オ シ ン頭 部 は ア クチ ン分 子
の 前 面 の 右 半 分 を ほ ぼ 覆 っ て い る.ア
クチ ンの 右 半 分
は,図4で
は 領 域Aで
あ り図7(a)で は 外 側 ドメ イ ン で
あ り,お も にサ ブ ドメ イ ン1と 結 合 して い る.
2,ミ オ シ ンのATPに
よ る構造 変化
ADPと バ ナ ジ ン酸 を 結 合 し た ミ オ シ ン は,ミ オ シ ン -ADP-リ ン 酸 複 合 体 の ア ナ ロ グ で,ATP存 在 下 で の ミ オ シ ン の 構 造 を 代 表 す る.図5にX線 結 晶 解 析 の 結 果 を ま と め た.ADP,バ ナ ジ ン 酸 を 結 合 し た ミ オ シ ン 頭 部 の 軽 鎖 結 合 部 の ヘ リ ッ ク ス(橙)は 上 を 向 き52),ADP 複 合 体(緑)で は 横 を 向 き,ホ タ テ 貝 の ミ オ シ ン(赤)で は559 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.47NO.5(2002)
同 じADPの
存 在 下 で も下 を向 い て い る53).
こ れ 以 前 に筆 者 らは ミオ シ ン頭 部 のATPに
よ る構 造
変 化 を2つ の 方 法 で 観 察 して い た.シ
ャ ドウ イ ング法 に
よ る電 子 顕 微 鏡 観 察 で は,ミ
オ シ ン頭 部 はADPと
バ ナ
ジ ン酸 の 存 在 下 で は 伸 長 型 が 減 り屈 曲型 が 増 す54).こ の
方 法 で は ア ー テ ィ フ ァ ク トの 心 配 もあ る の で,溶 液 中 の
ミオ シ ン頭 部 のX線
小 角 散 乱 も調 べ た(若 林 克 三 博 士 と
の 共 同研 究).水
溶 液 中 で の ミオ シ ン頭 部 の 場 合 もATP
に よ っ て コ ンパ ク トに な る こ とが わ か り55),屈 曲 型 が 増
す と した電 子 顕 微 鏡 観 察 と 矛 盾 しな い.
ATPに
よる ミオ シ ン頭 部 の 構 造 変 化 はN末
端 付 近 で
は起 こ らず,軽
鎖 結 合 部 位 に は 起 こ る こ と に着 目 した 須
藤 研 究 室 で,こ
の2ヵ
所 に 蛍 光 蛋 白 質 で あ るGFPと
BFPを
融 合 させ,蛍
光 性 ヌ ク レ オ チ ド も用 い て 蛍 光 エ
ネ ル ギ ー 移 動 法 に よ り蛍 光 標 識 間 の 距 離 を求 め た.距
離
デ ー タ を筆 者 らが 開 発 した 確 率 的 距 離 幾 何 学 法56)で解 析
した.共 同 研 究 の 結 果,軽
鎖 結 合 部 位 に融 合 させ た蛍 光
蛋 白 質 の3次 元 的 位 置 が,ATP存
在 下 で は 図5の 橙 色
の メ ッ シ ュ の 位 置,ADPで
は緑 色 の メ ッ シ ュ の 位 置 に
変 化 す る こ とが わ か っ た57).こ れ はRaymentら
の 結 晶
解 析 の 結 果 と一 致 す る.し か しホ タテ 貝 ミオ シ ンのADP
型 の 構 造53)とは一 致 しな い.ホ
タテ 貝 ミオ シ ン を別 に す
る と,4つ
の 異 な る研 究 法 で 同 じ よ う に ミオ シ ン頭 部 の
軽 鎖 結 合 部 がATPに
よ っ て 大 き く振 れ る こ とが 明 確 に
示 され た.こ
の 動 き は収 縮 を説 明 す る だ ろ うか.
3.ミ オシンの構造変化 と収縮の分子モデル
ミ オ シ ン 頭 部 は 筋 肉 の な か で は 図6の 黒 矢 印 で 指 し た 個 所 で サ ブ フ ラ グ メ ン ト2(S2)と よ ば れ る 部 分 に 連 な り,S2を 介 し て 太 い フ ィ ラ メ ン トの バ ッ ク ボ ー ン に 連な っ て い る.し た が っ て,ATP
型 か らADP型
へ の構 造 変 換 に
伴 っ て 軽 鎖 結 合 部 が 振 れ る と,
筋 肉 の な か で は ミオ シ ン頭 部 に
結 合 して い る ア ク チ ン ・
フ ィ ラ
メ ン トは 図6の 右 半 分 に描 い た
よ うに 上 方(M線
側)へ と約100
Aだ け押 し上 げ られ る.ス ラ イ
ド方 向 もス ラ イ ド距 離 も力 学 的
測 定 の結 果 と一 致 す る58).し か
し観 測 さ れ て きた構 造 変 化 は ミ
オ シ ン単 独 の 場 合 で あ り,ア ク
チ ン との 相 互 作 用 の結 果 で は な
い こ と に 注 意 が 必 要 で あ る.軽
鎖 結 合 部 位 が 振 れ る 際 に,力 が
出 る の か ど うか も不 明 で あ る.
図5ア ク チ ン,ミ オ シ ン 頭 部 の 原 子 モ デ ル と 軽 鎖 結 合 部 位57) ア クチ ン,ミ オ シ ン頭 部 はPDBフ ァイ ル1ALMを 用 い た.約20 回転 す る αヘ リ ック ス は さ ま ざ まな ヌ ク レ オ チ ド存 在下 で の 軽 鎖 結 合 部 位 を 示 し51∼53),メッ シ ュ はATP(橙)ま た はADP(緑)存 在 下 で の 軽 鎖結 合 部 位 に融 合 した 蛍光 蛋 白質 の 位 置56,57)を示 す,図6軽
鎖結 合部 位 のス イン グ とア クチ ン ・
フ ィラメン トの滑 りの 模式 図
560 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.47No.5(2002)
電 子 顕 微 鏡 観 察 で は54),伸 長 型 と屈 曲型 は常 に 並 存 し,
ATPは
分 布 を シ フ トさせ る だ け で あ る こ と も考 慮 す べ
きで あ ろ う.
ア クチ ン-ミ オ シ ン頭 部 複 合 体 の 電 子 顕 微 鏡 像 か らの
3次 元 像 再 構 成 の 最 新 の 結 果 で は59),ミ オ シ ン頭 部 の
ATP結
合 部 位 の 溝 や 隣接 す る αヘ リ ッ クス に よ る 山 脈
状 膨 大 が 観 察 で き,X線
結 晶解 析 か らの 原 子 モ デ ル との
詳 細 な対 応 を見 て とれ る.ア
クチ ン と結 合 して い る モ ー
ター 領 域(図5で
灰 白色 と赤 の 部 分)の 大 半 の構 造 も原 子
モ デ ル と よ く対 応 す る が,軽 鎖 結 合 部 位 の 原 子 モ デ ル は
電 子 顕 微 鏡 か らの 構 造 か ら はみ 出 て し ま う.こ れ は ミオ
シ ンが ア ク チ ン と結 合 す る際 に構 造 変化 し,軽 鎖 結 合 部
位 が振 れ て い る こ とを 示 して い る.
こ の よ うにATP不
在 の 場 合 で も,ミ オ シ ン は ア ク チ
ン に 結 合 す る と構 造 変 化 す る.ATP存
在 下 で ア ク チ ン
に結 合 し た 場 合 は ど の よ う に 変 化 す る か 予 断 は 許 さ れ
ず,今
後 に残 され た 重 要 課 題 で あ る.
図7“ 細 い フ ィ ラ メ ン 卜”の 構 成 要 素 (a)ア クチ ン の 原 子 モ デ ル51).ロ ー マ 数 字 はサ ブ ドメ イ ン 名.(b) 構 成 ユ ニ ッ トは ア ク チ ン7分 子,ト ロ ポ ミオ シ ン1分 子,ト ロポ ニ ン1分 子 で あ り,ト ロ ポ ミ オ シ ンのN末 端 は ア クチ ンの 一 端 側 に あ る.ロ ー マ 数 字 は ブ ロ ッ クを 示 す. 図8“ 細 い フ ィ ラ メ ン ト”の ク ラ イ オ 電 子 顕 微 鏡 像 か ら再 構 成 した3次 元 像12) (a)全 体 像.(b)全 体 像 か らア ク チ ンの寄 与 を差 し引 いた 像 と ア ク チ ンの 原 子 構造 の ワ イヤ ー モ デ ル を 組 み 合 わ せ た 図.上 が 一 端, []で トロ ポ ニ ン頭 部 の 所 在 を示 した.561 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.47No.5(2002)
Ⅳ.細 いフィラメントの全構造の3次 元再構成
1.細 いフ ィラ メン トの構成 ユニ ッ トと構 造単 位
第1節 で “細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 初 期 の 構 造 研 究 に つ い て 述 べ た が,そ の 後 も ネ ガ テ ィ ブ 染 色 に よ る 電 子 顕 微 鏡 像 か ら,ら せ ん 対 称 性 を 仮 定 し て 再 構 成 し た 立 体 像 か ら トロ ポ ミ オ シ ン の 動 き を 求 め る 研 究 が 続 い て き た60). 1990年 代 に は2つ の 強 力 な 方 法 が 使 わ れ る よ う に な っ た.ク ラ イ オ 電 子 顕 微 鏡 法61)と 単 粒 子 解 析 法62,63)で あ り,後 者 は らせ ん 対 称 性 に 依 存 し な い. らせ ん 対 称 性 に 頼 ら な い で3次 元 構 造 解 析 で き れ ば, トロ ポ ニ ン を 含 め た “細 い フ ィ ラ メ ン ト”全 体 の 構 造 を 明 ら か に で き る.図7(b)に そ の 構 成 要 素 を 示 し た.“ 細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 構 成 ユ ニ ッ ト は,ア ク チ ン(分 子 量 42K)が7分 子,ト ロ ポ ミ オ シ ン(66K)が1分 子,ト ロ ポ ニ ン(70K)が1分 子 か ら な る.構 造 的 に は 長 さ 方 向 に 770Aあ る 構 造 単 位(ク ロ ス オ ー バ ー2個 分)か ら な り, 上 記 の 構 成 ユ ニ ッ トが4個 含 ま れ る.そ こ で 構 造 単 位 の 重 量 は 約1,700Kと な る. 図9低Ca2+濃 度 で の トロ ポ ニ ン ・ ア ー ム の 出 現12) (a)ト ロ ポ ニ ン 頭 部 の 近 傍 の 拡 大 図,ト ロ ポ ニ ン,ト ロポ ミ オ シ ン は実 体 モ デ ル で 、 ア ク チ ン は ワ イ ヤ ー モ デ ル で 示 し た.高Ca2+濃 度 で の トロ ポ ニ ン 頭 部 は 瓢 箪 形 を して お り,く び れ の 個 所 を 矢 じ りで 示 した.低Ca2+濃 度 で 出 現 す る トロポ ニ ン ・アー ム を黒 い 点 線 の楕 円 で 囲 み,高Ca2+濃 度 で の 対 応 す る 位 置 を 白い 点 線の 楕 円で 示 した.ト ロ ポニ ン ・アー ム は3分 子 の ア クチ ン(緑 ,青, 紫)が 接 す る領 域 を覆 うこ と が わ かる, (b)aの 緑 の ア クチ ン の 近 傍 で の 投 影 図 を 一 端 か ら見 た 等 高 線 図.ト ロ ポ ニ ン 頭 部 が 約28Aシ フ トして い る.iは 内 側 ドメイ ン,oは 外 側 ドメ イ ン. 図10卜 ロ ポ ミ オ シ ン,卜 ロ ポ ニ ン の7つ の ブ ロ ッ ク で の 平 均 的 位 置12) ブ ロ ッ クVに は トロポ ニ ン頭 部 が あ り,ブ ロ ック Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ で は ト ロポ ミ オ シ ン はほ と ん ど シ フ トしな い.ブ ロ ックⅤ,Ⅵ,Ⅶ で は ト ロポ ミ オ シ ン,卜 ロ ポ ニ ンが 大 き く シ フ トす る.上 が 一端,青 は 低Ca2+濃 度,茶 は 高Ca2+濃 度 で の トロ ポ ミ オ シ ン,ト ロ ポ ニ ン の 位 置,灰 色 は ア ク チ ン 、赤 の 点 線 らせ ん は 高Ca2+濃 度 で の 平 均 的 位 置.562 蛋 白質 核 酸 酵 素Vol.47No.5(2002)
2,単 粒 子解 析 によ る “
細 い フ ィラ メ ン ト”の構 造決 定
対 称 性 に依 存 し ない で3次 元 構 造 を再 構 成 す る に は,
CTス
キ ャ ン法 の よ う な 方 法 が 必 要 と な る.CTス
キ ャ
ン法 で は さ ま ざ ま な角 度 か ら対 象 の像 を記 録 し,こ れ ら
を総 合 して 立 体 像 を求 め る.電 子 顕 微 鏡 の 場 合 は,電 子
線 傷 害 の た め に さ ま ざ ま な 角 度 か ら同 じ試 料 の像 を撮 影
す る こ と は む ず か しい.こ
の 困 難 を 克 服 す る 方 法 と し
て,単 粒 子 解 析(single particle analysis)が あ る62,63).
単 粒 子 解 析 で は,多 数 の 像 の 互 い の相 対 的 角 度 を 決 定
し,そ れ らか ら逆 投 影 に よ り立 体 像 を計 算 す る.筆 者 ら
は新 しい ア イ デ ア で 角 度 決 定 に
成 功 した12).
Ca2+濃 度 の 効 果 を 明 ら か に
す る た め に,ク
ラ イ オ 電 子 顕 微
鏡 法 を用 い た.生 理 的 溶 媒 中 の
蛋 白 質 試 料 を 電 子 顕 微 鏡 用 グ リ
ッ ドに載 せ 急 速 凍 結 し,低 温 に
保 ち つ つ 電 子 顕 微 鏡 鏡 体 内 に移
行 させ撮 像 す る.染 色 は せ ず 水
和 した 蛋 白 質 を 観 察 で き る.
EGTAを
用 い て 自 由 にCa2+濃
度 を変 え る こ と もで き る.
3,ト ロポニ ン ・
ア ー ムの 弛緩 時
の 出現
図8(a)は ク ラ イ オ 法 と 単 粒 子 解 析 に よ り 得 ら れ た “細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 立 体 像 で あ る12).}で 示 し た ア ク チ ン はX 線 か ら の 原 子 モ デ ル と ほ ぼ 同 じ 形 を し て お り,ADP結 合 部 位 の 窪 み(矢 じ りで 指 し た)も 見 え る.ト ロ ポ ニ ン と ト ロ ポ ニ ン を 観 察 す る た め に ア ク チ ン の 寄 与 を 差 し 引 い た 像 を 図8(b)に 示 し,参 照 の た め ア ク チ ン の 原 子 モ デ ル を ワ イ ヤ ー で 示 し た.単 量 体 ご と に 色 を 変 え て あ る.[] で 示 し た 部 分 は トロ ポ ニ ン の 頭 部 で あ り,図9(a)は そ の 拡 大 像 で あ る.トロ ポ ニ ン頭 部 は カ ル シ ウム に よ っ て 大 き く構 造 と位
置 を 変 え て い る.弛 緩 状 態(低Ca2+濃
度)で は 水 平 方 向
に枝 状 に 分 岐 し,こ の 枝 を トロ ポ ニ ン ・
ア ー ム と名 づ け,
図9(a)の 左 図 で 楕 円 で 囲 ん だ.収 縮 時 は こ の ア ー ム は
見 え ず,お
そ ら く トロ ポ ニ ン頭 部 に ドッ ク して 図9(a)
の 右 図 に*で 示 した膨 大 部 を形 成 す る の で あ ろ う.図9
(b)は(a)の 緑 で 示 した ア ク チ ンの 近 傍 を 上 か ら見 て 密
度 を 平 均 した 等 高 線 図 で あ り,弛 緩 時 に は ア クチ ンの外
部 ドメ イ ンを 覆 っ て お り,収 縮 時 に は内 部 ドメ イ ンの サ
ブ ドメ イ ン1を 覆 う よ うに 移 動 して い る.
図11” 卜ロ ボ ミ オ シ ン ”の 差 動 的 シ フ ト12) (a)bの 青 い ア ク チ ンの 近 傍 での 投 影 図 を 一端 か ら見 た等 高 線 図,(b)図9aを45.回 転 した 図, (c)下 の 紫の ア クチ ンの 近 傍 で の投 影 図 を 一端 か ら見 た 等 高線 図,563 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.47No.5(2002)
4.ト ロポ ミオ シ ンの位 置
細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 構 成 ユ ニ ッ トに は ア ク チ ン が7 分 子 含 ま れ る の で,構 造 を7個 の ア ク チ ン の そ れ ぞ れ の 近 傍(ブ ロ ッ ク1∼W)で 平 均 し て 全 体 と し て 示 し た の が 図10で あ る.参 照 の た め に 図 の な か の 赤 の 点 線 ら せ ん で 高Ca2+濃 度 で の ト ロ ポ ニ ン,ト ロ ポ ミ オ シ ン の 密 度 の 平 均 的 位 置 を 示 し て い る.ブ ロ ッ クⅤ は トロ ポ ニ ン 頭 部 に 対 応 し体 積 が 大 き い. 高Ca2+濃 度 で は,ト ロ ポ ミ オ シ ン,ト ロ ポ ニ ン は ら せ ん に 沿 っ て 存 在 し て い る.ト ロ ポ ミ オ シ ン のN末 端 は ブ ロ ッ ク1に あ り,C末 端 は ブ ロ ッ ク 珊 に あ る と 考 え ら れ る.弛 緩 時 は ブ ロ ッ クⅤ を 境 に し て ト ロ ポ ミ オ シ ン のN末 端 側 とC末 端 側 で は 様 子 が 違 う.前 者 で は ト ロ ポ ミ オ シ ン は 約12Aし か 移 動 せ ず(図11a),後 者 で は 約35Aだ け 外 側 ド メ イ ン 側 に 移 動 し て い る(図11c). 図11に こ の 様 子 を 拡 大 し て 示 し た.ト ロ ポ ニ ン は ブ ロ ッ クⅤ を 中 心 と し た 頭 部 と ブ ロ ッ クⅥ と Ⅶ に 伸 び る 尾 部 か ら な る.ト ロ ポ ニ ン尾 部 は トロ ポ ミ オ シ ン と 結 合 し て い る と 予 想 さ れ る の で,ト ロ ポ ミ オ シ ン と トロ ポ ニ ン尾 部 の 区 別 は で き ず,将 来 の 課 題 で あ る.逆 に ブ ロ ッ クⅠ ∼ Ⅳ に は ト ロ ポ ニ ン の 寄 与 は 少 な く,密 度 は ほ と ん ど ト ロ ポ ミ オ シ ン に よ る も の で あ る.Ⅴ.ミ オ シ ン結合 部 位 と トロ ポミオ シ ン
こ の よ う な ト ロ ポ ニ ン,ト ロ ポ ミ オ シ ン の 構 造 変 化 と 移 動 の 結 果,ミ オ シ ン結 合 部 位 は ど の よ う な 影 響 を 受 け る の で あ ろ う か.図12に ス テ レ オ で 結 果 を 表 示 した12). ア ク チ ン(CPKモ デ ル)の ミ オ シ ン結 合 部 位64)は 赤,橙, 黄,緑,淡 青,濃 青 で 示 し た.ト ロ ポ ニ ン,ト ロ ポ ミオ シ ン の 密 度 は メ ッ シ ュ で 示 し,収 縮 時(茶)と 弛 緩 時(青) を 色 分 け し た.(a),(b),(c)は そ れ ぞ れ 図10の ブ ロ ッ ク Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ の も の で あ る.ブ ロ ッ ク Ⅳ で は ト ロ ポ ミ オ シ ン は 約12Å か 移 動 せ ず,ブ ロ ッ クⅤ と Ⅵ で は ミ オ シ ン 結 合 部 位 の ま っ た だ 中 に 移 動 し て い る.図10に 戻 る と ス テ リ ッ ク ・ブ ロ ッ ク 仮 説 で 当 初 に 想 定 さ れ た こ と は,ブ ロ ッ クⅤ,Ⅵ,Ⅶ で の み 確 認 さ れ,ブ ロ ッ ク Ⅱ, Ⅲ,Ⅳ で は 否 定 さ れ た.こ の よ う に 弛 緩 時 の ト ロ ポ ミ オ シ ン,ト ロ ポ ニ ン は らせ ん 対 称 性 か ら外 れ て お り,ら せ ん 対 称 性 を 仮 定 し た 構 造 解 析 は 正 し い 結 果 を 与 え な い. ま た 収 縮 時 は か な り らせ ん 対 称 性 が 保 た れ て い る が,こ れ ま で トロ ポ ミ オ シ ン と解 釈 さ れ た 密 度 は ト ロ ポ ニ ン の 影 響 を 強 く受 け て い る12).Ⅵ.卜 ロポ ニ ン ・
アー ム とアク チ ン の結 合部 位 と
ホ ッ ト・
スポ ッ トア ミノ酸
Ⅳ-3で も 触 れ た よ う に,弛 緩 時 に は ト ロ ポ ニ ン 頭 部 は 分 岐 し て ト ロ ポ ニ ン ・ア ー ム が 出 現 す る.図9の 右 図 に 白 い 楕 円 で 弛 緩 時 に は トロ ポ ニ ン ・ア ー ム に 覆 わ れ て い た 領 域 を 示 し た.こ の 領 域 で は3分 子 の ア ク チ ン が 互 い に 接 し て い る.こ れ ら の3分 子 の ア ク チ ン が トロ ポ ニ ン ・ア ー ム で 覆 わ れ る 様 子 を 図13に 示 し た.図 の な か で 太 い ワ イ ヤ ー で 示 し た 部 分 が トロ ポ ニ ン ・ア ー ム と 接 し て い る.興 味 深 い こ と に,こ れ ら の う ち で 図 中 に 色 文 字 で 注 釈 し た 部 分 はDNaseI,プ ロ フ ィ リ ン,ゲ ル ゾ リ 図12ア ク チ ン上 で の 制 御 蛋 白 質(卜 ロ ポ ミ オ シ ン ・卜ロ ポ ニ ン)と ミ オ シ ン 結 合 部 位 と の 関 係12) 図11bで 青 い ア ク チ ン(a),緑 の ア ク チ ン(b),紫 の ア ク チ ン(c) の 上 で の制 御 蛋 白質 の 密 度 を メ ッシ ュ で 示 し,ミ オ シ ン結 合 部 位 を ア ク チ ン のCPKモ デル の 上 に 赤,橙,黄,緑,淡 青,濃 青 で 示 した.564 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.47No.5(2002)
ンな どの ア クチ ン結 合 蛋 白 質 の 結 合 部 分 と共 通 で あ る.
黒 字 で 注 釈 した 部 分 は トロポ ニ ン ・
ア ー ム 独 特 の 結 合 部
位 で あ る. こ れ ら の す べ て の 部 分 の ア ミ ノ 酸 配 列 に 共 通 す る こ と は,グ リ シ ン,プ ロ リ ン を 含 み,ア ル ギ ニ ン,チ ロ シ ン な ど π 電 子 を 含 む ホ ッ ト ・ス ポ ッ ト ア ミ ノ 酸65)に 富 ん で い る こ と で あ る. ホ ッ ト ・ス ポ ッ ト ア ミ ノ 酸 は 蛋 白 質 間 の 結 合 部 位 に 高 い 頻 度 で 存 在 す る の で,ア ク チ ン の ト ロ ポ ニ ン 結 合 部 位 と し て 相 応 し い.グ リ シ ン や プ ロ リ ン は 蛋 白 質 の 主 鎖 の 構 造 変 化 が 起 きや す い こ と が 想 定 で き る の で,ア ク チ ン と トロ ポ ニ ン はinducedfit に よ り 結 合 す る の か も し れ な い.Ⅶ.ア クチンによるミオシン
のATPase活
性化を増
強するアクチン変異体
ア ク チ ン の フ ォ ー ル デ ィ ン グ は 特 別 な 分 子 シ ャ ペ ロ ン が 必 要 で あ り,大 腸 菌 で の 機 能 的 ア ク チ ン の 発 現 は 成 功 して い な い.デ ィ ク チ オ 型 粘 菌 で は 十 数 組 の ア ク チ ン 遺 伝 子 が あ る の で,変 異 体 ア ク チ ン の 発 現 に 都 合 が よ い66).筆 者 ら は ア ク チ ン の 第4サ ブ ド メ イ ン(図7a)の 左 に 飛 び 出 し て い る ヘ リ ッ ク ス(Phe223∼Ala230)に 着 目 し た.Ala230を チ ロ シ ン に 変 異 さ せ る と(A230Y), ア ク チ ン と し て の 変 化 は 少 な い が,ト ロ ポ ニ ン,ト ロ ポ ミ オ シ ン,Ca2+の 存 在 下 で ミ オ シ ン のATPaseが 野 生: 型 よ り数 倍 活 性 化 す る(図14)13・14・16).こ の 変 異 体 をX 線 結 晶 解 析 す る と 図15の(c,d)に 示 す よ う に 野 生 型 と ほ と ん ど 同 じ で あ る が,変 異 さ せ て い な いLeu236の 側 鎖 が 移 動 し230番 目 の ア ミ ノ 酸 を 中 心 と し た 疎 水 ポ ケ ッ トの 溶 媒 露 出 度 が 増 し て い る こ と が わ か っ た15).さ ら に 露 出 度 を 増 す 目 的 で,Leu236を 側 鎖 が 短 い ア ラ ニ ン に 変 え る 変 異 を 追 加 し た と こ ろ,ト ロ ポ ミ オ シ ン ま た は ト ロ ポ ミ オ シ ン,ト ロ ポ ニ ン,Ca2+の 存 在 下 で,こ れ ま で に な い 顕 著 な 活 性 化 が 生 じ た(図14)16).第4サ ブ ド メ イ ン の 疎 水 ポ ケ ッ トが 開 く と な ぜ ト ロ ポ ミ オ シ ン存 在 下 で の み 活 性 化 が 増 大 す る の で あ ろ う か.お そ ら く変 異 図13卜 ロ ポ ニ ン ・ア ー ム の ア ク チ ン 上 の フ ッ ト ・プ リン ト12) 互 い に接 す る3分 子 の ア クチ ン の ワイ ヤ ー モ デ ルの う ちで トロ ポ ニ ン ・ア ー ム が 覆 う領 域 を 太 い ワ イヤ ー で示 した.青 文字 はDNaseⅠ,赤 文 字 はゲ ル ゾ リン と プ ロ フ ィ リンの 両 者,茶 文 字 は ゲル ゾ リン,黒 文 字 は トロポ ニ ン ・ア ー ム が結 合 す る 配 列 を 示 す. 図14ア ク チ ン 変 異 体(デ ィ ク チ オ 型 粘 菌)に よ る ミ オ シ ン ATPaseの 活 性 化16) トロ ポ ミ オ シ ン(Tm),ト ロ ポ ニ ン(Tn),Ca2+存 在 下 で は 変 異 体 ア クチ ン は よ り強 く ミオ シ ンATPaseを 活 性 化 す る.ト ロ ポ ミ オ シン のみ の 存 在 下 で は二 重 変 異 ア ク チ ン(A230Y/L236A)の み が強 く活性 化 す る.565 蛋 白 質 核 酸 酵素Vol.47No.5(2002) ア ク チ ン で は 開 い た 疎 水 ポ ケ ッ トに ト ロ ポ ミ オ シ ン が 結 合 す る た め で あ ろ う.図12(a,c)か ら も 見 て と れ る が, 高Ca2+濃 度 の 場 合 も,ト ロ ポ ミ オ シ ン は 疎 水 ポ ケ ッ ト か ら 離 れ た 場 所 で ア ク チ ン に 結 合 し て お り,こ の 状 況 で は ミ オ シ ンATPaseを 十 分 活 性 化 で き な い の で あ ろ う.
Ⅷ.筋
収 縮 ・弛 緩 の メカ ニ ズム
こ れ ま で に 得 ら れ た 知 見 を ま と め た も の が 図16で あ る.ク ラ イ オ 電 子 顕 微 鏡 法 と 単 粒 子 解 析 で 解 い た 構 造 は T*状 態(低Ca2+濃 度)とT状 態(高Ca2+濃 度)で あ る. 図1(b)と 同 じ よ う に ら せ ん を 巻 き 戻 し て 見 や す く し て あ る.低Ca2+濃 度(ア ポ 状 態)で は ア ク チ ン が ト ロ ポ ニ ン ・ア ー ム を ひ っ ぱ り,ト ロ ポ ニ ン 頭 部,ト ロ ポ ミ オ シ ン を シ フ ト さ せ,ト ロ ポ ニ ン,ト ロ ポ ミ オ シ ン は ら せ ん 対 称 性 か ら は 外 れ て お り,7個 の ア ク チ ン の 環 境 は 異 な る.高Ca2+濃 度 で は,7個 の ア ク チ ン の 環 境 は よ り 均 一 に な る が ,そ れ で も ミ オ シ ン のATPaseを 活 性 化 で き な い の で あ ろ う.図12(c)で,濃 青 で 色 づ け し た ミ オ シ ン 結 合 部 は 高Ca2+濃 度 で も ま だ 覆 わ れ て い る. ミ オ シ ン のATPaseを 活 性 化 す る に は,ト ロ ポ ミ オ シ ン は さ ら に5∼10A移 動 し て ア ク チ ン の 第4サ ブ ド メ イ ン の 疎 水 ポ ケ ッ ト に 結 合 し,図16の 右 図 のR状 態 に な る 必 要 が あ る の で は な い だ ろ う か.こ の よ う に,T*, T,Rの3状 態 が あ る と の 考 え は 酵 素 学 的 解 析 か ら も 提 唱 さ れ67,68),カ ル シ ウ ム 制 御 が ア ロ ス テ リ ッ ク 転 移 を 伴 う と の 提 案 も す で に さ れ て い る17,69).お わ り に
単 粒 子 解 析 に よ り “細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 全 構 造 が 解 け,ト ロ ポ ニ ン と ア ク チ ン の 関 係 を 立 体 構 造 と し て 初 め て 可 視 化 で き た.低Ca2+濃 度 で トロ ポ ニ ン ・ア ー ム が 出 現 し ア ク チ ンが こ れ を 引 き寄 せ る こ と は ま っ た く 予 想 外 で あ っ た.低Ca2+濃 度 で の トロ ポ ニ ン の オ リ ゴ マ ー 化70) の 背 景 が や っ と 見 え て き た.ト ロ ポ ニ ン ・ア ー ム が 突 出 す る と ア ク チ ン ・フ ィ ラ メ ン トの 上 で は ア ク チ ン に 結 合 し,ト ロ ポ ニ ン単 独 で は 互 い に 結 合 す る の で あ ろ う. 電 子 顕 微 鏡 法 の 最 近 の 進 歩 と し て,エ ネ ル ギ ー ・フ ィ ル タ ー の 導 入 が あ る.Ⅲ-3で 触 れ た が,ア ク チ ン-ミ オ 図15ア ク チ ン 変 異 体 のX線 結 晶 解 析15) 野生 型 ア ク チ ンの 密 度 マ ップ(a)とCPKモ デ ル(b).変 異 ア ク チ ン の 密度 マ ップ(c)とGPKモ デル(d).Ala230をTyrに 置換 す る と,野 生 型 で は 疎 水 ポ ケ ッ トの 蓋 を して い たLeu236の 側 鎖 が 移 動 して 疎 水 ポ ケ ッ トの 中 に あ る230番 目の ア ミ ノ 酸(青)が 溶 媒 に 露 出 す る(b, d).566 蛋 白質 核 酸 酵素Vol.47No.5(2002)
シ ン複 合 体 の よ うな 巨 大 蛋 白 質 集 合 体 で αヘ リ ッ ク ス
が 識 別 で き る よ う に な っ た.ク
ラ イ オ 電 子 顕 微 鏡 法 で は
蛋 白 質 自身 を観 察 す るが,構 成 原 子 のH,C,N,0は
電 子
を 強 く非 弾 性 散 乱 し,電 子 は エ ネ ル ギ ー を失 い う ま く結
像 さ れ な い.像 形 成 は 弾 性 散 乱 され た電 子 に よ るが,非
弾 性 散 乱 電 子 よ り少 な い.エ
ネ ル ギ ー ・フ ィ ル タ ー で 後
者 を 除 く とゼ ロ ・ロス 像 が 得 られ,像
質 と コ ン トラ ス ト
が 向上 す る(電 子 分 光 イ メ ー ジ ン グ:表 紙 写 真 参照).
巨 大 蛋 白 質 集 合 体 の グ ロ ー バ ル な構 造 の 中 の αヘ リ ッ
クス を電 子 顕 微 鏡 法 で 可 視 化 す れ ば,こ
れ を 目印 に し単
独 の 蛋 白質 のX線
結 晶 解 析 か らの 原 子 座 標 な ど の ロ ー
カ ル な 情 報 を 活 用 で き る.ア
ク チ ン-ミ オ シ ン複 合 体 な
どの 細 胞 生 物 学 的 に重 要 な メ ガ ドル ト ン級 の 巨 大 構 造 の
原 子 構 造 を 明 らか にす る 方 法 と して 発 展 させ た い.
これ らの研 究 は,東 京 大 学 理 学 部 物 理 学 科 若 林研 究 室 で 白 木原 康 雄,豊 島 近,富 岡 明 宏,鈴 木 理,徳 永 万 喜 洋,広 瀬 恵 子,秋 葉 俊 彦,松 元 隆 夫,茂 木 健 一 郎,安 永 卓 生,山 川 央,孟 宇,石 川 尚,真 柳 浩 太,光 岡 薫,橋 場 周 平,松 浦 能 行,成 田哲 博,村 上 健 次,佐 伯 喜 美子 らの 諸氏 が進 め た もの で あ り,須 藤 研 究室(東 京 大 学 総合 文 化)お よ び若 林 克 三研 究 室(大 阪 大 学 基礎 工 学)と の共 同研 究 で可 能 とな っ た もの で あ り感謝 し ます 。研 究 を励 ま し続 け て くだ さった 江橋 節 郎 先 生 に深 く感 謝 い た し ます.1)
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図16筋 収 縮 ・弛 緩 の 分 子 モ デ ル の 提 案12) 低Ca2+濃 度(ア ポ 状 態)で は トロ ポニ ン頭 部 が分 岐 し,現 わ れ た ト ロ ポ ニ ン ・アー ム が ア クチ ンのN末 端 領 域,C末 端 領 域 を 含 む 広 い範 囲 で3分 子 の ア ク チ ン と結 合 し,ア クチ ンは トロ ポ ニ ン頭 部 を ア クチ ンの 外 側 ドメ イ ンの 方 向 に引 き寄 ぜ る.こ れ に伴 っ て ト ロ ポ ニ ン 尾部 と トロ ポ ミオ シ ンのc末 端 側 の 約130Aの 部 分 も シ フ トす る が,ト ロ ポ ミ オ シ ン のN末 端 側 は あ ま り シ フ トしな い (T*状 態,左 図).高Ca2+濃 度 で は,卜 ロ ポニ ン ・ア ー ム は トロ ポ ニ ン頭 部 の本 体 に ドック し(Ca2+を 結 合 した トロ ポニ ンCのN末 端 ドメ イ ンの 疎 水 ポ ケ ッ トが 開 く こと の結 果 で あ ろ う),も は や ア ク チ ンは トロ ポ ミ オ シ ン を 引 き寄 せ ず,ト ロ ポ ミ オ シ ン,ト ロ ポ ニ ンは ア ク チ ンの 内側 ドメイ ン に結 合 して い る,ミ オ シ ン はア ク チ ンの 外 側 ドメ イ ン に弱 く結 合 で き る が,強 い 結 合 へ 移 行 でき ず ATPaseは 活性 化 さ れ な い(T状 態,中 央 図),活 性 化 に は トロ ポ ミオ シ ンが さ らに 移 動 し,ア クチ ンの 第4サ プ ドメ イ ンの 疎 水 ボ ケ ッ トと結 合 す る必 要 が あ る(R状 態,右 図),T状 態 とR状 態 で は,ト ロ ポ ニ ン はCa2+を 結 合 して お り(ホ ロ 状 態),T〓Rは ア ロ ステ リ ック 平 衡 に あ り,ア ロ ス テ リ ッ ク 平 衡 定 数L([T]/[R]) ＞10で あ る.ミ オ シ ン濃 度 が増 す と平 衡 はR状 態 ヘ シ フ トし収 縮 が 起 こ る.567
蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.47No.5(2002)
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71)成 田 哲 博 ・安 永 卓 生 ・石 川 尚 ・真 柳 浩 太 ・若 林 健 之:生 物 物 理,41,S57(2001) 若 林 健 之 略 歴:1965年 東 京 大 学 医 学 部 卒 業,同 大 学 院 修 了,MRC 分 子 生 物 学 研 究 所 員,東 京 大 学 理 学 部 助 手 を 経 て,1988年 よ り 同教 授.2001年 定 年 後,帝 京 大 学 理 工 学 部 教 授.研 究 テ ー マ:筋 収 縮 ・弛 緩 の 分 子 メ 力 ニ ズ ム,新 しい構 造 研 究 法 の 開 発.関 心 事 ・抱 負:分 子 集 合 体 を 原 子 レベ ル で 解 析 す る 方 法 を開 発 し生 命 現 象 を 構造 に 基 づ いて 解 明 す る こ と.
表 紙 解 説
筋 肉 の “細 い フ ィ ラ メ ン ト”の 電 子 分 光 的 ク ラ イ オ 電 子 顕 微 鏡 像(ESI:Electron Spectroscopic Image,ゼロ ・ロ ス 像)71) ア ク チ ン-ト ロ ポ ミ オ シ ン-ト ロ ポ ニ ン 複 合 体 の 凍 結 水 和 標 本(無 染 色)の ク ラ イ オ 電 子 顕 微 鏡 像(低Ca2+濃 度, 蛋 白 質 は 黒).蛋 白 質 を 構 成 す る 軽 原 子(H,C,N,0)は 電 子 の 大 半 を 非 弾 性 散 乱 す る,像 質 向 上 の た め エ ネ ル ギ ー ・フ ィ ル タ で こ の 電 子 を 除 い た ゼ ロ ・ロ ス 像 . 挿 入 写 真:高Ca2+濃 度 で の 異 な る 角 度 の ゼ ロ ・ロ ス 像 の 平 均 像(蛋 白 質 は 白,長 さ770A),ア ク チ ン 単 量 体 を 識 別 で き る.こ れ ら の 像 か ら3次 元 像 を 再 構 成 す れ ば, 複 合 体 の αヘ リ ッ ク ス が 可 視 化 で き,構 成 蛋 白 質 の 原 子 構 造 情 報 を 統 合 す る と 複 合 体 の 原 子 モ デ ル を 得 ら れ る で あ ろ う.
