Elucidation of Molecular Mechanism of Hepatitis B Virus Infection and Drug Discovery Targeting Bile Acid Transporter, NTCP/SLC10A1

(1)

ȯ Ƶ ʌ ` | U r Z NTCP/SLC10A1 > Ʀ ǲ $ B Ċ Ȭ Ǔ D C ~ U ( ŝ Ɯ ʛ Ħ Ⱦ ʗ ǰ $ ŝ Ɯ ƪ Ƥ ( ɐ Ƈ

Elucidation of Molecular Mechanism of Hepatitis B Virus Infection and Drug Discovery Targeting Bile Acid Transporter, NTCP/SLC10A1

ķ š 27 ĸ Ŀ ¿ Ĝ

ǅ ʏ ʱ ʹ Fukano, Kentoʺ

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(2)

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ʛ Ħ Þ ð ǘ ( ų ș $ ( ¨ Ǥ ƪ Ľ ( ɐ ƚ ... 13 ǽ ȉ Ƿ ǲ ... 13 Ȏ Ȓ S L U r } ɛ ĭ § ' 7 : HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ ƾ Ř ( ɗ ® ... 14 Ȏ Ȓ S L U r } ɛ ĭ § NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƪ ȱ '

: ņ ʪ ... 16 Ȏ Ȓ S L U r } ɛ ĭ § ( NTCP , ( Ȟ ð ƥ ŀ ( ɐ ƚ ... 19 ȩ Ī ... 22

Ȏ ȋ NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƪ ȱ ' ņ ʪ & HBV Ǚ ǫ ǲ ¯ ¿ ʛ Ħ p m \ a ( ų ș ... 24 ǽ ȉ Ƿ ǲ ... 24 Ȏ Ȓ RaPID S U ^ u > Í Ǥ HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a (

U L } c M ... 25 Ȏ Ȓ Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ' 7 : HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ ƾ Ř ( ɗ ® ... 29 Ȏ Ȓ Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ( HBV õ Ǻ ʁ ȇ , ( ņ ʪ ... 31 Ȏ Ā Ȓ Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ' 7 : ( Ȭ Ǔ D C ~ U ŝ Ɯ $ ȯ Ƶ ʌ ë 9

ɳ 1 ƪ ȱ , ( ņ ʪ ... 33

Ȏ Ȓ Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ( Ļ ȓ & HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ ƾ Ř ( ɗ ® ... 36

(3)

ȩ Ī ... 38

Ȏ ȋ HBV Â Ĉ Þ ʛ Ħ Þ ð ǘ ( ų ș ... 40

ǽ ȉ Ƿ ǲ ... 40

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Ȏ Ȓ Troglitazone ƍ : PPARγ ƾ Ř ( HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ ƾ Ř , ( ʙ ... 45

Ȏ Ȓ Troglitazone ' 7 : HBV Â Ĉ Þ ʛ Ħ ... 47

ȩ Ī ... 51

Ȏ Ā ȋ Troglitazone ( ¨ Ǥ ƪ Ľ ɐ ƚ ' č ! HBV Â Ĉ Þ ƪ Ƥ ( ɐ Ƈ ... 53

ǽ ȉ Ƿ ǲ ... 53

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Ȏ Ȓ HBV Â Ĉ Þ ʁ ȇ ' : NTCP Ĕ ʐ § Þ ( ʙ ... 58

ȩ Ī ... 61

Ȟ ɡ ... 62

Ĥ ʵ ʭ ... 64

Ł Ǥ Ɓ ǜ ... 73

ɢ ɲ ... 77

(4)

Ǫ ɜ ɍ

aa : amino acids

cccDNA : covalently closed circular deoxyribonucleic acid CsA : cyclosporin A

DAPI : 4’,6-diamidino-2-phenylindole DMSO : dimethyl sulfoxide

FBS : fetal bovine serum

FDA : food and drug administration GEq : genome equivalent

HA : hemagglutinin

HBc : hepatitis B virus core protein HBs : hepatitis B virus surface protein HBV : hepatitis B virus

HBx : hepatitis B virus x protein HCV : hepatitis C virus

HDV : hepatitis D virus His : histidine

IFN : interferon

LHBs : large hepatitis B virus surface protein MHBs : middle hepatitis B virus surface protein MTT : methylthiazole tetrazolium

NMDG : N-methyl-D-glucamin

NTCP : sodium taurocholate cotransporting polypeptide

PBS : phosphate buffered saline

(5)

PEG : polyethylene glycol pgRNA : pregenomic RNA

PLA : proximity ligation assay

PPAR : peroxisome proliferator-activated receptor PPREs : PPAR response elements

PVDF : polyvinylidene difluoride

RaPID : random peptide integrated discovery

RT-PCR : reverse transcription-polymerase chain reaction RXR : retinoid X receptor

SHBs : small hepatitis B virus surface protein SLC : solute carrier

TAMRA : 6-carboxytetramethylrhodamine TBS : tris-buffered saline

TCA : taurocholic acid

(6)

Ľɡ

(7)

B Ċ Ȭ Ǔ D C ~ Uʹ HBVʺ) À Ǩ # 7 2 » 6 á ƅ ƒ ' ȗ 100

( K x } A ě Ĉ : $ ŵ ģ ; " 9 ( ŭ ȟ ŝ Ɯ ) Ş Ř Ȭ Ǔ Ȭ ǿ Ē Ȭ Ț Ȱ ? & % Ş Ř Ȭ ǭ Ś ( ǰ Ǯ } U L > ʷ 3 :

^{1 ,2 )}

HBV ' ī : ǟ ɂ ( ũ D C ~ U Ⱦ $ " interferon- α ʹ IFNα ʺ è + p M Þ IFNα &

% ( IFN ʲ 5 lamivudine adefovir entecavir tenofovir $ ƞ ʌ A b M Ċ ɹ ɰ Ä ʋ Ș ʛ Ħ Ò Ǥ 8 ; " :

^{3 ,4 )}

IFN ) Ĩ ( ¾ Ǭ ɩ ƾ Þ ' 7 9 HBV ʐ > ǉ į : $ $ 4 ' Ȭ Ț Ȱ # ( HBV ɉ Ɉ 4 Ǹ Ŵ ŧ Î : ƞ ʌ A b M ) ɹ ɰ Ä ʁ ȇ ' Ŕ ʮ & HBV r } v | X ' Ȟ ð :

$ ' 7 9 ( ɹ ɰ Ä ƾ Ř > Ń ʛ Ħ : & 8 Ó ¨ Ǥ 5 Ⱦ Ò ȫ Ř D C ~ U ( Ç ǟ $ ý ʰ ' Ø ; 8 ( ƻ ǯ Ⱦ ) Ŀ ŝ Ɯ Ț Ȱ 8 HBV > Ġ À ' Ų ʞ : $ ) ʨ ĵ ' ă ʥ # : ( 3 ; 0 # $ ) ǫ & ¨ Ǥ ƪ Ľ > ƍ : ƻ ǯ Ⱦ ( ʗ ǰ ƶ 3 8 ; " : HBV ) Ȭ Ț Ȱ Ǚ ǫ ǲ ' ŝ Ɯ Ț Ȱ Â # ( D C ~ U ɉ ɈĐ ư > ȝ " Ț Ȱ ē , ę ĝ D C ~ U > Ž Ç : ʹ Fig. 1ʺ

^{5 ,6 )}

HBV ) 0 Ț Ȱ Ʌ ʩ ( n h

| Ǿ ʌ m ^ H M } I > " ¦ Ɏ ú Ř ' õ Ǻ Ł ȟ HBV F

o m ( large HBV surface antigen ʹ LHBs ʺ $ ¯ ¿ ì ħ § sodium taurocholate cotransporting polypeptide / solute carrier family 10 member 1 ʹ NTCP/SLC10A1 ʺ ( Ǚ ǫ ǲ Ȟ ð ' 7 9 ¯ ¿ ʗ Ę ; : F a Q C `

S U ě ǲ ' Ț Ȱ Â ' Â Ĉ Þ ŋ Į Ȱ ȵ D C ~ U F o m ȵ

$ ɀ ð d L H K x m S a Ț Ȱ ɪ ' Ž Ç ; : ƞ Â ' Ȇ ɂ ŋ HBV N f u # : Ġ À ʎ ʔ DNA ( relaxed circular DNAʹ rcDNAʺ ) DNA

² ŏ > ì Ġ À ʎ ʔ DNA Ƥ ɼ ( covalently closed circular DNA ʹ cccDNAʺ

$ & 9 D C ~ U ɉ Ɉ ( } R g $ " ğ ģ ǲ ' Ƞ ŭ ; : Ĩ ɰ Ä

(8)

ƪ Ƥ > Ǥ " cccDNA 8 ʖ ( ǫ & : ƀ Ȉ ( D C ~ U RNA ð š ; : ; 8 ( ȗ 3.5 kb ( RNA ) pregenomic RNA ʹ pgRNAʺ $ ø *

; Ƌ ț ǲ ' D C ~ U N f u $ & 9 ɉ Ɉ ' œ ǲ & Ň Õ > ƛ 0 pgRNA 8 Ȩ ɕ ; HBc ) Ĕ ʐ § Þ " K x m S a $ & 9 ñ pgRNA 8 Ȩ ɕ ; r } v | X $ pgRNA ȷ ɯ ; ' ë 9 ɳ 0 ; d L H K x m S a $ & : d L H K x m S a Â # r } v | X ) pgRNA

> ʓ Ċ ' ǹ ɇ ʔ DNA > ɹ ɰ Ä " ð š Ł ȟ RNaseH ƾ Ř ' 7 9 pgRNA ) ǃ Þ 8 ' 4 ƃ ( ǹ ɇ ʔ DNA > ð š " D C ~ U N f u rcDNA > ð š : d L H K x m S a ) Ã + ƞ Â ' ţ 9 cccDNA ( } R

g ʐ ( Ƞ ŭ ' Í Ǥ ; : F o m > ǝ ō " Ț Ȱ ē , $ Ž Ç ; : ( HBV Ǣ ƾ ǡ ( È ę ƪ Ƥ > ɐ Ƈ : $ ) D C ~ U Đ ư ( v I c V u > Ǡ ɐ : # & ũ D C ~ U Ⱦ ʗ ǰ ( Ö Ⱦ Ʀ ǲ > ɋ Ç 3 ' 4 ʨ ĵ ' ʎ Ɋ # :

ɵ ĸ ( HBV ǽ ȉ ʯ ċ ' : l L U ~ ) 2012 ĸ ' Yan 8 ' 7 9 Ď ö ; HBV ŝ Ɯ ì ħ § ( ǰ ɋ # : ; 0 # HBV Ȭ Ț Ȱ , ¯

¿ : ʠ ( Ĩ ì ħ § ) Ƈ # ; Ȭ Ț Ȱ č ľ ȵ º Ʌ ʩ ' Ǚ ǫ ǲ ' ǰ ǟ : ȯ Ƶ ʌ ` | U r Z NTCP/SLC10A1 # : $ > Ď ö

7 )

NTCP ) 4 $ 4 $ SLC10 k @ t } ` | U r Z ' Ĳ :

Ɂ 8 Ȭ Ț Ȱ Â , ȯ Ƶ ʌ 1 È ę > b ` } D u 2 È ę $ Á ɱ ɷ : ` |

U r Z # 9 ȯ Ƶ ʌ ( ȴ Ȭ Ő ǡ ' Ŕ ʮ ( Ň Õ > ƛ

^{8 )}

NTCP )

349 A t f ʌ 8 & : ȗ 56 kDa ( 7 9 ā ȵ ɦ ɻ Ċ ȵ Z h L ɪ # : $

ŵ ģ ; " : Ĥ ʠ ( Ȋ § Ƥ ɼ ) Ƒ ɐ ; " 8 ( È ę Â ƪ

ȱ ʯ ċ ( ə Ț ) Ƈ 8 # & ( NTCP HBV F o m Z h L

ɪ ( preS1 ʯ ċ $ ǹ ¨ Ǥ HBV ( Ț Ȱ Â ¯ ¿ ' Ŕ Ɋ # : $ Ȁ

(9)

;

NTCP ŝ Ɯ ì ħ § $ " Ď ö ; " Ɨ NTCP > Ʀ ǲ $ : HBV ¯

¿ ʛ Ħ Þ ð ǘ ( ų ș ǵ ? ' ɂ = ; " NTCP $ HBV ( Ȟ ð ' ) LHBs Â ( preS1 ʯ ċ Ŕ ʮ # : ( preS1 ( 2 48 A t f ʌ ʯ ċ > Ƨ · Ȳ ɪ p m \ a myrcludex-B > ) 3 Ì ( Ⱦ Û ' ī " FDA # Ƅ ' ť ɚ ; " : Þ ð ǘ ( cyclosporin A 5 irbesartan ezetimibe ritonavir propranolol & % ) NTCP ' Ǹ Ŵ ǹ ¨ Ǥ : $ # Ń × & HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ Û ƛ > Ȁ

^{9 - 1 7 )}

; 0 # ' Ď ö ; " : HBV ¯ ¿ ʛ Ħ Þ ð ǘ ( . / À " ) HBV ( ¯ ¿ # & NTCP ƒ Ɨ ( ƪ ȱ # : Ȭ Ț Ȱ Â , ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 4 ʛ Ħ : $ Ƈ 8 ' & NTCP ě Ř ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 > ʛ Ħ : $ ' 7 " Ó ¨ Ǥ ǰ ǟ : % ) Ƒ Ƈ &

ǔ 4 Ĕ NTCP ʇ ¢ ę f ] L A D ` s D U # ) Ɂ ȯ Ƶ ʌ ʐ ƀ Ǳ ´ ' Ɔ : $ $ 4 ' § ʎ ǉ į : ³ § ɚ 3 8 ;

^{1 8 )}

0 Ì ( Ď ö # ) ȯ ( ǭ Ś 5 ĺ į Ə ( Ȭ ƪ ȱ ¦ C U } S M b ~ Ȳ ɪ ɢ Ē Þ &

% ɏ Ī ; " :

^{1 9 )}

ƃ # myrcludex-B ( ȶ ļ ɘ ʵ # ) į & $ 4 Ǽ Ə Ũ # ) ǅ Ð & Ó ¨ Ǥ > ɚ 3 & 4 ( ( ¹ ĵ q | ^ B A , ( Ũ

# Ɂ ȯ Ƶ ʌ ȗ Ǳ ´ Ɔ $ Ď ö 4 :

^{2 0 )}

( 7 ' NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ʛ Ħ ' 7 : Ó ¨ Ǥ ( î ȱ Ř Ġ À ' ) ó ģ # &

$ 8 ũ HBV Ⱦ $ " ) NTCP ` | U r Z ƾ Ř > ʛ Ħ ' HBV ¯ ¿ > ʆ Ū ǲ ' ʛ Ħ # : Þ ð ǘ Ǝ 0 ; " :

ƒ ǽ ȉ # ) Ʒ Ǥ ; : Ȭ Ț Ȱ Č ʴ Ȗ è + Ǜ ȷ ( in vitro U L } c

M Ȗ > Ǥ NTCP > Ʀ ǲ $ & 8 ( Ǣ Ǡ ƪ ȱ ' ) ņ ʪ ' HBV

ŝ Ɯ > ʆ Ū ǲ ' ʛ Ħ # : HBV õ Ǻ ʛ Ħ Þ ð ǘ ( ų ș $ ( ¨ Ǥ ƪ Ľ

( ɐ ƚ > ɂ ʹ Ȏ ȋ Ȏ ȋ ʺ

(10)

0 Ì ( A m \ $ " ; 0 # Ʀ ǲ $ ; " HBV ( NTCP , ( õ Ǻ ʁ ȇ # ) & HBV ( Â Ĉ Þ ' Ǻ Ƿ Â Ĉ Þ ʛ Ħ Þ ð ǘ ( ų ș

> ɂ ʹ Ȏ ȋ ʺ 8 ' ( ¨ Ǥ ƪ Ľ > ɐ ƚ : $ ' 7 9 ə Ț &

v I c V u Ƒ ɐ Ƈ ; " & HBV Â Ĉ Þ È ę ƪ Ƥ ( ɐ ƚ > ɘ 1

ʹ Ȏ Ā ȋ ʺ

(11)

Figure 1. HBV Ǣ ƾ ǡ

HBV ) Ț Ȱ ȵ ( NTCP ' Ȟ ð " õ Ǻ ŋ Ț Ȱ Â , Â Ĉ Þ ƞ Ȇ ɂ

> ȝ " cccDNA > Ņ š : cccDNA 8 ) 4 Ȉ ʲ ( ʖ ( ǫ & : D C ~ U Ř RNA ɰ Ä ; ï RNA 8 ; ; D C ~ U Ř Z h L ɪ Ȩ ɕ ; : Core $ Pol ) 3.5 kb ( RNAʹ pgRNAʺ$ ¡ ð d L H K x m S a > Ņ š : pgRNA > ɹ ɰ Ä " cDNA > ǣ Ǣ 8 ' pgRNA ǃ Þ ; ŋ ; > ʓ Ċ $ " DNA ð š ' 7 9 ǹ ɇ ʔ DNA ð š ; : d L H K x m S a ) Ț Ȱ Â ɱ ɷ ( ʁ ȇ # F o m > ǝ ō Ț Ȱ ē , $ Ž Ç ; : 0 d L H K x m S a ( ʉ ) Ã + ƞ Â , Ȇ ɂ :

cccDNA rcDNA

Core Pol SHBs

MHBs LHBs attachment

entry

nuclear import

cccDNA formation

transcription

0.7 kb 2.1 kb 2.4 kb 3.5 kb

pgRNA translation

reverse transcription DNA

synthesis release

trafﬁcking

HBx

capsid formation cytoplasm

nucleus

NTCP (SLC10A1)

translation

(12)

ƒɡ

(13)

Ȏ ȋ S L U r } ɛ ĭ § > Ǥ B Ċ Ȭ Ǔ D C ~ U ʹ HBVʺ õ Ǻ ʛ Ħ Þ ð ǘ ( ų ș $ ( ¨ Ǥ ƪ Ľ ( ɐ ƚ

ǽ ȉ Ƿ ǲ

HBV ( ŝ Ɯ ì ħ § Ȭ Ǚ ǫ ǲ ' ǰ ǟ " : NTCP/SLC10A1 # 9 LHBs ( preS1 ʯ ċ Ȟ ð : $ # Ȭ Ț Ȱ Â , ( ¯ ¿ ʗ Ę ; : $ ɵ ĸ Ď ö ;

^{7 )}

( NTCP ) HBV ( ¯ ¿ ʁ ȇ > ʛ Ħ : 3 ( Ö Ⱦ Ʀ ǲ ' & 9 ō : $ ȩ 8 ; NTCP > Ʀ ǲ $ : HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ Þ ð ǘ

; 0 # ' ƥ Ď ö ; "

^{9 - 1 7 )}

; 8 ( . / À " ) HBV ( ¯ ¿ # & NTCP ƒ Ɨ ƍ : Ȭ Ț Ȱ Â , ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƪ ȱ 4 ʛ Ħ " 0 $ Ƈ 8 $ & NTCP ʇ ¢ ę f ] L A D ` s D U ( ɐ ƚ # ) Ɂ ȯ Ƶ ʌ ʐ ƀ Ǳ ´ ' Ɔ : $ $ 4 ' § ʎ ǉ į : ³ § ɚ 3 8 ; : $ Ď ö ;

^{1 8 )}

. NTCP ( ʇ ¢ ǲ Ĕ Ċ ' 7 9 ( ƪ ȱ

> ƫ Ź Ś Ȫ ' " ) Ɂ ȯ Ƶ ʌ Ǒ Ŀ ( Ɔ ǰ Ȯ ʡ Ħ 5 ʀ Ü ǰ ʃ ʡ Ħ & % ɚ 3 8 ; : $ 4 Ď ö ; " :

^{2 1 )}

8 ' Ì ( Ď ö # ) ȯ ( ǭ Ś 5 ĺ į Ə ( Ȭ ƪ ȱ ¦ C U } S M b ~ Ȳ ɪ ɢ Ē Þ & % ɏ Ī ; " 9

^{1 9 )}

NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ʛ Ħ ) ȯ Ƶ ʌ ɢ Ē Þ ' 7 : Ó ¨ Ǥ ( ǰ ǟ > Ŭ î ȱ Ř > ƍ " : # ƒ ǽ ȉ # ) NTCP > Ʀ ǲ $ ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƪ ȱ ' ) ņ ʪ ' HBV ŝ Ɯ > Ǚ ǫ ǲ ' ʛ Ħ # : HBV õ Ǻ ʛ Ħ Þ ð ǘ > ų ș 8 ' ( ¨ Ǥ ƪ Ľ ( ɐ ƚ

> ɂ

(14)

Ȏ Ȓ S L U r } ɛ ĭ § ' 7 : HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ ƾ Ř ( ɗ ®

HBV ŝ Ɯ > ʛ Ħ : Þ ð ǘ > ų ș : 3 ' HBV ( ¯ ¿ ʛ Ħ Ò $

" Ƅ ' ǻ 8 ; : S L U r } Aʹ CsAʺ ( ɛ ĭ § ʹ Scynexis Ȃ $ ( Á ñ ǽ ȉ ʺ ' Ǻ Ƿ ( ũ HBV ƾ Ř > ɠ - HBV ŝ Ɯ ɔ ħ Ř Ț Ȱ HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' Þ ð ǘ 8 µ M ě Ĉ # HBV > 16 ƈ ʘ ŝ Ɯ ŝ Ɯ 13 ƅ ŋ ( Č ʴ ǈ HBs ũ å > ELISA Ƽ # Ț Ȱ Â HBc ũ å > ¾ Ǭ Ɯ Ⱥ Ƽ # Ƣ Ç : $ ' 7 9 HBV ŝ Ɯ > ɗ ®

^{2 2 )}

8 ' Ț Ȱ Ǣ ě Ǟ

> MTT A ] W C # ǌ ģ HBV ŝ Ɯ Ĥ ʵ ' " ; 0 # HBV ( ¯

¿ > ʛ Ħ : $ Ƅ ' ǻ 8 ; : HBV F o m Z h L ɪ ( preS1 ʯ ċ 2-48 A t f ʌ 8 & : p m \ a ʹ preS1 peptideʺ > r T ^ B l O `

~ ' Ǥ 11 Ȉ ( CsA ɛ ĭ § ( SCY806SCY446SCY450 SCY995 ( 4 Ȉ ) Ț Ȱ ƴ Ř > Ȁ $ & HBs è + HBc ũ å > ƍ Ŝ ' ǉ į ʹ Fig. 2A-Cʺ

ñ ƥ ' i ` Ë Ȭ Ț Ȱ > Ǥ " HBV ŝ Ɯ Ĥ ʵ > ɂ Č ʴ ǈ ( HBe

ũ å > ģ ʐ : $ # CsA ɛ ĭ § 4 Ȉ ( ũ HBV ƾ Ř > ɗ ® 4 Ȉ (

CsA ɛ ĭ § $ 4 ' Ǥ ʐ ě ǲ ' HBV ŝ Ɯ > ¦ ( IC

5 0

) 0.5 2.0

µM # ʹ Fig. 2D ʺ

(15)

Figure 2. CsA ɛ ĭ § ( ũ HBV ƾ Ř

ʹ A-Cʺ HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' Þ ð ǘ ě Ĉ ʹ DMSO 0.16% preS1 peptide 100 nM CsA 0 ) ( ɛ ĭ § 8 µMʺ # HBV > 16 ƈ ʘ ŝ Ɯ Ƒ ŝ Ɯ ( HBV è + Þ ð ǘ > ƽ ǀ Ț Ȱ > 8 ' 12 ƅ ʘ Č ʴ ŋ Č ʴ ǈ

( HBs ũ å ʹ Aʺ Ț Ȱ Â HBc ũ å ʹ C ʺ Ț Ȱ Ǣ ě Ǟ ʹ Bʺ > ǌ ģ ʹ Caʺ ' " ɬ Ⱥ S M b ~ ) HBc ũ å ʦ Ⱥ S M b ~ ) ƞ > Ȁ HBc ũ å ( S M b ~ ʹCaʺ ) Lumina Vision image analysis software > Ǥ

" ģ ʐ ʹ Cbʺ ʹ DʺCsASCY806SCY446SCY450SCY995 ( Þ Ĝ Ƥ ɼ ŀ è + ũ HBV ƾ Ř ( Ǥ ʐ é ŕ Ɗ Ȣ Ë i ` Ȭ Ț Ȱ ' Þ ð ǘ ʹ 0.25 0.5 12 4 8 µMʺě Ĉ #ʹ A-Cʺñ ƥ ( HBV ŝ Ɯ Ĥ ʵ > ɂ Č ʴ ǈ ( HBe ũ å > ģ ʐ ũ HBV ƾ Ř ( IC

5 0

> ȑ Ç ʹ Mean ± SD

*P < 0.05 **P < 0.01ʺ

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

A

0 2 4 6 8

HBs

C

0 20 40 60 80 100 120

HBc

control DMSO preS1 peptide CsA SCY806 SCY582 SCY651 SCY660 SCY446 SCY198 SCY450 SCY453 SCY995 SCY506 SCY640

B

cell viability

OD450 (fold)

control DMSO preS1 peptide CsA SCY806 SCY582 SCY651 SCY660 SCY446 SCY198 SCY450 SCY453 SCY995 SCY506 SCY640

HBs (IU/ml) control DMSO preS1 peptide CsA SCY806 SCY582 SCY651 SCY660 SCY446 SCY198 SCY450 SCY453 SCY995 SCY506 SCY640

HBc area (% of control)

**

*

**

** **

**

****** ** ** **

preS1 peptide CsA

control

SCY446 SCY450

SCY806

SCY995

red blue

HBc nucleus

(a) (b)

D

0 10 20 30

0 2 4 6 8

IC₅₀: 1.27 ± 0.43 µM

concentration (µM)

HBeS/CO

1.05 ± 0.33 µM

0 5 10 15 20

0 2 4 6 8

0.54 ± 0.13 µM

0 5 10 15 20

0 2 4 6 8

0.91 ± 0.19 µM

0 5 10 15 20

0 2 4 6 8

1.97 ± 0.04 µM

0 5 10 15 20

0 2 4 6 8

concentration (µM) concentration (µM) concentration (µM) concentration (µM)

CsA SCY806 SCY446 SCY450 SCY995

N N O

O H

N

N O

HN

HN O N

O O

N O

O N N O

O HN

OH O

N N O

O H

N

N O

HN

HN O N

O O

N O

O N N O

O HN

OH OH

O O

N N O

O H

N

N O

HN

HN O N

O O

N O

O N N O

O HN

OH

O R

O

N N O

O H

N

N O

HN

HN O N

O O

N O

O N N O HN O

OH OH

O

O O N

N O

O H

N

N O

HN

HN O N

O O

N O

O N N O

O HN

OH

O R

S

NMe2 O

(16)

Ȏ Ȓ S L U r } ɛ ĭ § NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƪ ȱ ' : ņ ʪ

CsA ɛ ĭ § ƍ : HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ ƾ Ř HBV Ǣ ƾ ǡ ( % ( U ^ ] m >

ʛ Ħ : > ɐ ƚ CsA ) preS1 $ NTCP ( õ Ǻ > ʛ Ħ : $ ' 7 9 HBV ( ¯ ¿ > ŧ Î : $ ǻ 8 ; " : 3 CsA ɛ ĭ § HBV (

¯ ¿ ʁ ȇ , : ņ ʪ > preS1 Ȟ ð A ] W C ' " Ƣ ɒ PreS1 peptide ' TAMRA Ʀ ɣ ȿ ½ p m \ a ʹ preS1 m l ʺ > Þ ð ǘ 40 µ M ě Ĉ

# HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' Ǉ Ø Ț Ȱ ' õ Ǻ preS1 m l ' 7 : S M b ~ > Ƣ Ç Ń HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ ƾ Ř > ƍ : SCY806 SCY446 SCY450 SCY995 ( Æ Ǡ ' 7 " preS1 m l ( Ț Ȱ , ( õ Ǻ > ŧ Î ʹ Fig. 3Aʺ ƃ HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ ƾ Ř > ŭ & SCY582 ) ( õ Ǻ ' ņ ʪ > & ( Ȟ ƛ 8 CsA è + ( ɛ ĭ § ) preS1 >

HBV ( Ț Ȱ , ( õ Ǻ > ʛ Ħ : $ Ȁ ü ;

CsA > ) 3 $ myrcludex-B ezetimibe irbesartan ritonavir vanitaracin A ȯ Ƶ ʌ & % NTCP > Ʀ ǲ $ ƥ & HBV ¯ ¿ ʛ Ħ Ò ; 0 # ' Ď ö ; " : ; 8 ( À " ) HBV ( ¯ ¿ # & NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƪ ȱ 4 ʛ Ħ : $ ǻ 8 ; " : CsA ) Ȭ Ț Ȱ Ʌ ʩ ( NTCP ' Ǹ Ŵ ǹ ¨ Ǥ : $ ' 7 9 ( ʛ Ħ ƾ Ř > Ȁ $ Ƅ ' Ƈ 8 ' & " : 3 CsA ɛ ĭ § 4 ñ ƥ ( ƪ Ľ > ƍ " : $ ŵ ǌ # : # CsA è + CsA ɛ ĭ § NTCP ( ` | U r Z ƾ Ř ' ņ ʪ : % > ɐ ƚ Na

⁺

ě Ĉʨ ě Ĉ ( g ] k @ 0 ) Na

⁺

> ô 2 Þ ð ǘ ʹ 6.25 12.5 25 µ Mʺ ' [

³

H]-taurocholic acidʹ TCAʺ 0.1 µM

> ǆ ð HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' Æ Ǡ Ț Ȱ Â ' ë 9 ɳ 0 ; [

³

H]

(17)

ʐ > ǌ ģ : $ # NTCP ( ` | U r Z ƾ Ř > ɗ ® ; 0

# ( Ď ö ɻ 9 CsA ) Ǥ ʐ ě ǲ ' Na

⁺

ě ǲ & TCA ( ë 9 ɳ 1 > ŧ Î

ʹ Fig. 3Bʺ CsA ɛ ĭ § ( # HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ ƾ Ř Ƌ 4 Ń SCY446 )

CsA ñ ƥ ' Ǥ ʐ ě ǲ ' TCA ( ë 9 ɳ 1 > ʛ Ħ ƃ ȹ ÷ ǅ $ '

SCY995 # ) ʷ Ǒ Ŀ ' " = ' TCA ë 9 ɳ 1 > ŧ Î : î ȱ Ř )

: į & $ 4 HBV ( ŝ Ɯ ʛ Ħ Û ƛ > à È ' Ȁ Ǒ Ŀ ' " 4 ƍ

Ŝ & ʛ Ħ ) ɚ 3 8 ; &

(18)

Figure 3. CsA ɛ ĭ § ( HBV õ Ǻ ʛ Ħ ƾ Ř $ NTCP ` | U r Z ƾ Ř , ( ņ ʪ

ʹ AaʺpreS1 Ȟ ð A ] W C ( Ƨ ŀ Ą ʹ AbcʺHBV õ Ǻ ʁ ȇ , ( Þ ð ǘ ( ņ ʪ > preS1 m l > Ǥ " ɗ ® HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' preS1 m l 40 nM 0 ) Þ ð ǘ 40 µ M > Æ Ǡ " ɂ ʹ Abʺ ' "

ɬ Ⱥ S M b ~ ) Ț Ȱ ' õ Ǻ preS1 m l > ʦ Ⱥ S M b ~ ) ƞ > Ȁ preS1 m l ' 7 : S M b ~ʹ Abʺ) Dynamic Cell Count ʹ KEYENCEʺ

> Ǥ " ģ ʐ ʹ Acʺ ʹ BʺNa

⁺

ě Ĉʨ ě Ĉ ( g ] k @ 0 ) Þ ð ǘ ʹ 6.25 12.5 25 µ Mʺ > [

³

H]-taurocholic acidʹ TCAʺ 0.1 µ M $ ǆ ð HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' 5 È ʘ Æ Ǡ Ț Ȱ Â ' ë 9 ɳ 0 ; [

³

H]ʐ >

ǌ ģ ʹ Mean ± SD *P < 0.05 **P < 0.01ʺ

preS1-cell binding

red blue

preS1 probe nucleus

control preS1 peptide CsA

SCY806 SCY446 SCY450

SCY995 SCY582

A

0 25 50 75 100 125

control preS1 peptide CsA SCY806 SCY446 SCY450 SCY995 SCY582

ﬂuorescence area (% of control)

******

******

B

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

NTCP transporter activity

TCA uptake (fold)

CsA SCY446SCY995 Na⁺:– + + + + + + + + + +

control

*

** * ***

* LHBs

NTCP

preS1-probe

peptides

NTCP

preS1 preS2 S

389 aa LHBs

108 164 myr

2 48

myr

TAMRA 2

preS1-probe

(a) (b)

(c)

(19)

Ȏ Ȓ S L U r } ɛ ĭ § ( NTCP , ( Ȟ ð ƥ ŀ ( ɐ ƚ

NTCP > Ʀ ǲ $ : CsA è + SCY446 $ SCY995 $ ( ʘ # ` | U r Z ƾ Ř ' : ņ ʪ ǫ & : Ɋ Ă $ " NTCP , ( Ȟ ð ƥ ŀ ( ʄ ȩ 8 ; : NTCP ( Ȋ § Ƥ ɼ ) Ƒ ɐ ; " 8 ( ʊ Ê ś Ď 5 Ē ǫ ɐ ƚ ( 1 # ) Þ ð ǘ $ NTCP ( ǹ ¨ Ǥ > ə ɐ ƚ : $ ) ă ʥ # : # ƒ ǽ ȉ # ) 0 Þ ð ǘ NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ʉ ¥ > Ʀ ǲ $ : % > [

³

H]-TCA > Ǥ I C e ^ B L U A ] W C

> ɂ ō 8 ; t I F } Uv ^ m ] ` > ɐ ƚ " Ƣ ɒ ʹ Fig.

3Aaʺ CsA 0 ) SCY446ʹ 0 5 10 µMʺ ě Ĉ # Æ Ǡ : TCA ( Ǒ Ŀ > Ɔʹ 5 10 20 40 80 160 240 µ Mʺ " ɂ CsA è + SCY446

$ 4 ' Æ Ǡ : TCA Ǒ Ŀ > Ɔ : $ ë 9 ɳ 1 ƾ Ř ( ʛ Ħ Û ƛ ł 0 ʹ Fig. 4Abcʺ ; ) CsA è + SCY446 ' 7 : NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ʛ Ħ Ȍ ð ǲ # : $ > Ȁ ; 8 ( Þ ð ǘ ) NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ʉ ¥ ' Ȟ ð : $ Ȁ ü ;

Ƭ ' Þ ð ǘ NTCP ( HBV õ Ǻ ʉ ¥ > Ʀ ǲ $ : % > preS1 m l > Ǥ I C e ^ B L U A ] W C > ɂ ɐ ƚ CsASCY446 0 ) SCY995ʹ 6.2512.525 µ Mʺě Ĉ # preS1 m l ( Ǒ Ŀ > Ɔʹ40 80 160 320 nMʺ " preS1 Ȟ ð A ] W C > ɂ CsA SCY446 è + SCY995 À " ' " Æ Ǡ : preS1 m l Ǒ Ŀ > Ɔ : $ ( õ Ǻ ʛ Ħ Û ƛ ł 0 ʹ Fig. 4Bʺ ; ) CsA SCY446 è + SCY995 ' 7 : preS1 õ Ǻ ʛ Ħ Ȍ ð ǲ # : $ > Ȁ ; 8 ( Þ ð ǘ ) NTCP ( HBV õ Ǻ ʉ ¥ ' Ȟ ð : $ Ȁ ü ;

( ɐ ƚ 7 9 CsA è + SCY446 ) NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ʉ ¥ > ô

(20)

? Ʌ ʩ ʉ ¥ ' Ȟ ð ƃ SCY995 ) ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ʉ ¥ > ô 0 & Ʌ

ʩ ʉ ¥ ' Ȟ ð : $ ȩ 8 ; :

(21)

Figure 4. CsA è + ( ɛ ĭ § $ NTCP ( Ȟ ð ƥ ŀ ( ɐ ƚ

ʹ Aaʺ Ȍ ð ʛ Ħ ʹ ɬ Ⱥ ʺ 0 ) ʨ Ȍ ð ʛ Ħ ʹ ȡ Ⱥ ʺ ' : t I F } U v ^ m ] ` > Ȁ ʹ AbcʺCsA 0 ) SCY446ʹ 0510 µMʺě Ĉ # Æ Ǡ : TCA ( Ǒ Ŀ > Ɔʹ 510 204080160240 µMʺ $ ( NTCP ` | U r Z ƾ Ř ( I C e ^ B L U > ɐ ƚ ʹ BʺpreS1 Ȟ ð A ] W C > Þ ð ǘ ' 7 : preS1 m l ( õ Ǻ ʛ Ħ Û ƛ ( Ē Ü > ɐ ƚ ɬ Ⱥ S M b ~ ) Ț Ȱ ' õ Ǻ preS1 m l > ʦ Ⱥ S M b ~ ) ƞ > Ȁ ʹ Mean ± SDʺ

B

CsA SCY446

C

preS1- TAMRA

SCY995

excess amount of ﬂuorescent-labeled preS1 red: preS1 probe blue: nucleus

HepG2 HepG2-hNTCP-C4

control

0 4000 8000 12000 16000

0 50 100 150 200 250 SCY446

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

0 50 100 150 200 250 CsA

[3H]-TCA uptake non-

competitive

control competitive

maximum-effect

TCA concentration TCA concentration

< mode of inhibition >

A

B

(a) (b) (c)

(22)

ȩ Ī

ǟ Ĉ B Ċ Ȭ Ǔ ( ƻ ǯ Ⱦ $ " IFN ʲ 5 ƞ ʌ A b M Ċ ɹ ɰ Ä ʋ Ș ʛ Ħ Ò ȶ ļ # Ǥ 8 ; " : IFN ) Ĩ ¾ Ǭ ( ƾ Ř Þ : ) Ȭ Ț Ȱ # ( HBV ɉ Ɉ 4 Ǹ Ŵ ŧ Î : $ ' 7 9 HBV ʐ > ǉ į : 0 ƞ ʌ A b

M ) HBV ɉ Ɉ ʁ ȇ ( ɹ ɰ Ä ' Ŕ ʮ & HBV r } v | X ' Ȟ ð : $ ' 7 9 ( ɹ ɰ Ä ƾ Ř > ʛ Ħ : ; 8 ( Ⱦ Ò ' 7 : Ȭ Ǔ ( ƺ ʧ Þ ' Ø " HBV ( ŭ ȟ ǲ Ų ʞ > ʃ š : 3 ' ) ; 8 $ ǫ & : ¨ Ǥ ƪ Ľ ( ũ D C ~ U Ⱦ > ʗ ǰ : $ ƣ 3 " ʎ Ɋ # :

ƒ ǽ ȉ # ) HBV ( õ Ǻ ʛ Ħ Ò $ " Ƅ ' ǻ 8 ; : CsA ( ɛ ĭ § > Ǥ Ț Ȱ Č ʴ Ȗ ( U L } c M 7 9 CsA $ ñ ȏ 0 ) ; ( HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ ƾ Ř > ƍ : 4 Ȉ ( ɛ ĭ § > ɋ Ç HBV ( ŝ Ɯ ì ħ § NTCP # : $ Ď ö ; " Ɨ NTCP > Ʀ ǲ $ : HBV ¯ ¿ ʛ Ħ Þ ð ǘ ) myrcludex-B 5 CsA irbesartan ezetimibe ritonavir vanitaracin A >

) 3 ƥ Ď ö ; "

9 - 1 7 ,2 3 ,2 4 )

( À " ) HBV ( ¯ ¿ >

ʛ Ħ : # & NTCP ( Ǣ Ǡ ǲ ƪ ȱ # : Ɂ 8 Ȭ Ț Ȱ , ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƾ Ř 4 ʛ Ħ " 0 $ Ƈ 8 ' & " : ƒ ǽ ȉ # ō 8 ; 4 Ȉ ( CsA ʲ Ȥ § ) ; 4 NTCP ' ¨ Ǥ : $ # HBV ( Ț Ȱ , ( õ Ǻ > ʛ Ħ ŝ Ɯ ʛ Ħ > Ł ɭ $ Ȁ ü ; : Ǚ ' SCY995 ) NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƪ ȱ , ( ņ ʪ ) ʨ ĵ ' ¦ 0 ( SCY995 ) I ~ S c y } ǹ ¨ Ǥ ʉ ¥ ( Ƥ ɼ ² ʳ ' 7 9 ¾ Ǭ ŧ Î ƾ Ř 4 ŭ & $ = " : 8 & : ɛ ĭ § ( Ƣ ɒ 5 i ` Ȭ Ț Ȱ K v | s D U # ( HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ Û ƛ ( ɗ ® ) Ŕ Ɋ Ó ¨ Ǥ į &

HBV ¯ ¿ ʛ Ħ > ʃ š # : Ƃ Ɍ ũ HBV ƻ ǯ Ⱦ S V ' & : $ Ə ŉ ;

(23)

: 0 ƒ ǽ ȉ ' 7 9 ; 0 # È : $ # & NTCP ƍ

: ` | U r Z ƪ ȱ $ D C ~ U ì ħ § ƪ ȱ È ʤ î ȱ # : $

Ȁ ü ;

(24)

Ȏ ȋ NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƪ ȱ ' ņ ʪ & HBV Ǚ ǫ ǲ ¯ ¿ ʛ Ħ p m \ a ( ų ș

ǽ ȉ Ƿ ǲ

Ñ ȋ ( ɻ 9 Ț Ȱ Č ʴ Ȗ > Ǥ U L } c M ' 7 9 NTCP > Ʀ ǲ

$ & 8 4 ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƪ ȱ ' . $ ? % ņ ʪ & ʆ Ū ǲ HBV ʛ Ħ Þ ð ǘ > ō 8 ; : $ Ȁ ü ; # ƒ ǽ ȉ # ) 7 9 U ~ m ] ` ( ʷ in vitro U L } c M Ŧ Ƀ # : RaPIDʹ Random Peptide Integrated Discoveryʺ S U ^ u

^{2 5 )}

> Í Ǥ " ʷ Ĕ ƥ Ř Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a

| C l | } 8 NTCP ' ʷ Ȟ ð Ɏ ú Ř > Ȁ p m \ a µ ɇ > ɋ Ç

( 8 NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƪ ȱ ' ņ ʪ & ʆ Ū ǲ HBV ʛ Ħ p

m \ a > ñ ģ : $ > ɘ 1

(25)

Ȏ Ȓ RaPID S U ^ u > Í Ǥ HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ( U L } c M

RaPID S U ^ u > Í Ǥ ʷ Ĕ ƥ Ř Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a | C l | } 8 NTCP ' ʷ Ȟ ð Ɏ ú Ř > Ȁ 10 Ȉ ( p m \ a µ ɇ > ɋ Ç ʹ Ƙ ĕ Ĝ Ǡ Ĝ ʉ ȼ Ɇ Ƈ ǽ ȉ ĥ $ ( Á ñ ǽ ȉ ʺ ( 10 Ȉ ( p m \ a ' " i

` Ë Ȭ Ț Ȱ > Ǥ " HBV ( ŝ Ɯ ʛ Ħ Û ƛ > Ƣ ɒ Ë i ` Ȭ Ț Ȱ ' p m \ a 100 µM > 2 ƈ ʘ Ñ Æ Ǡ ŋ p m \ a ě Ĉ # HBV > 16 ƈ ʘ ŝ Ɯ Ƒ ŝ Ɯ ( HBV è + p m \ a > ƽ ǀ Ț Ȱ > 8 ' 12 ƅ ʘ Č ʴ ŋ Č ʴ ǈ ( HBs ũ å > ǌ ģ : $ # HBV ŝ Ɯ > ɗ ® ( A ] W C ' " Ƅ ǻ ( HBV ¯ ¿ ʛ Ħ Ò ( ǡ ǚ p m \ a # : CsA > r T ^ B l O ` ~ $ " Ǥ Ƣ ɒ 10 Ȉ À " ( Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ) Ț Ȱ ƴ Ř > Ȁ $ & ʹ Fig. 5Cʺ Č ʴ ǈ ( HBs ũ å ʐ > ǉ į ʹFig. 5B ʺ

( 1st U L } c M ' " Ƌ 4 Ń ũ HBV ƾ Ř > Ȁ D2 è + D4 ) ( ʊ Ê ' Ǚ Œ ǲ & PX(I/L)H(I/L)F w \ kʹ P w \ k ʺ> ô 2 $ > ɋ Ç 0 ñ ƥ ' L1 L4 D1 ( 3 Ȉ ' " ) (T/L)W(T/I)W w \ kʹ W w \ k ʺ> ô 2 $ ɚ 3 8 ; ; 8 2 ( w \ k

> NTCP Ȟ ð w \ k $ ȩ ( ʊ Ê > ŭ k G I U a | C l | } ʹ P w \ k ʼ 88 Ȉ W w \ k ʼ 179 Ȉ ʺ > Ǥ " 8 ' NTCP ' ʷ Ȟ ð Ɏ ú Ř > Ȁ 12 Ȉ ( p m \ a µ ɇ > ɋ Ç ʹ Ƙ ĕ Ĝ Ǡ Ĝ ʉ ȼ Ɇ Ƈ ǽ ȉ ĥ ʺ

ō 8 ; 12 Ȉ ( p m \ a ' " Ã + i ` Ë Ȭ Ț Ȱ > Ǥ " HBV

( ŝ Ɯ ʛ Ħ Û ƛ > Ƣ ɒ Fig. 5A ' Ȁ ƃ Ƽ ' 7 9 p m \ a 10 µM >

(26)

Ț Ȱ ' Æ Ǡ " HBV ŝ Ɯ Ĥ ʵ > ɂ Ƣ ɒ 12 Ȉ ( 10 Ȉ ( p

m \ a # Ț Ȱ ƴ Ř > Ȁ $ & ʹ Fig. 6BʺHBV ŝ Ɯ > ƍ Ŝ ' ŧ Î

( ( 7 Ȉ ) Ƭ i ] ` p m \ a 7 9 4 ʷ ƾ Ř > Ȁ ʹ Fig. 6Aʺ Ǚ

' WD1WL2 WL4 ( 3 Ȉ ( p m \ a ) Ƚ Ń ũ HBV ƾ Ř > Ȁ

3 ȟ ɐ ƚ ' 7 9 ( ƾ Ř ( ə Ț > ɗ ®

(27)

Figure 5. ũ HBV ƾ Ř > ƍ : Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ( 1st U L } c M

ʹ A ʺ HBV ŝ Ɯ Ĥ ʵ ( m ` O ~ Ë i ` Ȭ Ț Ȱ 0 ) HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' p m \ a > 2 ƈ ʘ Ñ Æ Ǡ ŋ p m \ a ě Ĉ

# HBV > 16 ƈ ʘ ŝ Ɯ Ƒ ŝ Ɯ ( HBV è + p m \ a > ƽ ǀ Ț Ȱ > 8 ' 12 ƅ ʘ Č ʴ ŋ Č ʴ ǈ ( HBs ũ åʹ Bʺè + Ț Ȱ Ǣ ě Ǟʹ Cʺ

> ǌ ģ ʹ B Cʺ Ë i ` Ȭ Ț Ȱ ' Þ ð ǘ ʹ CsA 0 ) Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m

\ a 100 µMʺě Ĉ # ʹ Aʺ' Ȁ ɻ 9 HBV ŝ Ɯ Ĥ ʵ > ɂ ʹ Mean

± SD *P < 0.05 **P < 0.01ʺ

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

B

C

control CsA L1 L2

D1 D2 D3 D4 L5 L6

L3 L4

cell viability

OD450 (fold)HBs (fold)

HBs

*

** ** ** **

**

** ** ** ** **

control CsA L1 L2

D1 D2 D3 D4 L5 L6

L3 L4

A

HBV peptide

2 h 16 h 12 days

peptide HBV infection + peptide

wash detection

(28)

Figure 6. ũ HBV ƾ Ř > ƍ : Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ( 2nd U L } c M

ʹ A Bʺ Ë i ` Ȭ Ț Ȱ ʹA ʺ 0 ) HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ʹ Bʺ ' Þ ð ǘʹ CsA 0 ) Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a 10 µ Mʺ> Æ Ǡ Fig. 5A ' Ȁ ƃ Ƽ

# HBV ŝ Ɯ Ĥ ʵ > ɂ Č ʴ ǈ ( HBe ũ å ʹ Aʺ è + Ț Ȱ Ǣ ě Ǟ ʹ Bʺ > ǌ ģ ʹ Mean ± SD *P < 0.05 **P < 0.01ʺ

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

PL1

A

B

cell viability

control CsA WL1 WL2

D1 D2 D4 L1 L4 WD1 WD2 WD3 WD4 WL5 WL6

WL3 WL4

OD450 (fold)

**

*

HBe

*

**

*

** **

**

** **

ﬁrst hit peptides second hit peptides

* *

*

HBe (fold) PD1 PL1

control CsA WL1 WL2

D1 D2 D4 L1 L4 WD1 WD2 WD3 WD4 WL5 WL6

WL3 WL4

ﬁrst hit peptides second hit peptides

PD1

(29)

Ȏ Ȓ Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ' 7 : HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ ƾ Ř ( ɗ ®

3 Ȉ ( Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ʹWD1 WL2 WL4ʺ ( HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ Û ƛ >

HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ > Ǥ ŝ Ɯ Ĥ ʵ ' 7 9 ɗ ® HBV ŝ Ɯ ŋ Č ʴ ǈ ( HBs ũ å è + Ț Ȱ Â HBc ũ å > ǌ ģ ¯ ¿ ʛ Ħ Ò # : CsA ) HBs è + HBc ũ å ʐ > ŧ Î ƃ # HBV ( ɉ Ɉ ʁ ȇ > ʛ Ħ : ƞ ʌ A b M Ɉ Ò ( entecavir ) ʛ Ħ Û ƛ > Ȁ & ʹ Fig. 7A Bʺ ; ) Fig. 5A ' 7 : HBV ŝ Ɯ Ĥ ʵ ( Ȗ $ " HBV Ǣ ƾ ǡ ( ¯ ¿ ʁ ȇ ( ɗ ® ' ʅ : $ > Ŝ ÷ : 3 Ȉ ( Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ aʹ WD1 WL2 WL4ʺ) Ț Ȱ ƴ Ř > Ȁ $ & ʹ Fig. 7CʺHBs è + HBc ũ å ʐ > ĕ Ķ ' ¦ ʹ Fig. 7A Bʺ ( HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ Û ƛ ) Ƭ i ] ` p m

\ a ( D1 è + D2 7 9 4 ʷ

7 9 Ǣ Ǡ Ɩ ' ɵ ! : 3 ' FBS Ǧ Ɨ Z h L ɪ > ʝ ē ǒ ʁ ' " ʞ ȕ Ɉ HBV > Ǥ " ŝ Ɯ Ĥ ʵ > ɂ CsA è + Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ʹ WD1 WL2 WL4ʺ) Č ʴ ǈ HBs ũ å > Ǥ ʐ ě ǲ ' ¦ ʹ Fig.

7Dʺ ( IC

_{5 0}

) ; ; 3.17 ± 0.300.85 ± 0.012.54 ± 0.110.66 ± 0.03

# ; ) ƒ ǽ ȉ ' 7 9 ɋ Ç Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a CsA 7 9 4

5 ´ ȇ Ŀ Ń ũ HBV ƾ Ř > ƍ : $ > Ȁ ü :

(30)

Figure 7. ʆ Ì 3 Ȉ ( Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ( ũ HBV ƾ Ř

ʹ A-CʺHepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' Þ ð ǘ ě Ĉ ʹ preS1 peptide 100 nMCsA 0 ) Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a 30 µ Mʺ # HBV > 16 ƈ ʘ ŝ Ɯ Ƒ ŝ Ɯ ( HBV è + Þ ð ǘ > ƽ ǀ Ț Ȱ > 8 ' 12 ƅ ʘ Č ʴ ŋ Č ʴ ǈ ( HBs ũ åʹ AʺȚ Ȱ Â HBc ũ åʹ BʺȚ Ȱ Ǣ ě Ǟʹ Cʺ> ǌ ģ ʹ Bʺ' " ɬ Ⱥ S M b ~ ) HBc ũ å ʦ Ⱥ S M b ~ ) ƞ > Ȁ ʹ D ʺ HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' Þ ð ǘ ʹ 0.3 1 3 10 µMʺ ě Ĉ # ʹ A-Cʺ ñ ƥ ( HBV ŝ Ɯ Ĥ ʵ > ɂ Č ʴ ǈ ( HBs ũ å > ģ ʐ ʹ Mean ± SD N.S.; not significant *P < 0.05 **P < 0.01ʺ

HBs (fold) control CsA WL2

WD1 WL4

entecavir

**

N.S.

D1 D2

C

B

D

HBs

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

** **

**

*

cellular DNA (fold) control CsA WL2

WD1 WL4

entecavir D1 D2

cell viability

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

HBc

control entecavir CsA

D1 D2

WL2 WL4

WD1

A

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

control

HBs (fold)

WL2

WD1 WL4

CsA

**

*

**

*

**

** **

HBs

Red: HBc, Blue: nucleus

100 µm

(31)

Ȏ Ȓ Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ( HBV õ Ǻ ʁ ȇ , ( ņ ʪ

WD1 WL2 WL4 ( ƍ : ũ HBV ƾ Ř ¯ ¿ ʁ ȇ ( ʛ Ħ ' 7 : 4 ( # : % > Ƣ ɒ HBV Ǣ ƾ ǡ ) D C ~ U ( õ Ǻ 8 Ț Ȱ Â ¯ ¿ ƞ Ȇ ɂ cccDNA Ņ š 0 # ( Ë Ə ʁ ȇ $ RNA ɰ Ä 8 K x m S a Ņ š ɹ ɰ Ä F o m ( ǝ ō D C ~ U Ž Ç 0 # ( ŋ Ə ʹ ɉ Ɉ ʺ ʁ ȇ ' ĕ È : $ # :ʹ Fig. 1ʺ # 0 Ë 3 ' p m \ aʹ WD1 WL2 WL4ʺ ' 7 : ŋ Ə ʁ ȇ , ( ņ ʪ > Hep38.7-Tet Ț Ȱ > Ǥ " Ƣ ɒ Hep38.7-Tet Ț Ȱ ) tetracycline ' 7 9 HBV ɛ ĭ > Î Ŏ # : Ț Ȱ Ɲ # 9 NTCP ƫ Ź " : 3 HBV Ǣ ƾ ǡ ( ŋ Ə ʁ ȇ > ɗ ® # :

^{2 6 ,2 7 )}

Hep38.7-Tet Ț Ȱ ' Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a 30 µM > tetracycline ʨ ě Ĉ # 6 ƅ ʘ Æ Ǡ ŋ Ț Ȱ Â HBV DNA > real-time PCR Ƽ ' 7 9 ģ ʐ r T

^ B l O ` ~ $ " Ǥ ƞ ʌ A b M Ɉ Ò ( entecavir ) Ț Ȱ Â HBV DNA ʐ > ʱ Ƚ ' ¦ ʹ Fig. 8Aʺ ƃ # 3 Ȉ ( p m \ aʹ WD1 WL2 WL4ʺ ) HBV DNA ʐ ' ņ ʪ > &

ȟ " p m \ a ( HBV õ Ǻ ʁ ȇ , ( ņ ʪ > Ƣ ɒ : 3 preS1 Ȟ ð A ] W C > ɂ r T ^ B l O ` ~ $ " Ǥ CsA $ ñ ƥ ' 3 Ȉ ( p m \ a ʹ WD1 WL2 WL4ʺ Æ Ǡ ' " 4 Ǥ ʐ ě ǲ ' preS1 m

l ( Ț Ȱ , ( õ Ǻ > ʛ Ħ ʹ Fig. 8B Cʺ ( Ȟ ƛ 7 9 WD1

WL2 WL4 ) ; 4 NTCP ' Ȟ ð : $ # preS1 > HBV ( Ț

Ȱ , ( õ Ǻ > ʛ Ħ : $ Ȁ ü ;

(32)

Figure 8. Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ' 7 : HBV õ Ǻ ʛ Ħ Û ƛ

ʹ AʺHBV ɉ Ɉ ʁ ȇ , ( Þ ð ǘ ( ņ ʪ ) Þ ð ǘʹ entecavir 100 nMǙ Ʈ ǡ ǚ p m \ a 30 µMʺ> tetracycline ʨ ě Ĉ # 6 ƅ ʘ Æ Ǡ Hep38.7-Tet Ț Ȱ Â HBV DNA > real-time PCR Ƽ ' 7 9 ģ ʐ : $ # ɗ ® ʹ B Cʺ HBV õ Ǻ ʁ ȇ , ( Þ ð ǘ ( ņ ʪ > preS1 m l > Ǥ " ɗ ® HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' preS1 m l 40 nM è + Þ ð ǘ ʹ CsA 0 ) Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a 1 3 10 30 µMʺ > Æ Ǡ " ɂ ʹ Bʺ ' " ɬ Ⱥ S M b ~ ) Ț Ȱ ' õ Ǻ preS1 m l > ʦ Ⱥ S M b ~ ) ƞ > Ȁ preS1 m l ' 7 : S M b ~ʹ Bʺ) Dynamic Cell Countʹ KEYENCE ʺ>

Ǥ " ģ ʐ ʹCʺʹ Mean ± SD **P < 0.01ʺ

WL4

B

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

HBV DNA (fold) control ** WL2

entecavir

A

HBV replication assay (Hep38.7-Tet cells)

WD1 ﬂuorescence area (fold) control

WL2

WD1 WL4

CsA

C

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

CsA

WL2

WL4 WD1

control

Red: preS1 probe, Blue: nucleus 100 µm

(33)

Ȏ Ā Ȓ Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ' 7 : ( Ȭ Ǔ D C ~ U ŝ Ɯ $ ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƪ ȱ , ( ņ ʪ

Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ' 7 : HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ Û ƛ ( Ǚ ǫ Ř > ɗ ® : 3 '

( Ȭ Ǔ D C ~ U ( D Ċ Ȭ Ǔ D C ~ Uʹ HDVʺè + C Ċ Ȭ Ǔ D C ~ Uʹ HCVʺ

> Ǥ " Ƣ ɒ HDV ) HBV $ ñ F o m > ƍ " : 3 HBV $ ñ ƥ ' NTCP ě ǲ & ȝ ɮ > ɴ 9 Ȭ Ț Ȱ , ¯ ¿ :

^{2 8 )}

ƃ # HCV ) HBV è + HDV $ ) À ǫ & 9 NTCP ʨ ě ǲ & ȝ ɮ ' 7 9 Ț Ȱ Â '

¯ ¿ :

^{2 9 )}

HDV ŝ Ɯ ) HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' p m \ a 30 µ M ě Ĉ

# 16 ƈ ʘ ŝ Ɯ ( ŋ 8 ' 6 ƅ ʘ Č ʴ " Ț Ȱ Â HDV RNA >

real-time RT-PCR Ƽ # Ƣ Ç : $ ' 7 9 ɗ ® WD1 WL2 WL4 $ 4 ' HDV RNA ʐ > ƍ Ŝ ' ¦ ʹ Fig. 9Aʺ HCV ŝ Ɯ ) Huh-7.5.1 Ț Ȱ ' p m \ a 30 µM ě Ĉ # HCV S y a Ȕ ę > 4 ƈ ʘ ŝ Ɯ ( ŋ 8 ' 72 ƈ ʘ Č ʴ " Ț Ȱ Â ~ S k E | X ƾ Ř > ǌ ģ : $ ' 7 9 HCV ŝ Ɯ > ɗ ® HDV ŝ Ɯ , ( Ȟ ƛ $ ī ǖ ǲ ' 3 Ȉ ( p m \ a ) HCV ŝ Ɯ ' ņ ʪ > & ʹ Fig. 9Bʺ ( Ȟ ƛ 8 Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ aʹ WD1WL2 WL4ʺ) NTCP ě ǲ & D C ~ U ŝ Ɯ > Ǚ ǫ ǲ ' ŧ Î : $ Ȁ ü ;

WD1WL2 WL4 ) NTCP ' Ȟ ð : $ ' 7 9 NTCP ƒ Ɨ ( ƪ ȱ # : ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƾ Ř ' ņ ʪ : % > [

³

H]-TCA > Ǥ " Ƣ ɒ p m \ aʹ3 10 30 µMʺ$ 0.1 µM [

³

H]-TCA > HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' Æ Ǡ Ț Ȱ Â ' ë 9 ɳ 0 ; [

³

H]ʐ > ǌ ģ ( Ȟ ƛ 3 Ȉ ( p m \ a ) CsA 7 9 4 ũ HBV ƾ Ř Ń ' 4 ʙ = 8 CsA $ ) ĕ ǫ

& 9 ǎ ɐ Ƌ ĕ Ǒ Ŀ ( 30 µ M ' " 4 NTCP ( ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 > ƍ Ŝ '

(34)

¦ & ʹFig. 9C ʺ ( Ȟ ƛ ) WD1 WL2 WL4 ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ' À ņ ʪ > : $ & HBV ( ¯ ¿ > Ǚ ǫ ǲ ' ʛ Ħ # :

$ > Ȁ $ 0 NTCP ( D C ~ U ì ħ § ƪ ȱ > ȯ Ƶ ʌ ë 9 ɳ 1 ƪ ȱ $

È ʤ " Ʀ ǲ ' # : $ > Ȁ ü " :

(35)

Figure 9. ( Ȭ Ǔ D C ~ U ŝ Ɯ , ( ņ ʪ è + NTCP ` | U r Z

ƾ Ř , ( ņ ʪ

ʹ Aʺ HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' Þ ð ǘ ě Ĉ ʹ preS1 peptide 100 nM Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a 30 µMʺ # HDV > 16 ƈ ʘ ŝ Ɯ Ƒ ŝ Ɯ ( HDV è + Þ ð ǘ > ƽ ǀ Ț Ȱ > 8 ' 6 ƅ ʘ Č ʴ ŋ Ț Ȱ Â HDV RNA > real-time RT-PCR Ƽ # ǌ ģ ʹ Bʺ Huh-7.5.1 Ț Ȱ ' Þ ð ǘ ě Ĉ ʹ bafilomycin A1 20 nMǙ Ʈ ǡ ǚ p m \ a 30 µ Mʺ# HCV S y a Ȕ ę > 4 ƈ ʘ ŝ Ɯ Ț Ȱ > 8 ' 72 ƈ ʘ Č ʴ ŋ Ț Ȱ Â ~ S k E | X ƾ Ř > ǌ ģ :

$ # HCV ŝ Ɯ > ɗ ® ʹ Cʺ Þ ð ǘ ʹ CsA 0 ) Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a 3 10 30 µM ʺ $ [

³

H]-TCA 0.1 µM > Na

⁺

ô ƍ g ] k @ # ǆ ð HepG2-hNTCP-C4 Ț Ȱ ' 15 È ʘ Æ Ǡ Ț Ȱ Â ' ë 9 ɳ 0 ; [

³

H]ʐ >

ǌ ģ ʹ Mean ± SD N.S.; not significant **P < 0.01ʺ

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

A

** ** ** **

HCV

(NTCP-independent infection)

luciferase activity (fold)

**

N.S.

control WL2

WD1 WL4

baﬁlomycin A1

HDV RNA (fold)

HDV

(NTCP-dependent infection)

preS1 peptide

control WL2

WD1 WL4

B

[3H]-TCA uptake (fold) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

N.S.

CsA WD1 WL2 WL4

control

N.S.

** ** **

C

NTCP transporter activity

(36)

Ȏ Ȓ Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ( Ļ ȓ & HBV ŝ Ɯ ʛ Ħ ƾ Ř ( ɗ ®

ƒ ǽ ȉ # ɋ Ç Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ( ȶ ļ ŕ Ǥ ( î ȱ Ř > ɗ ® : 3 ƥ & ʇ ¢ ę Ċ HBV 5 Ⱦ Ò ȫ Ř HBV ' ī : ŝ Ɯ ʛ Ħ Û ƛ > ƾ Ř ( Ń WD1 è + WL4 > Ǥ " Ƣ ɒ Ë i ` Ȭ Ț Ȱ ' p m \ a 30 µM >

Æ Ǡ ʇ ¢ ę Ċ A B C ( HBV entecavir ȫ Ř HBVʹ ʇ ¢ ę Ċ C L180M/S202G/M204V Ē ǫ ʺ

^{3 0 )}

0 ) L \ ɸ ʈ HBV ʹ ʇ ¢ ę Ċ C G145R Ē ǫ ʺ

^{3 1 )}

> Ǥ " HBV ŝ Ɯ Ĥ ʵ > ɂ Č ʴ ǈ ( HBs ũ å > ǌ ģ : $ # HBV ŝ Ɯ > ɗ ® ; 0 # ( ɐ ƚ # Ǥ " ʇ ¢ ę Ċ D ( HBV , ( ƾ Ř ʹ Fig. 7ʺ ' Ø " WD1 è + WL4 ) ʇ ¢ ę Ċ A B C ( HBV ' ī " 4 ŝ Ɯ ŧ Î Û ƛ > Ȁ ʹ Fig. 10ʺ 8 ' entecavir ȫ Ř HBV è + L \ ɸ ʈ HBV ( ŝ Ɯ 4 ñ ƥ ' ƍ Ŝ ' ʛ Ħ ʹ Fig. 10ʺ

( Ȟ ƛ 7 9 ƒ ǽ ȉ # ɋ Ç Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ) Ļ ȓ & ũ HBV ƾ

Ř > ƍ : $ Ȁ ü ;

(37)

Figure 10. Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a ' 7 : Ļ ȓ & ũ HBV ƾ Ř

Ë i ` Ȭ Ț Ȱ ' Ǚ Ʈ ǡ ǚ p m \ a 30 µM > Æ Ǡ Fig. 5A ' Ȁ ƃ Ƽ # ʇ ¢ ę Ċ A B C ( HBV entecavir ȫ Ř HBV ʹ ʇ ¢ ę Ċ C L180M/S202G/M204V Ē ǫ ʺ0 ) L \ ɸ ʈ HBV ʹ ʇ ¢ ę Ċ C G145R Ē ǫ ʺ > Ǥ " HBV ŝ Ɯ Ĥ ʵ > ɂ Č ʴ ǈ ( HBs ũ å > ǌ ģ ʹ Mean ± SD **P < 0.01ʺ

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

HBs (fold)

genotype A

control WD1 WL4

** **

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

genotype B

control WD1 WL4

**

genotype C

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

control WD1 WL4

** **

genotype C (L180M/S202G/M204V)

control WD1 WL4

**

genotype C (G145R)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

control WD1 WL4

** **

Elucidation of Molecular Mechanism of Hepatitis B Virus Infection and Drug Discovery Targeting Bile Acid Transporter, NTCP/SLC10A1

ȯ Ƶ ʌ ` |  U r  Z NTCP/SLC10A1 > Ʀ ǲ $ B Ċ Ȭ Ǔ D C ~ U ( ŝ Ɯ ʛ Ħ Ⱦ ʗ ǰ $ ŝ Ɯ ƪ Ƥ ( ɐ Ƈ