九州大学学術情報リポジトリ

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Kyushu University Institutional Repository

シェーグレン症候群発症の分子機構の解明 : ウイル ス誘発病変からのアプローチ

佐々木, 匡理

Graduate School of Dental Science, Kyushu University

https://doi.org/10.11501/3172441

出版情報：Kyushu University, 2000, 博士（歯学）, 課程博士 バージョン：

権利関係：

∞­

æ ó"

ωRno一O「noコ沖『O一一u一ω仲nzwω OMBコ Q50コ 〈o=o老 30a 玄釦也OコS 〈〈『dzo

3旨

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問

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C

シェーグレン症候群発症の分子機構の解明

ーウイルス誘発病変からのアプローチー

An elucidation of the molecular mechanism of the development of Sjögren's syndrome

-An approach via the virus-induced disorder-

佐々木 匡理

指導教官

九州大学歯学部u腔外科学第二講座

白 砂 兼光 教授

本研究の内容は下記の学術雑誌に発表した。

Accumulation of human T Iymphotropic "irus type I-infected T cells in the saliyalJ' glands of patients with human T lymphotropic "irus type I-associated Sjりgren's

syndrome. (1)

Yukiko Ohyama， Seiji Nakamura， Hideo Hara， Masanori Shinohara， I\l1asanori Sasaki， Akiko 1kebe-Hiroki， Takefumi Mouri， Sizuka Tsunawaki、Kihachiro Abe， Kanemitsu Shirasunaラand Kikuo Nomoto

Arthritis

&

Rheumatisl11

41: 1972-1978， 1998

Accumulation of common T cell clonotypes in the saliyalJ' glands of patients with human T Iymphotropic YÎrus type I-associated and idiopathic Sjりgren's syndrome

(2)

Masanori Sasaki、Seiji Nakamura， Yukiko OhyamaっMasanori Shinohara、1chiko Ezaki， Hideo

Hara、 Tsutomu Kadena， Kenji Kishihara， Kazuhiko Yamamoto， Kikuo Nomoto， and

Kanemitsu Shil・asuna

The Jouma1 of 1mmunology

] 64:2823-2831，2000

略語表

AG PC: acidified guanidíníum・phenol-chloroform

ABC:

avidin-biotin-complex

(アビジンービオチン複合体)

C:

constant

(定常)

Cf3:

constant region of T cell receptor � ^chaín cDNA: complementary DNA

CDR3:

complementarity-determining region

3 D:

diverse

Dß:

diverse region of T cell receptor � ^chain

dNTP: deoxyribonucleotide triphosphate

(デオキシリボヌクレオシド三リン酸)

E

D

T A: etylenediaminetetraacetic acid

(エチレンジアミン四酢酸)

HAAP: HTLVートassociated arthro pathy (HTL V-1関連関節症)

HAM/TSP: HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HTLV-1関連

脊髄症/熱帯性産性麻煉)

HTLV-I: human T lymphotropic virus type 1

(ヒトT細胞白血病ウイルスI型)

IFN: interferon

(インターフエロン)

IL: inter1eukin

(インタ一口イキン)

19:

immunogloblin

(免疫グロブリン)

1:

joining

(結合)

Jf3:

joining region of T cell receptor

�

^chain LSG: labial salivary glands

(口唇腺)

MHC: major histocompatibility complex

(主要組織適合遺伝デ複合体)

m

R

N A: messenger

RN

A

PBMC: peripheral blood l11ononuclear cells

(木梢血単核球)

PBS phosphate-buffered saline

(リン限緩衝液)

PG: parotid gland

(耳下腺)

PCR: polymerase chain react10n PHA: phytohemaggultinin

SS:

Sjögren's syndrome (シェーグレン症候群)

目次

干円干lニL

3i:ロ 1

SSC: standard saline citrate

SSCP: single-strand conformation polymorphism SSPE: sa1ine sodium phosphate EDT A

TCR:

^T

cell receptor (T細胞レセプター) Th: T helper (ヘルパーT)

Th

^1:

helper T type

¹

TNF: tumor necrosis factor

(腫湯壊死因チ)

V: variable (可変)

Vß: variable region of T cell receptor � chain

緒言 3

材料と方法 ₆

結果

1. HTLV-I関連SSにおける唾液腺病変と血清学的異常の解析 16

II. HTLV-I関連SSにおける唾液腺内HTLV-Iプロバイラル 21

DNAの挨:出

III. HTLV-I関連SSにおける唾液腺内浸潤T細胞の特異性の解析 25

考察 ₃₇

辞s，il

h q q

ニヨロ

43

参考文献 ₄₄

のVß7遺伝子はidiopathic SS忠者のi唾液腺でも検出された。 QDXG配列に特異的

要 旨

同患者群ともに唾液JI泉と末梢血単核球のI何万で

QDXG配列を有するT細胞ク口ノタイフが検出されたが

、 健常者ではいずれにお いても検出されなかった。さらに、HTLV-I+ SS患者の唾液腺からHTLV-I感染T細 なプローブを用いた解析では、

シエーグレン症候群( Sj凸gren'ssyndrom e: SS)の発症には遺伝的素因や環境要因な どが複雑に関与していると考えられているが、 種々のウイルスの関与が最近注目さ

胞株を樹立したところ、 QDXG配列を有するT細胞クロノタイプが含まれていた。

ヒトT細胞白血病ウイルスI型(human T lymphotropic virus type 1

以上のことから、 HTLV-I+ SS患者でも idiopathic SS患寄と同様の略液腺病変が

QDXG配列を有する T細胞レセ

プタ HTLV-Iの感染に拘らず、

起こっており、

このウイルスに感染した患者ではHTLV-

I関連疾患

と呼ばれる SSを含めた自己免疫疾患に類似した種々の病変を引き起こすことが報

つであり、

れている。

HTLV-I)もその

、.，..

」ー

T細胞が ーを発現するT細胞が SSの発症に亘要な働きをしていることが示唆された。

HTLV-I感染患者で、はこの のT細胞は自己反応性であると推察され、

HTLV-I関連SSの発症とHTLV-l感染との 関連を明らかにすることを主な目的とし、 抗日TLV-I抗体陽性(HTLV -1+) S S患者 告されている。 そこで本研究では、

、りさ

HTLV- I

に感染することにより、 末梢での活性化および増殖がまず誘導され

SSの発症を導く可能 に自己抗原が存在する唾液腺に浸潤して集積することにより

と陰性(idiopathic) SS患者の比較検討を行い、 以下の結果を得た。

性が示唆された。

HTLV-I関連SSにおける唾液腺病変と血清学的異常の解析

サイトカイン産生 日垂液腺病変に関する臨床検査所見、 浸潤リンパ球サブセット、

能については、 両患者群聞に明らかな差異はみられず\唾液腺病変の性状としては 類似したものであった。 また、 血清学的具常についても類似した所見を示していた。

HTLV-I関連SSにおける唾液腺内HTLV-IプロバイラルDNAの検出

2.

HTLV-I+ SS

患者の唾液腺組織から抽出したゲノムDNA中にHTLV-l遺伝子の そのプロバイラルDNAは唾液腺の導管上皮や腺房細胞ではな 全領域が検出でき、

また、 唾液腺内のHTLV-Iウイルス量は く、 浸潤T細胞の核内に存在していた。

一方、 idiopathic SS患寸者で 末梢血単核球よりも約8倍から9X 103倍も多かった。

一部の症例でpX領域 はほとんどの症例でHTLV-l遺伝子は検出できなかったが、

のみが検出された。

HTLV-I関連SSにおける唾液腺内浸潤T細胞の特異性の解析

J q

両患者群ともに、 末梢血単核球に比べると唾液腺ではより少数のT市rnJj包レセフ ターのVf3遺伝子ファミリーが発現されており、HTLV-

I+ SS患者では特にVß5.2、

Vß6およびVß7遺伝子が多くの症例で使用されていた。 同1]患者群とも唾液J1泉では HTLV-I十SS患者では末 オリゴクローナルなT細胞クロノタイプの集積がみられ、

梢血上手核f�(でも唾液服と共通のT市IlIJ1包クロ

ノタイプの集積が みられた。

この

HTLV-I+ SS

J記者の略液腺に集積するVß7遺伝子の抗原結合領域には、

QDXG (X

同様 はいずれのアミノ酸でも11})というアミノ酸配列が高頻度に保持されており、

HTLV-I I期連SSに おける時液J]泉病変を詳細に 解明す まず第一に、

本研究では、

緒 言

るために 、 抗HTLV-I 抗体陽性(HTLV-I+)

SS

忠者と陰性(idiopathic)

SS患者の臨

の円唇腺(labial 我々はこれまでに、

SS

また、 床検査所見の比較検討を行った。

シェーグレン症候群( Sjögren's syndrome:

S

S)は

^、

11酎夜腺や涙腺などの外分泌腺の _そ

salivary glands: LSG)組織に浸潤するリンバ球はCD4陽性T細胞が主体であり、

自己抗体産生や他の自己^免疫疾^ω

フエロンーy(interferon: IFN ) などのサイトカイン産生能を有するThelper ¹ (Thl) タイフのT細胞であることを のほとんどがインターロイキン・2(interleukin: I L)、インター

障害^による乾燥 症状^を特徴とする症候群であり、

S

Sの発症に

は

自己免疫機構

が

関与していると考えられて と合併することなどから、

いる。 病理組織学的には、nm液H泉や涙腺の導管周囲に

CD4陽性T細胞を主体とし

のLSG 内 浸潤リンパ球のサブセット そこで HTLV-I関連 SS

報告している(

1

9)。 導管や腺房の破壊 ・ 消失^を伴うことが特徴であり、 この

の解析やサイトカインmessenger RNA (mRNA)の発現についても 解析した。 本 症の病因には

たリンバ球浸潤がみられ

^、

HTLV-I 遺伝子の中の pX領域は感染細胞の増殖能などに関与している lúは

また、

浸潤 リンパ球が発症に重要な役割_を持つと考えられている。 また、

このlax遺伝子がHTLV-I関連症候群の発症

・進展に何らか

遺伝子^を含んで おり、

Epstein-Barr (EB)

遺伝的素因、環境要因 などが複雑に関与していると考えられており、

HTLV-I がHTLV-I関連SSの発症機序にど の働 き_をして^いることが予想される

。

ウイルス(3-6)や ヒトT細胞白血病ウイルス I型(humanT lymphotropic virus type

1:

HTLV-I) (7-9)などの種々のウイルスも関与していることが報告されている。

HTLV-I

遺伝子の局在を知ることは極 の^ように関わっているかを解明するために 、

T

細胞白血病の

原

因ウイルスとしてヒトではじ めて発見されたレ

よって、 本研究では第^二に 、

nÆ液

腺組織内にHTLV-

I プ

_ロ めて重要と考^えられる

。

HTLV-I

の感染が慢性進行性脊髄症の発症と密接に関 HTLV-I は成ノ1

パイラル

D

NA

が検

出

で

きるのか どうか 、 検出

で

きるの

であれ

ばどの

細

胞に感染し トロウイルスであるが(

1

0)、

ているのかを検討した。 この慢性進行性脊髄症は

HTLV-I関連脊髄

連していることが最近報告された

( 1

1)。

症/熱帯性痘性麻痩(HTLV -I-associated myelopathy/ tropic spastic paraparesi

s:

HAM/TSP)

T細胞の特異性^を検討 す^るた の唾液腺内に浸潤 す^る

HTLV-I関連SS 最後に、

自 己^免疫疾患である多発性硬^化 症と臨床 症状が類似 する疾患

めに、 抗原提示細胞上の主要組織適合抗原(m句or histocompatibility complex: 1\但C)分 として知られており、

このウイルスはHTLV-I関連関節症(HTLV-I-associated arthropathy

と抗原ペプチドとの複合体を認識するT細胞レセプター(T

cell receptor: TCR)に

多発性筋 炎、 混^合性結^合組織病と いった自 己

であ^る

。

また、

」乙」

TCRはdあるいは悼のヘテロダイマーで構成され、

して解析を行った。

し 注

(12-18)。

ぶどう膜炎、 気管支肺炎症 、

免疫疾患に似た炎症性疾患を種々の臓器で誘導することもわかっている

HAAP)、

C

領域以外に 結^合 れぞれのTCR鎖は可変(variable: V)領域と定常(constant:

C

)領域^に分け

ら

れ

る

。 鎖あるいはy鎖は様々な抗原ペプチドに対応できるようにV、

これらの 自己免疫様のHTLV-I関連疾患の発 症機序は解明されておら いくつかの仮説が考えられている ; 1) ウイルス感染により変性した標的細胞に かしながら

^、

これらの様々な組み合わせに加え 領域)が付_加されること

V-D-J接合部に germ

line の存在しない塩基配列(

J)領域とdiverse(D)領域を有しており、

。Oll1lI1g

て、

2)細胞傷害性T細胞や抗体^依存性の細胞傷害^などの^免疫 3)ウイルス感染 あるいは非特異的 反応によるウイルス感染標的細胞の破壊の誘導、

ず、

対する慢性 炎症の誘導、

V-D-J 接合部をコードする領域'は TCRがh狂-IC分子と抗原ペ

complementarity-determining region 3 ( C D ^R 3) と 呼ば

^れ

、

T C _R

遺伝子の多様性は増^加 する

。

こ の

4) H T LV-I 感染 に

^よる で

白己反応性T細胞の活性化 による自己免疫疾患の惹起、 などである。 前述のように、

T細胞から分?必されるサイトカインによる 炎症および破壊、

プチドの複合体と結合するために重要な領域であると考えられている。 近年、

HTLV

-

I

関連

S Sに

おけ^る っとして報告されており、

SSも HTLV-I関連疾患の l

polymerase chain reaction

(PCR)法を) IjいたTCR

Vß遺伝子レパトアの解析あるいは

HTLV-I関連疾忌の発症機序

nÆ

�夜

J J

泉浸潤リンパ球

の

性質

や

_機能を

解

析

するこ

と

は、

single-strand confo口l1ation polymorphism

(SSCP)法を用いたT細胞クロノタイフの解

の発症機序を解明するための重要な知見

T

細胞の特具性を遺伝子レベルで解析することができる^よう にな 析が可能になり^、

SS

さらに の解明につながると考えられ、

が得られる可能性も折t察される。

った。 本研究ではこれらの手法を用いて、 HTLV-I関連SSの唾液腺|刈浸潤T細 胞のTCR Vß遺伝子レパトア の 解析およびクロノタイプ の解析、 さらにはTCR Vß

遺伝子の CDR3領域の塩基配列を決定し、 T細胞の特異性を解析した。 ま た、 我々 はこれまでに、 idiopathic SSの唾液腺でのTCR Vß遺伝子の使用についても報告し ているので(20)、 HTLV-1関連SSと idiopathic SSとの比較検討も併せて行った。

材料と方法

1. 対象患者

検索対象は、 平成4年から平成8年に九州大学歯学部附属病院第2円腔外不|

を受診し、 厚生省診断基準(21 )およびヨーロッパ診断基準(22)で SSと診断さ れた1 03症例(全て女性、 22"--'72歳)である。 Particle agglutination法( Serodia HTL V -1 kit: Fuji-Rebio、 東京)により血清中の抗HTLV-I抗体を測定してスクリー ニングを行ったところ、 HTLV-I+

SS患者は103例中の 11例(10.7%)であった。

これら の症例から唾液腺生検組織(L SG、 耳下腺; parotid gland: P G)および、末梢血単 核球(peripheral blood mononuclear cells: PBMC) を同じ日に採取し、 RNAおよび

DNA

の解析用には直ちに液体窒素を用いて組織のみを凍結、 免疫組織学的解析用 にはOCT コンパウンド(Miles、 Elkhart、 IN)に包埋して凍結し、 ・800Cで保存し た後に以下の実験に用いた。 免疫組織学的解析、 HTLV-1フロバイラルDNAおよ びTCR Vß遺伝子の解析(レパトア解析、 クロノタイプ解析)には、 前述の症例の うちHTLV-I+ SS患者11例と idiopathic SS患者20例を対象とした。 また、 疾 患特異性を検討するための TCR の解析には、 別の idiopathic SS患者 6例を対象

とした。

2. 免疫組織学的解析

4μm の凍結切片を作製し、 通常のアビジンービオチン複合体 (avidin-bi otin­

complex: ABC)法による免疫染色を行った(20、 23、 24)。 使用したモノクローナル 抗体はT 3-II、 B1 、 G38、 AE1 (それぞれ抗CD3抗体、 抗CD20抗体、 抗CD69抗

体、抗CD25抗体 パージニア大学S.

M.

Fu博士より供与)(25)、 Leu-3a+3b、Leu-2a (それぞれ抗CD4抗体、 抗CD8抗体 B ecton Dickinson、 Mountain View、 CA)、ßFl (抗TCRαß抗体T Cell Science、 Cambrige、 Mass)であった。 各抗体の陽性細胞率 は、 ヘマトキシリン-エオジン染色を施行した切片巾の総単核球数と各抗体による 免疫組織染色を施行した連続切片寸!の陽性細胞数を 3カ所の 4 mm2の範囲で計測 し、 各抗体|湯性市IIIJI包数/総単核球数の比本を求めることにより計算した。

3. ゲノム DNA、 RNAの抽出およびcomplementary DNA (cDNA)の合成

ゲノム DNAの抽出には過去に報告され た方法(26)を用いた。 LSGの5μmパ ラフィン切片3枚を入れたチューブlご500μ!の100%キシレン(和光純薬、大阪) を加え、室温で30分間混合させた後 、 15，000 rpm、 5分間遠心して上清を除去し、

100%エタノールで洗浄後に乾燥させた。 次いで、 10 �のアセトン(和光純薬)を 加えて、 550C、 10分間静置し、さらに 50 mM塩化カリウム(和光純薬)、 10 mM トリ ス塩酸 (pH 8.3) (Sigma)、 2.5 mM塩化 マグネ シウム (和光純薬) 、 0.5%

Tween-20 (和光純薬) を 含む proteinase K緩衝液を 100 � お よ び 10 mg/ml proteinase K (和光純薬) 2μlを添加し、 550C、 3時間インキュベー卜した。 これを 940C、 7分間 denaturationし、 15，000 rpm、 5分間遠心した 後に上清を-200Cで

保存した。

RNAの抽出にはacidified guanidinium-phenol-chloroform (AGPC) (27)法を用いた。

まずLSG、

PG、 PBMCに 4 Mグアニジンチオシアネート 、 25 mMクエン酸ナ

トリウム(pH 7.0)、 0.1 M 2-メルカプトエタノール(以上和光純薬)、 0.5%ラウリ ル酸サルコシル(Sigma)を含む溶液(solution D) 1 mlを加え、 PBMC は21ゲー ジ針とシリンジを、LSGと PG はポリトロン(Kinematica)を用いて破砕した。 こ

れらに 0.1 mlの2 M酢酸ナトリウム (和光純薬)、 1 mlの水飽和フェノール (BRL、

Gaithersberg、 MD)、 0.2 mlの

クロロホルムと イソアミルアルコール(以上

和光純薬)の49 : 1混合液を加えて撹枠後 、

15分間氷冷した。 40C、10ヲ000 rpmで

20分間遠心した後に RNAを含む水層を採取し、 これに 1 mlのイソプロピルア ルコール(和光純薬)を加えて撹枠後、 -200Cで1時間静置した。 その後 、 40C、

10，000 rpmで20分間遠心し、上清の除去 後に得られたRNA ペレットを再び0.3 mlのsolution Dに溶解し、 0.3 mlのイソプロピルアルコールを加えて撹併後 、

-200Cで1 時間静置した。 さらに、 40C、 10，000 rpmで10分間遠心し、 再沈殿 後にペレットを 75% エタノール (和光純薬)で洗浄後乾燥させ、 o 1 % dietyl

pyrocarbonateに溶解した。

cDNAの合成ノザ法としては、 3'"'-'5 μgのtolal RNAに 20

U

RNasül ribonuclease

inhibitor (Promega、 Madison、 \\11)、 0.5 mM各デオキシリボヌクレオシド三リン般 (deoxyribonucleotide triphosphate: dNTP) (Pharmacia)、反応緩衝液、 ] 0 mM dithiothretiol、

100

U

RNase

I-f

reverse transcriptase (BRL)、 および0.5時oligo d (TY:;.IX (Pharmacia)を 加え、 370Cで1 時間インキュベートした。 その後、 950Cで5分間加温して酵 素を失活させ、 その 後直ちに氷冷した。

4. PCR法に よるサイト カイン

^m

町�

^A

発現の解析

症例聞の各サイトカ イン mRNAの発現量を比較する ために11J村らの方法(28) に準じた半定量化を行った。 T 細胞のマーカーとしてはCD3õ m肘ぜA、 全細胞の マーカーとしては十actin m町ぜAを用い、 以下のような方法で全 症例で等量のPCR

産物が検出される ように cDNA量を調節した。 まず、 全ての症例のcDNAを5倍 希釈し、それぞれを1 mM ß-actinある いはCD3õのフライマーを用い、 10 mM卜 リス酢酸(pH 9.0)、

50 mM塩化カリウム 、 2.5 mM権化マグネシウム

、 0.]% Triton

X-I00を含んだPCR反応緩衝液(Perkin-Elmer Cetus、 Emeη!viIle、 CA)、 0.2 mM

dNTP、 種々の濃度に希釈した cDNA、 100 U/mI Taq DNA ポリメラーゼ(Perkirト Elmer Cetus)を加え、 DNAサーマルサイクラー(Perkin-Elmer Ce加s)を用いて増 '1屈を行った。 フライマーおよびフローブの塩基配列は表lに示しており、 いずれ も過去に報告され たものである(19、28)。反応条件は、 denaturationステップ は940C で、初回は5分間、 2回目以降は40秒間、 annealing/extensionステップ は1L・2と IFN-yの場合は550C、 ß-actin、 CD3õと他のサイトカ インの場合は650Cでいず れも 90秒間とした。 27、 30 および33サイクルの増幅後に

PCR産物を採取し、

PCR産物を1.8%アガロースゲル(和光純薬) 上で電気泳動した 後、ナ イロンメン

ブレン NYTRAN-N (Schleicher

&

SchueIl、 DasseI、 Germany)に サザンブロットを行

い、2

X

standard saline citrate (SSC)、 1 M塩化ナトリウム 、 ] % sodíum dodecyl sulfate

(SDS) (以上、 和光純薬)、 ]0%デキストラン硫酸塩(Pharmacia)、 100 mg/ml熱変

性サケ精子DNA(Sigma)のハイブリダイゼーション緩衝液に 32pで標識した 各イ ンターナルプローブ( 表])を加え、 ハイブリダイゼーションを行った。 プローブ の標識にはT4 polynucleotide kinaseを利用したキット(Ready-To-Go、Pharmacia)と

[y_.)�PJ

ATP (Amersham、 ArIington Heíghts、IL)を用いた。 500C、 ]8 11寺聞のハイブ リ夕、イゼーション 後 、メンブレンは500Cの2X SSC/l %

SDS総液で2回洗浄し

た。 オートラジオグラ フィー後、 Fりi BAS 100バイオ イメージアナライ ザー(宿三仁

表l サイトカインmRNAの検出に用いたプライマーおよび、プローブの塩基配列 プライマー 塩基^配列

₍₅

'→

3

^'

)

。-actm 5'

GTGGGGCGCCCCAGGCACCA

3' CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC プローブ CTGCTGACCGAGGCCCCCCTGAACCCC

C_D

3

õ

5'

CTGGACCTGGGAAAACGCATC

3'

GATCTGAGCATCATCTCGATC

プローブ GCCGACACACAAGCTCTGTTGAGGA

IL-2 _5'

ATCCACCAGGATGCTCACAT

3' AGGTAATCCATCTGTTCAGA プローブ CTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCT

IFN--y

5ラ AGTTATATCTTGGCTTTTCA

3'

ACCGAATAATTAGTCAGCTT フローフ ATTTGGCTCTGCATTATTTTTCTGT

IL-4

5ヲ CTTCCCCCTCTGTTCTTCCT

3' TTCCTGTCGAGCCGTTTCAG

フローフ CTCGGTGCTCAGAGTCTTCTGCTCT

IL-5

^5' ATGAGGATGCTTCTGCATTTG

3ラ TCAACTTTCTATTATCCACTCGGTGTTCATTAC プローブ GCCAATGAGACTCTGAGGATTCCTG

IL-6

^5' ATGTAGCCGCCCCACACAGA

3'

CATTCATCTTTTTCAGCCAT

プローブ CTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGA

IL-IO

ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA

3' TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA フローフ TCCAACAGCAAGGCATCTAC

IL-12 (p40) _5'

CCAAGAACTTGCAGCTGAAG

3' TGGGTCTATTCCGTTGTGTC

プローブ TGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGC

TGFß _5' GCCCTGGACACCAACTATTGC

3' GCTGCACTTGCAGGAGCGCAC フローフ CAGTACAGCAAGGTCCTGGGCCTG TNFα

TCTCGAACCCCGAGTGACAA 3' TATCTCTCAGCTCCACGCCA

プローブ TAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCA

I L-

_{l r3 5'} GACACATGGGATAACGAGGC

3' ACGCAGGACAGGTACAGATT

フローーフ CTCCGGGACTCACAGCAAAAAAGCT

フィルム、 東京)を用いて個々のPCR産物の放射活性を測定した。 f3-actinおよ びCD3 ôの両方において、 これらのサイクル数でのPCRの噌'IJ国効率はプラトー相 に達しておらず、 またすべての症例において同じ増幅効率であることを確認した。

さらに5倍希釈系で希釈した cDNAのPCR産物は直線的に減少しており、

その 減少率は 症例問で同じであ った。 以上のように して、 ß-acÜ nあるいはCD3ô mRNA

のPCR

産物がすべての症例で等量になるように cDNA量を決定した。 各症例間 で サイトカイン mRNAの発現を比較検討するために、 この決定した cDNA量を

さらに 5倍希釈系で希釈し、 表lに示して いる各サイトカインのプライマーを用 いて 33サイクル増幅を行った。 ハイブリダイゼーション後にオートラジオ グラフ

ィーを行い、 サイトカイン mRNAのPCR産物を検出した。 サイトカイン mRNA

の発現量の評価は 以下のように 行った。

一 最高濃度のcDNAを用いても 検出できなかったもの + 最高濃度のcDNAでのみ検出できたもの

++: 5倍希釈まで検出できたもの

+++:

25倍希釈まで検出できたもの

新鮮PBMCを患者より採取し、 ネガティブコントロールとして使用した。 また、

ポジティブコントロールとしては、採取した新鮮PBMCを50 Japan reference

(JR)

units/mlの組み替えヒトインタ一口イキンー2(reco mbinant interleukin-2: r1L-2)

(武田薬

品から供与)と10時1m] Phyto hemagglutinin (PHA)を加えた RP�I 1640 (Gibco、

Grand Island、 NY)培養液中で72時間刺激したものを用いた。

5. LSG 由来T細胞および導管上皮細胞株の樹lL.

LSGを細切して得られた単核球(lX 102個)と50

Gy照射した同一症例の

PBMC (2 X 105個)を、

96

_í'( U字底プレートを用いて 3TC、 5% CO、 気相下で 混合培養した。 陪養液としては、 10%ウシJl台児血清(HyClo ne、 Lo gan、 UT)、 2m�

L-グルタミン、 50 U/mlペニシリンおよび50時Imlストレ プトマイシン(以上、

Gibco、Gland Island、NY)を含むRPMI 1640を用い、 50JR units/ml r且-2と10�tg/ml PHAを添加した。 その後、 50 JR units/ml rLL-2を一週間毎に加えて

T細胞株のtH

17を 行った。 また、

LSG導管|二皮細胞株は大

倉らのノJ法(29)に従い、 _LSGを

32pで忠良識した各インターナルプローブ(表2)を加 にサザンブロットを行った。

Dulbecco's modified

5010 CO今 気相|ごで培養した。培養液としては、

細切した後 370C、

オ ートラジオ グラフイ

18時間の ハイブリダイゼ ーションを行い、

500C、

東京)を1

:

9に えて、

MO)とMCDB153 (極東製薬、

St. Louis、

E agle's medium (Sigma、

HTLV-I感染T細胞株である 定量化を行うために、

一後放射活性を測定した。

10 mMデキ 1 mg/mlインシュリン(Sigma)、

25 mM HEPES (和光純薬)、

混合し、

コピーのHTLV-Iフ。口/て

MT-2細胞はl細胞 あたり 2.5

MT-2細胞を使用した。

Hogo)を添加したものを 10 ng/mlヒト EGF(Earth Chemical 、

(Sigma)、

サメタゾン

DNA

から増l隔し この細胞の ゲノム

を有してお り 、 イラル DNAおよびß-globin

LSG導管上皮細胞 プレートに付着している増殖した細胞のみを継代し、

用 いた。

たf3-g10binおよびpXDNAより標準|曲線を作製し、各症例の LSG中の l細胞あ 株を樹立した。

たりのコピー数を算出した。

HTLV-Iフロノミイラノレ

in situ

_PCR ハイブ リ夕、イゼー ション 法による

DNA の検出 HTLV-Iフ。ロノミイラjレ

PCR t去による

6.

7. DNA

トリス酢 10 m恥f

LSGおよびPBMCから抽出したゲノムDNA(1/23量)に、

0.10/0 Triton X-1 00

の検出 1.5 mM塩化マグネシウム、

50mM塩化カリウム、

峻( pH9

.0)、

各症例の LSGのパラフィン切片( 5μm)をキシレン(和光純薬)の中で650C、

25 U/ml Taq DNAポリメラーゼ、 0.4 0.2 mM dNTP、

を含んだPCR反応緩衝液、

11分間 10 mglml proteinase

|時間インキュベー卜して、脱パラフィンした後、

3TC、

pX領域に特異的なセンスプライマーおよび

pol、 env、

mM HTLV-1の各gag、

CA)、

Palo Alto、

1 U Taq start抗体( ClonTech Labolatories、

Kで処理した。 次いで、

コントロー ルとして 。ー

また、

を行った。

アンチセンスフライマーを加えてPCR

50 nM pXおよび

200 � dNTP、

10 � 10X反応緩衝液、

lU Taqポリメラーゼ、

globinを用いた。 使用したプライマー は過去に報告され たものを用い(9)、 その塩

in situ PCR には に特異的プライマーを切片上に添加し増|幅を行った。

。-globin

PCRにはDNAサ←マルサイクラ ーを用い、反応

に示している 。 基配列を表2

UK)

を用い、

Cambridge、

Techne、

flat-type DNAサーマルサイクラー( PHC-3

�

550Cで60秒間の

denaturati onステッフ、

で60秒間の

940C

条件としては、

550Cで120秒 denaturationステッフ、

940Cで60秒間の 反応条件としては、

30

720Cで90秒間の extensionステッフをlサイクルとし、

annealingステップ 、

720Cで90秒間の extensionステッフをlサイクルと 間の annealingステップ 、

NYTRAN-Nメンブレン 1.8%アガロースゲル上で電気泳動し、

サイクル増幅後に

( BRL Life Hybridization System

1n Situ

30サイクル行った 。 次いで、

し、 計

HTLV-IプロバイラルDNA解析に用いたプライマーおよびプローブの塩基配列

表2

Technologies、 Gaitherburg、

MD)を用いてハイブリ夕、イゼーションを行った。 プロ

束京)を用い、

5' 末端に Terminal deoxynucleotidyl transferase (住友化学、

ビオチン化 dUTP 一ブ は、

塩基配ヲIJ

(5'→3')

CGACCGCCCCGGGGGTGGCCGCT

を標識した pXおよび。-globin インターナル プローブを使用し

GGTACTGCAGGAGGTCTTGGAGG

。

た

CTTCACAGTCTCTACTGTGC CGGCAGTTCTGTGACAGGG CTCGAGCCCTCTATACCATG

TCRVß鎖遺伝子のレパトア解析

GGATCCTAGGGTGGGAACAG

8.

サイトカイン mRNA発現の解析と同様のPCR反応緩衝液に 0.2mM dNTP、

25 ATAGCAAACCGTCAAGCACAGG

0.4mMの各TCR これに cDNA(1/23量)、

U/ml Taq DNAボリメラーゼを添加し、

GAGCCGATAACGCGTCCATCG

Vf3に特異的なセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを加えて PCR

を

CGGATACCCAGTCTACGT

ACACAACTGTGTTCACTAGC

そのja基配 行った。 使用したブライマーは過去に報告されたものを用い(20、

30)、

GGAAAATAG GACCAATAG GCAG

gagセンス

gagアンチセンス polセンス

polアンチセンス envセンス

envアンチセンス pXセンス

pXアンチセンス

pXインターナルプローブ ß-globinセンス

ß-globinアンチセンス

ß-globinインターナルプロープ フライマー

GAAGTTGGTGGTGAGGCCCT

列を表3に示している 。 PCRには DNAサーマルサイクラーを用い、 反応条件 としては、 950Cで1分間の denaturationステッフ 、 550Cで1分間の annealing ステップ 、 720Cで1分間の extensionステップをlサイクルとし、 24サイクル

以後の 3サイクルごとにそれぞれの反応産物を10 �ずつ採取し、 18010アガロ ースゲ、ル上で電気泳動を行った後 、 NYT孔I\N-Nメンブレンにサザンブロットを行

表3 TCR遺伝子のレパトア解析に用いたプライマーおよびプローブの血基配列

プライマー

Vß1 Vß2 Vß3 Vß4 Vß5.1 Vß5.2-3 Vß6.1-3 Vß7

Vß8 Vß9 VßI0 Vß11 Vß12 Vß13.1 Vß13.2 Vß14 Vß15 Vß16 Vß17 Vß18 VfH9 Vß20

Cß アンチセンス Cßセンス

Cßアンチセンス

Cßインターナルプローブ

塩基配列(5'→3')

GCACAACAGTTCCCTGACTTGCAC TCATCAACCATGCAAGCCTGACCT GTCTCTTAGAGAGAAGAAGGAGCGC ACATATGAGAGTGGATTTGTCATT ATACTTCAGTGAGACACAGAGAAAC TTCCCTAACTATAGCTCTGAGCTG AGGCCTGAGGGATCCGTCTC CCTGAATGCCCCCAACAGCTCTC ATTTACTTTAACAACAACGTTCCG CCTん�TCTCCAGACAAAGCTCAC CTCC�CTCATCCTGTACC1寸 TCAACAGTCTCCAGAATAAGGACG AAAGGAGAAGTCTCAGAT

CAAGGAGAAGTCCCCAAT GGTGAGGGTACAACTGCC

GTCTCTCGAAAAGAGAAGAGGAAT AGTGTCTCTCGACAGGCACAGGCT AAAGAGTCTAAACAGGATGAGTCC CAGATAGTAAATGACTTTCAG

GGATGAGTCAGGAATGCCAAAGGAA CAATGCCCCAAGAACGCACCCTGC AGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTC TTCTGATGGCTCAAACAC

GTGTTTGAGCCATCAGAA

TCAGGCGGCTGCTCAGGCAGTA TTCTGATGGCTCAAACAC

った。 3�pで標識したTCR C[)のインターヲルフローブを加えて、 500C、 18時 間のハイブリダイゼーションを行い、 オートラジオグラフィー 後にFujiBAS 2000

バイオイメージアナライザー(富士フィルム )を用いて 各TCR Vß に特異的なバン ドの放射活性を測定した。 各サイクルにおける放射活性が指数関数的に増加してい

ることを確認して、 Kerckhoveらのβ法(31)に準じて % Vß を求めることにより、

各TCR Vßの PCR産物の相対量を決定した。 %Vß は以下の ような式にて算出し た。

100 x各Vßに特異的なバンドの放射活性

%Vß二

すべての Vßに特異的なバンドの放射活性の合計

9. TCR Vß鎖遺伝子のクロノタイプ解析

TCR Vß鎖遺伝子のクロノタイフ解析は山本らの方法(32)に従い、 PCR法お よびsingle-strand confonnation polymorphism (SSCP)法を用いた。 前述した材料と方 法に従って作製した各 Vß遺伝子ファミリーのPCR産物を95%ホルムアルデヒ ド 、 10 mMエチレンジアミン四酢酸(ethylendiaminetetraacetic acid: EDTA)、 0.1%

ブロムフェノールブルーおよび0.1%キシレンシ アノールを含む泳動緩衝液で希釈 した後、 900Cで2分間熱処理した。 その希釈した2μl DNAを10%グリセロー ル 含有非炎性4%ポリ アクリル アミドゲルにて 35

W、

250Cの一定条件下で約2

時間電気泳動した。 その後、 展開したDNAをImmobilon-Sメンブレン(Millipore Intertech、Bedford、 MA)にトランスファーした後 、 20X saline sodium phosphate EDTA (SSPE)、 50 X Denhali' sおよび10%

SDSを含むハイブリダイゼーション緩衝液に

ビ オ チ ン 化 TCR Cß イ ン タ ー ナ ル プ ロ ー ブ (5' -biotin-A(AC)AA(GC)G­

TGTTCCCGAGGTCGCTGTGTT -3')を加えてハイブリダイゼーションを行った。

420C、 16 1I寺間のハイブリダイゼーション後、メンブレンを480Cの 0.2^x

SSPE/0.5%

SDSで10分間洗浄し、

ス トレプ ト アビジン溶解液、 ビオチン化アルカリフォスフ

ァターゼ溶解液でJII買に各 5分間インキュベ ー卜した。 最後に chemiluminescent substrate system (Phototope-Star detection kit、 Biolab)で15分間インキュベーション してハイブリダイゼーションを完了し、 X線フィルム(New RX: 富

七

フィルム、

*京)に蕗光して、 解析を行った。

結 果

TCR遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定

10.

ssにおける!唾液腺病変と血清学的異常の解析

1. HTLV-I 関連

Tris-

20分間熱処理し メンブレンから 特定のバンドに一致した部分を切り出 し、

0.1 mM EDTA)で 800C、

EDTA溶液(10 mM Tris HCl (pH 8

.0)、

SSCP

各症例の

PCR法(36 サイクル )で再度DNAを増幅後、 PCR産 た。 その上清を用いて、

Microcon-pure (Amicon、 Beverly、

孔1A) 物を1.8%アガロー スゲルにて電気泳動し、

HTLV・I関連ssの臨床検査所見 ク口一二ングには TA cloningキット

により純化してクローニングに使用した。

HTLV-I+ SS 患者 11例 (表4)と idiopathic SS 患者 92例について臨床検査所見

患などを合併する 頻度はidiopathic SSの頻度 よりも高かった(HTLV-I十SS: 8/11例、

idiopathic SS: 48/92例 )(表4)。

HTLV-I+ SS患者における HAM/TSPやHAAPといった仙の自己免疫疾 の比較検討を行った。 症例 は両患者群ともすべて女性であり、 有意差はみられなか

口腔および眼乾燥症状などの臨床所見については、

ったが、

5-bromo-4-

Dye Tenllinator Foster City、

CA)で chloro・3-indolyl ß-D-galactosidase (X四Gal)を用いてプレート 上でスクリーニングを行

373A DNA sequencer (Applied Biosystems)を用いて塩基配列の決定を行つ クローニング したベクター は、

い、目的の遺伝子を含んだコロニーから プラスミド DNAを抽出後、

Cycle Sequencing FS Ready Reactionキット(AppliedBiosystems、

CA)を用いた。

San Diego、

(Invi trogen、

増幅し、 明らかな差異は両患者群聞にみられず、 すべての症例のLSGでおに特徴的な所

。

た

見である導管周囲のリンパ球浸潤とそれに付-随した腺組織の破壊がみられ、 耳下腺 75/92例 )で SS また、 以上のよ うな唾液腺病変に関する臨床的な

idiopathic SS

7/10 例 、

日垂液腺造影でも同様の頻度(HTLV-I+ SS に特徴的な点状陰影がみられた。

いずれのアミ

T CR 特

^異

的

^プロ

ー ブ ^に

^よる

疾患

^特

異性 ^の 解析

SS患者のTCR Vß7遺伝子から得られたアミノ酸配列 QDXG(X

11.

両患者群聞に明らかな差異はみられなか いしは組織学的な障害の程度についても、

フ。ロ ーブ(5' -TGYGCCAGCAGC-

CASSQDXG

を含むビオチン化 ノ酸で も可)

った。 さらに、血清学的検査においても、各種免疫グ口ブ リン (immunogloblin: Ig)濃 QDXG配列

N=A+G+T+C)を作製した。

Y=T+C、

RニA+G、

CARGA YNNNGGN-3'

抗SS-AlRo抗体、 抗SS- リウマチ因子、 抗核抗体 、

度(IgG、 IgA、 IgM)の上昇、

12個の核酸配列のうち11個以上相同な配列を有するもののみを検出できるよ

の

B/La

抗体などの各種自己抗体の陽性 頻度に差異はみられなかった(表5)。 これ ら

16時間に設定した( 結果は 示して ハイブリダイゼーションの条件を600C、

うに、 HTLV-I+ SS患者およびidíopathic SS患者の臨床検査所見には明ら

かな差異はみられず、 類似した唾液腺病変と血清学的異常を示すことが分かった。

の結果から 、 SSCPメンブレンを上記の条件下でこのプローブを用いてハイ

いない)。 各症例の

前述のキ ットを用いて解析を行った。

ブリダイゼーション後、

のl

唾液 ⁾ 操内浸潤リ

ン^パ球の ^サ

ブ

^セッ

ト

^および ^サ

イト

^カ

イ

HTLV-I関連ss ン産生能の解析

2.

P ^< 0.05の場合を有意とした。

統計

統計処理には Student' s t検定を用い、

12.

同患者群におけ

HTLV-I関連SS

の唾液腺病変をさらに詳しく解析 するために、

る LSG内浸潤リンパ球のサブセットおよびサイトカイン mRNAの発現について 比較検討を行った。 表6にそれぞれの細胞表面マー カーを発現する細胞の割合を

CD20 I場性B細胞 HTLV-I関連SSのLSG内浸潤リンパ球は、

示している。

たま

大部分が

TCRαß陽性であった。

CD4陽性

に比べてCD3陽性T細胞が優位であり、

5%未jlliの時'i{支球がCD25

HTLV-I+ SS患者における血清学的見常の頻度目 NM}(] 寸tc {内)凸 寸んυ白 表5

門15υ町内白(払)寸一門〈N〈

ゐ〈 Cコ

、。l/)

HTLV-I+ SS患者(n=11) 検査項目

。 十

Idiopathic SS患者(n=92)

(N{)寸寸∞(川)Nm∞(弘一)mm〈(ふ)寸N〈

(87%) 80192

(82%) 9/11

IgGの上昇

mv，出口NM{(】

+ + 七く r、、

r--­、、。

<0

(37%) 34/92

(45%) 5/11

IgAの上昇

(43%) 40/92

(27%) 3/11

IgMの上昇

凸Z一之ιυ白門-

+

o 。

，...

\。 ゐ〈

σ\ 、rョ

(63%) 58/92

(36%) 4/11

リウマチ因子

(92%) 85/92

(l00%)

ハU

IE』 a，，，，，，

ハU

IEA

抗核抗体

凸Z。

+ 工

+ ゐ〈 v)

。。 ザ可

(25%) 23/92

(22%) 抗DNA抗体 2/9

(57%) 52/92

(67%) 6/9

抗ss-DNA抗体 凸Z

+ + 七く 。。

r、、 r、、

(11 %) 10192

(0%) 0/9

抗ds-DNA抗体

(68%) 63/92

(82%) 9/11

抗SS-A/Ro抗体

(20%) 1 8/92

(9%) ]/11

抗SS-B/La抗体

(0%) 白 している。

州民宿駆畑区一，〉」ト工一〔一〈〈

一主υ(NN)mm凶(NN)寸的白

(C})甲山一〈

昨崎区制

mco

-co A同区Q申出口マ己〈工

十|

七く 「、』

寸市V\。

(内)トσ。{門)凸

(川)ご記。

門出口門\タυ

(的)Nm∞

(C寸)一甲山出(

(岱一)一円〈 岱)寸N〈

三〈エ

0/92

a IgG、 IgA、 IgMにおいては各々1800 mg/dl、 430 mg/dl、 230 mg/dl以上を異常とし、

己抗体においては検出された場合を異常とし、 表には異常を示した患者の頻度(%)を示 (100%)

11111 抗HTLV-I 抗体

総蛭川字紙、村一三ι

寸ぴ凸-co ∞げ一(一寸出。

一是/υ(NN)寸m∞

(全)寸N〈

主〈エ

+ +

I

c z

ヤ〈 叫〉

七く

Cコ、。

寸一川

、n

内σcmmtQ 小出口

E5υ (hu)門的国

(甲乙am∞

寸門〈

N〈

己〈〈ご

+ +

。

U勺

ゐく 、f可

。、ç-'ì てオ

これらの所見はidiopathic SS患者20例の結果(20) およびCD69陽性であった。

と一致していた。

の発現をPCR法により解析した。

mRNA

LSGにおけるサイトカイン

次に、

I 2

^L

-

、 Thlサイトカインである

HTLV-I+ SS患者6例のうち、

表7に示すように、

またIL- ßは^l 検 TNF-αが5症イダuでみられ、

IL-6、

IFN-yやTGF-ßが全症がuで、

これらの傾向はidiopathic SS患者]5例に 4症例でみられた。

索した5例のうち

ω附臨川区制十丈回同盟、釈医

… υ

∞己

出塁件畑区一z〉」トご一三〈

ç-<"可

門出。寸l出口

ト注υ

(mu )Nm 国

(O寸)C甲山凶門市川〈

ご〈

ι〈〈二

十+ ヤ〈 o

。、l/) r、』

ト内)凸(ゆ)寸一ピ(]寸出凸ト〉〉υ{託/υ小川口以(NN)川町∞(C一)巾VN〈(ふ)寸一円〈

。ェιJIJ1Z E〈工

+

ゐ〈 r、

、。

ぽ~佐川畑

盤、送醤Q

(黒公生/

部のidiopathic SS患 しかしながら、

共通してみられた結果と一致していた(19)。

HTLV-

IL-] 0やIL-12は、

IL-5、

IL-4、

Th2サイトカインである 者でみられる

1+ SS 患者ではほとんど検出されなかった。

LSGの組織学的所見、

以上の結果より、 両患者群には、臨床検査所見だけでなく

舵hM寸前年一凸工 の発現にも明らかな足異はなかっ

mRNA

リンパ球サブセットおよびサイトカイン

FJUMニドJt袋一白Z

トャhm口oh/ヘ〈ピ-

凶民主如

h-三回)眠症護馬町長

黒公20

巴剖Z一(吉区)

齢、刻印町EN禁制=

EEC-\一E)ムμ門小寸'R

惇船、

山∞ニ，〉」

ト

ロミ

母4 寸 h追川守

�

に類似したもの とい

SSそのものが悲起されていることが強く示唆された。

HTLV-I

感染患者でみられる唾液JJ泉病変は

SS

たことから、

うよりは、

表6 円TLV-l+ SS 患者のLSG内浸潤リンパ球のサブセットα

症例番号 ldiopathic SS患者

表面マーカー

2 4 6 7 8

_{平均値(11=6)}

(n=20)

C03 79.0 67.5 91.8 93.5 54.4 75.4 76.91: 14.8

71.3土17.5

C020 2l. 0 32.5 8.2 6.5 45.6 24.6 23.1+ 14.8 18.2+ 12.8

C04 47.7 45.5 49.6 6 0.3 42.9 52.6 49.81: 6.1

45.7土13.1

トー\.D

CD8 31.3 22.0 42.2 33.2 1 1.5 22.8

27.2士10.7

18.81: 8.4

TCRαf3 78.3 66.3 87.5 89.8 52.9 72.9 74.6 1: 13.8 73.21: 11.0

C025 2.2 0.8 3.5 1.3 2.6 1.6 2.0+ 1.0 1.0+ 0.7

CD69 2.4 4.6 1.9 1.6 1.6 1.2

2.7士1.1

1.5+ 0.9

。各種表面マーカーの陽性細胞率(%)を示している。

表7 HTLV-I+ SS 患者のLSGにおけるサイトカインmRNAの発現α

症例番号

Idiopathic

SS患者

2 4 6 7

発現率(11=6)

(11=15)

TL-2 + + +

^十

+

十

6/6 (1000/0) 15/15 (100%)

TFN-y

++ + ++ +++

十+

++ _{6/6 (1000/0)} 15/15 (100010)

IL-4 0/6 (0 % ) 8/15 (53%)

IL-5 0/6 (0%) 6/15 (40%)

IL-

J 0 +

_J

/6 _(160/0) 15/15 (1000/0)

t....:>

o

IL-6

十 十十

+

十 十+

_{5/6 (830/0)} 15/15 (1000/0)

1L-12 0/6 (00/0) 8/15 (530/0)

TGF

ß ++

十+

+ ++

十+ +十+

6/6 (1000/0) 15/15 (100%)

1L-

Jß

十 十十 十++

_NDh

十+

4/5 (800/0) 15/15 (100%)

TNFIα

++

十

+

+

+ 5 / 6 (830/0) 12/15 (80%)

a

Iし2、IFN-y、 !レ4 、IL-5 、IL-I0についてはC03õ、IL-6、IL-12、 TGFß、lレ1

ß、 TNF-αについては十actinの PCR産物が等量になるように調整したcDNAをさらに5倍希釈して、 各サイトカインのフライマーを用いて増

!隔、 ハイブリダイゼーションを行った。

b NO:検索を行っていない。

11. HTLV-I関連ssにおける唾液腺内 HTLV-Iフロパイラル DNAの検出

1. PCR 1去による HTLV-IプロバイラルDNAの検出

HTLV-I感染がどのよう に SSの発症に関与しているのかを明らか にする目的で、

HTLV-I+ SS患者の唾液腺内 にHTLV-IプロパイラルDNAが検出できるかどうか を検討した。 まず、 LSGからゲノムDNAを抽出し、 HTLV-Iの各gag、pol、e17V、

pX領域をPCRで増幅したところ、 検出したHTLV-I+ SS患者5例の全例 におい て、 gαg、 pol、 env、 pX領域のすべてのバンドが検出できた(図] )。 これらの塩 基配列は、 MT2細胞から得られたHTLV-I遺伝子と同ーのものであった(結果は 示していない)0

idiopathic

SS 患者20例でも同様の検索を行ったところ、 全例で gag、 pol、 ωv領域のバンドは検出できなかったが、 pX領域 については5例でバ ンドが検出できた。これらの結果は、 pX領域のバンドが認められたというMariette ら(33)や住田ら(34)の報告と同様であった。

2. in situ PCRハイブリダイゼーション法に よる HTLV-Iプロバ イ ラ ル

DNAの局在の解析

nÆ液腺組織中に HTLV-IプロバイラルDNAが検出されたが、 次にHTLV-Iが 感染しているのはどの細胞なのかを検討するため に、

in

s

i

tu PCRハイブリダイゼ ーション法を用いてLSGの切片におけるHTLV-IフロバイラルDNAの局在を調

べた。 m SlωPCRハイブリダイゼーション法では、 l細胞あたりわず、か 2 コピ

ーの標的DNAでも検出可能であった(図2

c、 e

[ß-globin])o HTLV-I+

SS 患者に

おけるLSG内のHTLV-Iプロバイラル DNAの局在を図2 に示している。 形態 学的に判断すると、

HTLV-IプロバイラルDNAは導管周囲に浸潤しているほと

んどのリンパ球の核内で検出されたが、 腺房や導管上皮細胞には検出されなかった (図2)0 LSGの連続切片の免疫組織学的解析と照らし合わせてみると、

HTLV-Iフ

ロバイラルDNAが検出された細胞のほとんどはCD3陽性T 細胞であり、 浸潤 リンパ球の50'"'-' 70%で検出された(図2 a、 b)。 それ に対して、

idiopathic

SS

J主

将のLSG内にはHTLV-IプロバイラルDNAは検山されなかった。

a

HTLV-I+ SS

I I

cd

pδ一

C

一

・唱

目

‘

E

Lu­-ELE a ­ PA­ o- ・ 1「 AU II

MT2 症例2 症例6 症例A 症例B ß-globin

gag

pol env

pX

b MT2

C::I一一一一I 1審事一

|-A時制 I

|

^一一

I

T 細胞

LSG

導管上皮細胞

11

2 3 4 5 6

pX

ß-globin

lt

^{•. j.�}

._< :::1 軍畠骨 量 軍 事 |

c

L1T2 PBMC

I I

10倍希釈系 症例番i%

10.1 lÕ2 lÕ3164 ₁

ル

_{g) 1} 2 ₄ 6 ₇

SG

|症例番可

pX

ß-globin

図1 H1LV-I+ SS患者におけるH1LV-IプロパイラルDNAの検出

a， H1L V-I+ SS患者5 例およびidiopathic SS患者20 例のLSGからゲノムDNAを抽 出し 、 H1LV-Iのgag、 pol、 env、 pX領域あるいはやglobinについて PCR法を用いて 解析した。H1LV-I感染MT2細胞 、 H1LV-I+ SS患者2例(症例2、 6)およびidiopathic SS患者2 例(症例A、B)の解析結果を示している。 b，H1L V-I+ SS患者2例(症例6、

10)のLSGより、

T

細胞株18株(症例6:11株、 症例1 0 :7株)と導管上皮細胞株2 株(各症例)を樹立した。 MT2細胞 、 T 細胞株7株(症例6: 5株 、 症例10 :2株)お よび導管ヒ皮細胞株2株の解析結果を示している。 c，H1L V-I+

SS患者5

例(症例l、

2、4、6、7)のPBMCおよびLSG におけるH1LV-IプロパイラルDNAの半定量的PCR の結果を示している。 との解析で得られたHl工V-Iウイルス量の結果は表8 に示して いる。 実験方法は 、 材料と方法 に記述している。 (参考文献1 より引用)

("1

b

e

図2

H1L

V-I+ SS患者のLSGにおける HτLV-IプロバイラルDNAの局伝

a，

LSGでは、 導管周囲にリンパ球浸潤がみられる。 (HE染色: X190) b，浸潤リ ンパ球のほとんどはCD3+

T

細胞である

。(抗 CD

3抗体による免疫組織学的染色:

X220)

cおよびe，

LSG内のすべての細胞核はß-globin陽性である。(in situ PCR ハイブリダイゼーション法)

dおよびf，

H1L V-IプロパイラルDNAは浸潤リン

パ球のほとんどで検出されるが、 導管上皮細胞(矢印)あるいは腺房細胞(矢じり) では検出されない。 (X300: c・f.)使用した連続切片は同一部位から作製した。 H1LV-

1+ SS患者5例において検索を行い、 図には代表的な症例3の結果を示している。

実験方法は材料と方法に示している。

(参考文献1より引用)

3. r唾液JJ忠由来の T細胞株および上皮細胞株における HTLV-Iブロバイラ

ルDNA の検出

組織レベルの解析でHTLV-IプロバイラルDNAがHTLV-I+ SS患者の唾液腺 内浸潤リンパ球で検出されたことから、 さらに細胞レベルでこれを証明するために、

唾液腺組織から細胞株を樹立して解析を行った。 HTLV-I+ SS患者2例のLSGか らT細胞株および上皮細胞株を樹立し、 これらの細胞株のHTLV-Iプロバイラル

DNAをPCR法で解析した。 LSGから計18株のT 細胞株が樹立でき、 これら のすべてにおいてHTLV-IプロバイラルDNAが検出された(図1)。 またLSGか ら2つの上皮細胞株が樹立できたが、 これらの細胞株ではHTLV-Iフロバイラル DNAは検出されなかった。

4. HTLV-I+ SS患

者

のl唾液

腺と

末梢血にお

け る

H T L V -I

ウ

イ ル

ス量の

解 析

さらに、 HTLV-I感染T細胞由来のMT-2細胞株を用いて、 HTLV-I+ SS患 者のLSGとPBMCとの間でHTLV-Iウイルス量を比較検討した。 この細胞のゲ ノムDNAから増幅したß-globin およびpXDNAより標準曲線を作製し、 各症例 のLSG中のl細胞あたりのHTLV-IプロパイラルDNAのコピー数を算出して

解析した。 HTLV-I+ SS患者5例すべてにおいて、 LSGおよびPBMCでHTLV-I

プロバイラルDNAが検出でき、 そのHTLV-Iウイルス量はLSGではPBMCよ りも8.32"--'8.68^X 103倍多いということが示された(表8)。

以上の結果より、 HTLV-I+

SS患者ではHTLV-I感染T細胞が唾液腺内に集積

し、 SS発症に関与している可能性が示唆された。

表8 HT LV-l+ SS患者のLSGおよびPBMCにおけるHTLV-1ウイルス量。

PBMC LSG LSG:PBMCb

2

症例番号

4 6 7

1.91 X 104 9.77 X 10" 5.76 X 104 5 38 X J()4 9.80 X l()

5. ()O X 1 06 8. 13 X 1 05 1 .52 X ₁ ()O 3 . 10 X H)O 8.51 X 1()5 2.61 X 10" 8.32 2.64 X 10 5.76 X 10 8.68 X ](戸

。HTLV-Iウイルス量の評価方法は材料と方法に記述している" HTLV-Iウイルス量はl時DNA中 のH1工V-IフロバイラルDNAのコヒー数を示す

h LSGおよびPBMCにおけるHTLV-Jウイルス量山比率を示しているじ (参考文献lより引用)

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T細胞の特異性の解析 ssにおける唾液腺内浸潤

111. HTLV-I関連

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TCR Vß遺伝子のレパ

0\

ssにおける唾液腺内浸潤 I細胞の

HTLV-I関連

。。

ト、

トア解析

HTLV-I+ SS患者のLSG内の浸潤リンバ球は、

idiopathic SS患者と同様にCD4 \。

SSの発症機序を考える上でこれらのT細胞のクロー vì

陽性T細胞が主体であり、

RT-PCR法 てT

そこで、 最初に ナリティーを調べることは重要であると考えられる。

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TCR Vß遺伝子

を用いてHTLV-I+ SS患者7例のLSGおよびPBMCにおける

過去に報告したidiopathic SS患者20例(20)と比較検討 のレパトア解析を行い、

図3に代表的なHTLV-I+ SS患者(症例6)のオートラジオグラフと

%Vß

解析の結果を示しており、

した。

すべての症例の結果を表9に示している。

Vß families

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18 19 20 10 11 12 13.1 13.2 14 15 16 17

9 8 7 4 5.1 5.2 6

LSG

2

PBMC

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2

図LSG 口PBMC

%Vß

16 14

10 12

8 6 4

。

b

H1LV・I+ SS患者(症例6)のLSGおよびPBMCにおけるTCR Vß遺 伝子のレパトア解析 a，各Vß遺伝子ファミリーのPCR産物のオートラジオ グラフの結果を示している。 PCR法により増幅したPCR産物(27サイクル) アガロースゲルにて電気泳動し、 それをメンブレンにトランスファー した後、 32pで標識したCßプローブでハイブリダイゼーションを行った。(詳細 は材料と方法に記述) b， LSGおよびPBMCにおける各Vß遺伝子ファミリ

20 19 18 16 17 15 12 13.1 13.2 14 11

Vß families

10 9 7 8

6 5.1 5.2 3 4

図3

1.8%

を

�

方法は材料と方法に記述している。

ーの%Vßの結果を示している。 算 (参考文献2より引用)