カラスノエンドウ種子の遊離糖類と青酸配糖体ビシアニンについて I. 遊離糖類とその粉砕種子の加温による変化-香川大学学術情報リポジトリ

カラスノエンドウ種子の遊離糖類と青酸配糖体ピンアニンについて Ⅰ．．遊離糖類とその粉砕種子の加温による変化

笠井 忠，藤田 修＊，川村信一郎＊＊

ON TI-I1;: FREE SUGARS AND CYANOGENIC GLYCOSIDE IN THE SEED

OFlm A〃Gこ塔77FOLん4VAR．5EGgmエエS

I．Freesugarsandtheirchangesbyincubationofhomogenateoftheseeds

TadasiKASAI，OsamuFuJITAandSin，itiroKAWAMURA

ThesecdofViciaangu！liPliaLVar．！egeiali‡KochcontainedonlyO”066％reducingsugarand626％totalsugaron

drybasis，WhendeteIminedafterextractionwith80％ethanolandwater“Thesesugarcontentsweresimilartoother

legumeseeds・Howcver，SaCCharose andα−galactosylsacぐharoscs were absentThe mainfiecsugarswere tetraq

andpentasaccharides，andthelatterwaspresumedtoconsistofgalactoseandglucoseresiduesinmolarratioof4：1

Incubatior）OfthcscedhomogenatecauseddecreaseinhigheroligosaccharidesandrcmaTkab】cincreaseingalactose

andlesscrincreaseinothcrmonosaccharides（glucose，arabinosc，andxylose）1WhcnthcincubationtimewasshoIt

thcreappcaredadisaccharide，prObablyvicianoseor6−（βl・L−arabinosyl）−D−glucoselThecrudecnzymesolutioncata− 1yzedthedegradationofmaltose）melibiose〉1actose）ra抗nose）andstachyosc）butdidnotcatalyzethatofsaccharose・ Theidentificationofsugarswasmadebypaper，thinlayer）andgaschomatographies カラスノエンドウ種子の遊離糖は他の豆類同様に全糖6．26％，還元糖0066％であったがショ糖やラフイノース， スタキか−・スをどは検出されなかった この遊離糖は四糖類および五糖類と思われる高級少糖類がその主な成分であった．この五糖類はグルコー・ス，ガラ クトー・ス（1：4）で構成されていると考えられた． この種子をインキエペ、−卜することで高級少糖類が減少し、グルコ・−ス，ガテクトーース，アラビノ・−ス，キシロー スなどが増加した．また早期にはビシアノー・スと思われる二糖類が生成した小 棒子・より抽出した粗酵素液はマルトース，メリビオ・−ス，ラクトー・ス，ラフイノ・−ス，スタキオーー・スなどを分解し たがショ糖は分解しなかった 緒 p 豆類の種子には少糖類としてショ糖（Sac）やラフイノース（Raf），スタキストース（Sta），ベルパスコ1−Pス（Ver） のようなガラクトシルサッカロースが含まれているこのような少糖類は食用の豆類（1￣8）だけでなく多くの野生の豆 科植物その他の種子にもみられ（小潮豆類に共通した成分とも考えられる、このガラクトシルサッカロース，Raf， Sta，VerはそれぞれSacのグルコース（GIc）残基側にα一1，6一結合のガラクトー・ス（Gal）が卜3個順次結合したも のである．豆科植物カラスノエンドウ（Ⅵ最−αα喝比ざf節点αL．VaI∴ざ聯fα友sKoch）（ヤハズエンドウともいう）の 種子には青酸配糖体ビシアニンの存在が古くから知られ，家畜の飼料として大盈に会されると有事であるとされて いる．（7）ビシアニンの糖部はビシアノース（Vic）と呼ばれ，GIcにα−1，6一アラピノース（AI・a）が結合した二糖頬で ある．（8・9）このようをVicはゲイン（Gein，Geumsp）とビオ・ルチン（Violutin，Violaspl）の構成糖としても知ら叫 ている．（10〉しかし他の豆煩にはをくカラスノエンドウに特異的と思われるので遊離糖とともに調べた． ＊現在勤務先：束横食品株式会社（川崎市港の口） ＊＊現在勤務先：香川県明善短期大学（高松市亀岡町）

香川大学農学部学術報告 第32巻 第2号（19飢） 104 実 験 方 法 カラスノエンドウの種子は1971年5，6月に本学部周辺に自生しているものをつるごと採取し，そのまま風乾して 種子を採集したい 糖類の抽出 種子を粉砕（32メッシュ．）してエ1−テルで脱脂後田主ら（1）の方法により，80％ェタノ・−ル，水で抽 出し除タンパク，脱塩後濃縮して糖液を得た， ペ・−・パークロマトグラフイ−（PPC）東洋炉紙No51（20×400mm）（分離）またはNo小54（400×400mm） （分取），展開剃刀「ブタノ・−・ル，離乳 水（4：1：2）またはゴ和一プロピルアルコ・−ル，おrトブチルアルコ・−リレ，花− プチルアルコ・−ル，水（4：2：2：2）を用い上昇法で2−3回展開し，発色剤♪−アニシジン塩酸塩（11）または硝酸銀一 水酸化ナトリウム（12）を用いて糖類を検出した．また一部発色によりスポット相当部を切り取り水で溶出分取した・ セファデックスG−15カラムクロマトグラフィ1−（G−15CC）カラム（6×960mm）に糖液を添加し水で流出した・ 各フラクションは1けOmJとし，その単蕊についてフェノール硫酸法（18）により吸光度を測定した− 蒋層クロマトグラ・7イ・−（TLC）糖液をワコ1−ゲルB−10の滞屑（0．．25×200×200rnm）に添若し，クロロホルム， メタノー・ル（6：4）で上昇展開，ヨウ素またはクーアニシジン塩酸塩で発色した．またスポット相当部をかき取り80 ％エタノールで抽出分取した． 分取糖類の加水分解とその構成糖の同定 PPCまたはG−15CCで分敬した糖披を1％または0。1％塩酸濃度とし 沸騰湯浴申で30分間加熱して加水分解の後，水酸化ナトリウムで中和後潰縮乾閲した．これを少量の水に溶かし SAINI（14）の方法によってビリジンで糖を抽出しPPC，TLC，ガスクロ・・7トグラフイー（GLC）などで調べた小 ガスクロマトグラ・7イ1− ビリジンで抽出した塘液をBROBSTら（15）の方法によりTMS化して行をった．GLCは 日立K−23型，FID，カラム：10％SE−30，ChIOmOSOrbWAW，80−100メッシュ（3mmxlm），165◇C定温または2 ％SE−52，ChromosorbGAW，80−100メyシコ．（3mmxlm），1400C定温によった． 粉砕種子の加湿 種子を32メッシュに粉砕する．この15gに水150mgを・加えてホモジナイザ・−・でホモジナ・イズし， トルコトール数滴を加え350Cでインキヱ．ベ・−トす−る．この間ときどき投拝し，24時間おきに10mJずつとり，遠心分 離の上澄液を前述の方法で池縮，ビリジン抽出し，PPC，TLC，GLCをどで調べた．インキ131ベートは3日間行ない 種子中に共存する酵素作用による糖類の変化を調べた．べつに種子粉末にその7倍盈の水を加えてホモジナイズし， その遠心分離（15，000×G）上澄液を40C，2日間水で透析した．これを粗酵素液としてその1／2盈の1％少糖類標品を 加えて300Cで6時間インキュ．ベー・卜し生成する単糖類をGLCで調べたい 実験結果および考察 豆類完熟種子ではたいてい還元糖はあまりなく微盈の単糖類が検出されるのみで，SacやRaf，Staのようを非還 元性少糖類が含まれている。（巨8〉抽出糖液について全糖としで7．ェノ・−ル硫酸法（13）で，還元糖をSoMOGYI法（18）で それぞれGIcを標準として測定すると6126および0066％（絶乾盈）であったこの還元糖としての催は非常に小さ くソラマメ（Ⅵc去αみあα）に似ている。（1）この糖液のPPCではFig・1に示したように−・般の豆類とは異なっている Rf僅から標品と対比して，単糖タ（GIc，マンノl−ス（Man）），＝．糖類（Sac，・・？ルトース（Mal）），四糖類（sta）さら に五糖類に相当すると思われるM2，Mさ，D，T，Pの5つのスポットが認められた．スポットの大きさ，発色をどから 争て四，五糖類相当のT，Pが主盈ををすものと考えられる．これらのスポットのうちRfが標品と一・致しているの はM2のGIcで，Dは二糖類と思われるが，Sac，Mal，メリビか−ス（Mel）などとは異なるいTもStaに近いか一 致していない G−15，CCによる抽出糖液の分離はFig．．2に示す。このフラクションをさらにPPC，TLCをどでみた結果単一・のス ポットを示したのはフラクション16∼2寧mJの区分（Pc）で24−28mg区分には他にかすかなスポット，．29−34mJ区 分には明確な二つのスポットがみられた．この16−23mg区分はFigい1のスポットPに相当した＝ また大豆少糖類 のG−15CCのVer（17）とほほ同じ流出位置にあるので分子畳もこれ古と近いものと考えられた 東洋折紙No．514を用いてスポットT，Pを分取して得た糖液を1％塩酸濃度で加水分解し生成した単糖類のGLC の結果をFig．3，4に示す．TからはAra，キシロース（Ⅹyl），Gal，GIcが検出され，PではGal，GIcと微塵のⅩylが

、 ＼ − 丁；： 1Ta M。；； ヽヽ．■ M2 ；■■■； ′一■、 M3 1t M2 annose−−・￣r 二二￣∴￣＿丁こ D ご ＿■rMaltose一−−−

O D

Meユibiose一斗一＿ −←Raffinose

JStachyose

r

勿 T

p ．＿ FTeeSugaT Rf Freesugar inseeds Rf Standard in seeds sugars

Fig．1Paper ChromatogramsoffieeSugarSinseeds

SoIvent system：n−Butanol，Acetic acid，Water（4：1：2）（A）ori50−Propyl alcohol，leri−Butylalcohol，n−Butanol，Water（4：2：2：2）（B），aSCendingmethod （triple），Stainingreagcnt：P−Anisidine−HCl（A）orAgNO8q−NaOH（B） へ∈UO等︶d．〇 10 20 30 Effluentvolume（ml）

Fig2 SephadcxG−15columnchTOmatOgramOffieesugarsinsceds

Thesugarsolution（015ml）waspouredintoSephadexG−15column（6×960 mm），elutedwithwater，and collectedinffaCtionoflm［Eachfねctionwas testedbyphenol−Sulfhricacidmethod 検出された．このFig，3，4でGal，GIcのピークはいずれも同様を形とをっている．Gal，GIc標品の浪合割合（4： 1）のGLCがFig．5に示すようにFig3，4と同じようなGal，GIcピ・−・ク形とな：った．このことからTやPのGal， GIc割合は4：1と考えられる，さきのG−15CCで推測される分子盈からみて，．PがGal，GIc、（4：1）で構成されて いるとして説明できる．しかしTについては説明できない，近似のRf値をもった混合物とも考えられる G−15CC流出16」23￣ml一区分（Pc）を0．1％塩酸濃度で加水分解したもめのPPCをFig．6に示すrスフ好」y￣トのRf 億の小さいものから順に番号で示すと，1，2はFig．1のP，Tに相当する．5，6はそれぞれGal，GIcに相当t，た 3，4は加水分解で新に生成した二糖頸と思われ，4がDに相当した カラスノエンドウの笹子の配糖体の糖部はVicで種子を傷つけると種子中の酵素ビシアナーゼにより Vicを遊触

香川大学農学部学術報告 第32巻 第2号（1981）

106

翳uOd笥Jh苫旨UU出

10 20

Retentiontime（min）

Fig．3Gas−1iquid chIOmatOgram Of TMS derivativcs of hydrolyzate fiom thc Separatedsuga工（T）byPPC

Column：10％SE−30Chromosorb W AW，3mmxlm，Stainless steel， COluntemperature：1650C むSuOds巴JむでJOUむ出 30 20 10 Retentiontime（min） Fig”4Gas−1iquidchromatogramofTMSderivativesofhydrolyzatefkOmthcscpa− ratedsugar（P）byPPC

ColumnandtcmperaturcarethcsamcasshowninFig3

することが知られている（7）ことから粉砕種子のインキ．ユベ・−ト（加温）による糖の変化を調べたFig7にみられ るように24時間のインキュベーションで大きく変り，Fig“1にみられた主盈のP，Tのスポットは大きく減少した． DやMl（Gal）が顕著に見られ，M2（GIc），M8（Ara），M4（Ⅹyl）の明確なスポットが現われた．またこれのTLCに よるヨウ素発色では，糖発色剤で発色しないスポットⅩ，Ⅴがみられた（Fig．8）．このⅤは単糖類よりもRf億が大 きく，糖発色剤で発色しないことなどからビシアニンと思われる18）がⅩについては不明である．この笹子のインキ コ．ベーションによってスポソトDが顕著にをること，Rfからみて二糖顆に対応することをどからVicと考えられる のでこれについてさらに調べた ここで得られる糖液をTLC分故によ，り■Dの糖液を集め，1％塩酸で加水分解Lその構成糖を調べた．そのGLC の結果せFig．，9に示す．，このGLCによってDはGIcとAraからをり，GLCピークの形は標品のGIc；Ar早（1：1） 混合物のGLCピークと同形とをることからもVicと思われた 種子そのままのインキェ．ベpトとは別に，この種子の抽出粗酵素液とMal，Sac，Mel，テクトー・ス（Lac），Raf，Sta

おuOa巴一名レOUむ出

20

Retentionstime（min） 10

Fig5Gas−1iquid chromatogram ofTMS derivatives of GIc and Galmixture

（l：4） ColumnandtempcraturearcthesameasshowninFig小3・ ミニ；M4 ご：） M3

0 M2

愈ご・こ・ Ⅹylose − Ⅹylose − ATabinose− Arabinose＿ Glucose 一− Galactose一一 Glucose − Galactose− Maltose hlaltose ＿． Melibiose−

Melibiose − Raffinose − Stachyose■−

Raffinose−． Stachyose・− で：〕’r ：⊃ P Standard SugarS ExtIaCted SugarノS Standard SugarS

Fig”7．Papcr chromatogram ofextracted SugarSfiomincubatedhomogenate ofseeds Fig、6．Paperchromatogramofpartialhydrolyzate 丘omthcseparatedsugar（Pc）bySephadcx G−15CC SoIventsystem：n−Butanol，Aceticacid，Water（4：

PPCmethodisthesameasshowninFig‖6

l：2），a＄Cending method（twice），Staining reagcnt： P−Anisidine−HCl のそれぞれをインキエペー・卜し，そのとき生成する単糖類をGLCで調べた．その結果Tablelにみられるよ・うに Sacのみが分解されをかった．この結果種子にはα−D−グルコシダーゼ（E．，C．3，2，1，20），α−，およびβ−r）−ガラクト シダーゼ（EC3，2，1，22／23）あるいはβ−L．・−アラピノシダーゼ（EC3，2，1，88）（ビシアナーゼ）などが存在し，グル コインベルクーゼは存在しをいも甲と考えられるりSac残革をもつRafやStaかちもFi■uを遊離しないことからβ− D−フルクトシダーゼ（EC3，2，1，26）もをいものと考える．．この種子にインベルクーゼあるいはβ−D−フルクートシダ ーゼが存在しないことはこれらの基質としてのSacやRafをどが含まれをいことと考え合わせればその必要がをい ものとして理解できる．

香川大学農学部学術報告 第32巻 第2号（拍81） 108

o g M3＿4−Arabin。Se

⊂〉 ⊂）M2 ￣GIucose

O⊂）Ml−Galactose

08 ーだ 一・Maltose 一￣Melibiose

0 0 D

04 −・Raffinose −・Stachyose Standard SugaT−S Fig．8．Thin）aycrchromatogramofextractcdsugars丈i10mincubatedhomogenateofsceds Plate：WakogelBJO（200×200×Oh25mm），SOIventsystem：Chlorofbrm，Methanol（6：4），aSCending method（twice），Stainingreagent：P−Anisidine−HCl（A）orIodine（B） 翳已Od駅巴h層8む出 10 20 Retentiontime（min） Figh9Gas−1iquidchromatogramofTMSdcrivativesofhydroly2＝atefkOmthesepa− ratedsugar（D）byTLC

ColumnandtcmperaturearethcsameasshowninFig3

TablelDegradationofsugarsbycrudeenzymefiomseeds

Subst工ateS Produced monosaccharides

Maltose SaccharOSe Melibiose Lactose Ra伍nosc Stachy（プSe Glucose Glucose，Galactose Glucose，Galactose Galact。主e Galactose 壷prep由七dLbydialysisoftheextracth10mS6eds The crude en2ryme

wiihwatd・（7partstoIp左rtof■seeds）h’R畠actionmiⅩtureC6ntaining2ml enzymeandlmlsubstr・ate（1％sugar）wasincubatedfbr6hoursat300C

andtestedbyGLG

謝 辞 この研究を行なうにあたり貴重なこ助言をいただきました香川大学教授鈴木裕，同山本音良両先生に感謝いたしま す。 この研究の大要は日本鹿芸化学会関西・中部支部合同大会（昭和50年10月11日，奈良）において発表した．その後 の文献の一・部を追加してまとめた 文 献 PergamonPr・eSS（1965） （11）HouGH，L。andJoNES，J−K．N∴ 肋娩0（まsαγ1 あ0ゐγめ小αβ∽リ1，21（1962）

（12）TkEVELYAN，W E， PROGTER，DL．P． and HARRTSON，J．S．：入ゎれJrぞ，166，444（1950）

（13）DuBOIS，M．，GILLES，K。A小，HAMILrON，J．K。， REBERS，PA．and SMrTIす，F小：Anal．Cnem．，28， 350（1956）

（14）SAINI，AS：Jαγ0∽α晦小，24，484（1966）． （15）BRO】∋SLT，K．Mハ and LoT工，C。E．Jr：

αe桝け，43，35（1966） （16）SoMOGYJ，M∴ JβわエC施の花．，195，19（1952） （17）KASAT，TandKAWAMURA，S”：7セch”Bull．hc 4㌢よc＆喝α紺αび陀仏，18，9（1966） （18）笠井 忠，岸本雅夫，川村信一・郎：香川大鹿学報， 32，111（1981）． （1980年10月31日 受理） 引 用 （1）田主澄三，笠井 忠，川村信劇郎：栄養と食橙， 25，25（1972） （2）CERNING−BEROARD，，．andFtuATRE，A．：GヲTeal Cちβ椚．．，53，968（1976） （3）ScHWEIZER，T．F．，HoRMAN，Ⅰ．and Wi）RSCH，P．： J励去．釣od4㌢まc‖，29，148（1978） ヽ′ （4）STAN孟K，J，CERN÷，M．and PACÅK，Jh：77w αなosacchaTi（ねs，154，NewYork，AcademicPrIeSS （1965） （5）RE芯D，．J．S‖G∴ 一門α花王α，100，131（1971） （6）SIDDIqUI，Ⅰ．Rand WooD，P．J。：JSti。Food 卸・払，28，530（1977） （7）BERTRAND，G．and MAqUENN Rg乃d．月βあd，ぶeα乃CeSAcαdいぶcよ．，143，832（1906） （8）HERISSEY，H．and CHEYMOL，）．：乃id，181，565 （1925） （9）HERISSRY，H．andCI柑YMOl，J“：乃よd．，183，1307 （1926） （10）BAILRY，R．W∴ α如ざαCCんαγ∠dβ．ゞ，78，0Ⅹford，