2017 年 4 月 18 日受理 連絡責任者：寺石政義（[email protected]）
日本のイネコアコレクションにおける胚乳澱粉の鎖長分布の多様性と
澱粉生合成関連遺伝子の発現解析
東条由花・寺石政義・齊藤大樹・奥本 裕
京都大学大学院農学研究科（〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町） 要旨：米の澱粉は直鎖状のアミロースと分枝構造をもつアミロペクチンの 2 種類のグルコース重合体によって構 成されている . 澱粉の物理化学的特性は , アミロース含量だけでなくアミロペクチンの鎖長分布や構造に影響を受 けることが報告されている . 本研究では , 日本在来のイネコアコレクションを供試して澱粉の鎖長分布の多様性を 調べ , 澱粉生合成関連遺伝子（澱粉合成酵素 , 枝付け酵素 , 枝切り酵素）の発現との関連性の解明を目的とした . 鎖長分布の測定の結果 , ジャポニカ品種では大きく 3 タイプに分かれ，概して短鎖割合の高い品種が多かったが， インディカ品種では短鎖割合の低い品種が多かった . 澱粉の鎖長割合と遺伝子発現量を用いて主成分分析を行った ところ , 本実験で供試した品種では , 第一主成分で短鎖割合が 30% 以上のグループのみを分離することができた． しかしながら，他の 3 グループについてはグループごとに分離することなく何らかの傾向を見いだすことはでき なかった． 短鎖割合が低い品種グループは，澱粉生合成遺伝子の発現制御が品種によって異なることが示唆された． キーワード：澱粉，鎖長分布，アミロペクチン，澱粉生合成関連遺伝子緒言
米の澱粉は胚乳の 70％を占める主要な成分である．澱 粉は直鎖状のアミロースと分枝構造をもつアミロペクチン の 2 種類のグルコース重合体によって構成されている （Juliano et al．1981）．澱粉の 70% 以上を占めるアミロペク チンの鎖長分布や構造は，米の物理化学的特性に影響を与 える一因である（Umemoto et al．2008）．したがって，ア ミロペクチンの構造を制御するメカニズムを理解すること は，食味や加工適性の優れた特性を有する米品種の開発に 寄与する． 澱粉の生合成に関与する酵素として，澱粉合成酵素 （Starch Synthase，以下 SS とする），枝付け酵素（BranchingEnzyme， 以 下 BE と す る ）， 枝 切 り 酵 素（Debranching Enzyme，以下 DBE とする）があげられる．SS はα-1，4-グリコシド結合を直鎖状に伸長する働き，BE は分枝構造 を付加する働きおよび DBE は分枝部分のα-1，6-グリコ シド結合を加水分解し除去する働きをもつ（Smith et al． 1997，Nakamura 2002）．澱粉生合成酵素にはいくつかのア イソザイムが存在している．SS には GBSSI，SSI，SSIIa， SSIIIa など 11 種類のアイソザイム，BE には BEI，BEIIa， BEIIb の 3 種類のアイソザイム，DBE には ISA1，ISA2， PUL など 4 種類のアイソザイムが存在する． 澱粉生合成 酵素のアイソザイムはそれぞれに基質特異性を示す（Fujita 2014）． 本研究では，日本在来のイネコアコレクション（以下 JRC とする）を供試して，澱粉鎖長分布の多様性を調べ， 澱粉生合成関連遺伝子（SS，BE，ISA）の発現量との関連 性を明らかにすることを目的として実験を行った．
材料及び方法
植物材料 農業生物資源ジーンバンクより分譲された日本在来のイ ネコアコレクション 50 品種（以下 JRC とする，品種の情 報 に つ い て は https://www.gene.affrc.go.jp/databases-core_ collections_jr.php を参照）を供試した．2012 年 5 月 8 日に 播種し，2012 年 5 月 29 日に京都大学農学研究科附属京都 農場（北緯 35°01′，東経 135°47′）に株間 10cm，畝間 30cm で移植した．10a 当たり N:6kg，P:9kg，K:9kg を元肥 として移植前に全量施肥した．登熟してから系統ごとに収 穫した． 澱粉の抽出と精製 アルカリ法によって米澱粉の精製を行った（山本ら， 1973）．すなわち，2012 年に収穫した玄米 5 粒をマルチビー ズショッカーによって粉砕し，米粉の 5 倍量の 0.2%NaOH を加え 4℃で 3 時間撹拌を行った．澱粉を沈降させた後， 蒸留水を加えて撹拌し，遠心分離（10℃，1 分，3000rpm） 後，上清を除くことを 5 回繰り返した．次に 100% エタノー ルを加え遠心分離（10℃，1 分，3000rpm）後，上清を除き， 37℃で一晩乾燥させた． アミロペクチン鎖長分布の測定 乾燥した澱粉 5mg と蒸留水 5ml を試験管に加え 95℃で 30 分間加熱を行った．加熱後の澱粉溶液を室温まで冷ま し，600mM 酢酸ナトリウム 50μl およびイソアミラーゼ （Sigma 社 ）0.03μl を 加 え て，37 ℃ で 一 晩 反 応 さ せ た． 37 作物研究 62：37 − 40（2017）Copyright 近畿作物・育種研究会 （The Society of Crop Science and Breeding in Kinki, Japan）
60℃で 10 分間加熱を行って酵素を失活させ，2% 水酸化 ホウ素ナトリウム 150μl および 50% アンモニア 60μl を加 えて室温で一晩静置した．得られたサンプルについて，糖 分析イオンクロマトグラフィー（Dionex ICS-5000+ サー モフィッシャー社）および カラム PA-100 （サーモフィッ シャー社）を用いて分析を行った． 澱粉生合成酵素遺伝子の発現解析 2015 年に 2012 年と同じ圃場で同等の栽培環境にて JRC を栽培した．開花後 14 日目の胚乳から RNA を抽出した． 供試した品種は第 1 表に示した．RNA は RNA すいすい -S（ リ ー ゾ 社 ） を 用 い て 抽 出 し た． 得 ら れ た RNA は DNase 処理後，ReverTra Ace （Toyobo 社）を用いて cDNA に逆転写し，澱粉生合成酵素遺伝子（SSI，SSIIa，SSIIIa，
BEI，BEIIa，BEIIb，ISA1，ISA2） に つ い て SYBR Select
Master Mix （Applied Biosystems 社） を用いてリアルタイム PCR を行った．各遺伝子の発現量は ACT1 遺伝子発現量を 内部標準遺伝子として算出した．用いたプライマーの配列 は第 2 表に示した（She et al．2010）．RNA 抽出およびリ アルタイム PCR はそれぞれ 3 反復で行った． 第 1 表 澱粉生合成遺伝子の発現解析に用いた品種 JRC␒ྕ ရ✀ྡ Japonica/Indica DP6Ͳ10㙐㛗ྜ(%) 4 ᒣ⏣ Tropicaljaponica 41.1 20 ⣽⛩ Japonica 44.7 22 స Japonica 45.0 24 ୖᕞ Japonica 44.3 31 ட Japonica 28.5 41 ㉥⡿ Indica 22.7 42 ၈ᖸ Indica 23.3 43 ㉥⡿ Indica 14.8 48 ⴥෙ Japonica 21.8 51 ಙᕞ Japonica 20.9 52 ឡ▱᪫ Japonica 21.1 ᪥ᮏᬕ Japonica 41.4 第 2 表 発現解析に用いたプライマー 㑇ఏᏊ 䜰䜽䝉䝑䝅䝵䞁␒ྕ 䝣䜷䝽䞊䝗㓄ิ㻔㻡㻓䊻㻟㻓㻕 䝸䝞䞊䝇㓄ิ㻔㻡㻓䊻㻟㻓㻕
SSI AK109458 TCATGGATGTGAAGGAGCAA TGGCAGTGAACCACAAACAT
SSIIa AK101978 GATCGACCAGGATGACGATT GGGTAAAGCACCTGCAACAT SSIIIa AK061604 GCCTGCCCTGGACTACATTG GCAAACATATGTACACGGTTCTGG
BEI AK119436 GGCATTGCACTCCAAAAGAT GCTCCAGTTGTTGCCTTCTC
BEIIa AB023498 GCCAATGCCAGGAAGATGA GCGCAACATAGGATGGGTTT BEIIb D16201 ATGCTAGAGTTTGACCGC AGTGTGATGGATCCTGCC
ISA1 AB093426 TGCTCAGCTACTCCTCCATCATC AGGACCGCACAACTTCAACATA
ISA2 AC132483 TAGAGGTCCTCTTGGAGG AATCAGCTTCTGAGTCACCG
ACT1 AK100267 CCCTCCTGAAAGGAAGTACAGTGT GTCCGAAGAATTAGAAGCATTTCC
主成分分析 R （http://www.R-project.org） を用いて，アミロペクチン の鎖長分布および澱粉生合成遺伝子の発現量に対して主成 分分析を行った．鎖長分布の値として，測定で得られたグ ルコース重合度 2~5，6~10，11~15，16~20，21-25，26~30 および 31~34 の鎖長割合に分けた値を用いた．
結果および考察
アミロペクチンの鎖長分布の例（日本晴）を第 1 図に示 す．グルコース重合度 6~10 の短鎖部分はデンプン生合成 に関わるいくつかの酵素が作用することが報告されている （Fujita et al．2006 ）ことから，JRC 50 品種における重合 度 6 ∼ 10 の短鎖割合（Fr.）を調べた（第 2 図）．熱帯ジャ ポニカ品種では全て短鎖割合が高く，ジャポニカ品種では 短鎖割合が高い品種，低い品種および中程度の品種と 3 分 された．インディカ品種では 1 品種を除いて短鎖割合が低 か っ た．JRC の SSR マ ー カ ー 多 型 情 報（Ebana et al． 2008）やそれに基づいた系統樹（Ichitani et al．2016）が報 告されているが，ジャポニカ品種における鎖長分布の多様 性と品種間の類縁性との間に関連性を見いだすことはでき なかった． 㻜 㻞 㻠 㻢 㻤 㻞 㻠 㻢 㻤 㻝㻜 㻝㻞 㻝㻠 㻝㻢 㻝㻤 㻞㻜 㻞㻞 㻞㻠 㻞㻢 㻞㻤 㻟㻜 㻟㻞 㻟㻠 ┦ ᑐ ྜ 咁 䠂 咂 䜾䝹䝁䞊䝇㔜ྜᗘ 第 1 図 糖分析イオンクロマトグラフィーによるアミロペクチン 鎖長の検出 （品種：日本晴） 㔜ྜᗘ㻢㻙㻝㻜䛾ྜ 䠄䠂 䠅 第 2 図 日本在来コアコレクションにおけるグルコース重合度 6-10 の短鎖割合． 次 に JRC50 品 種 を 重 合 度 6~10 の 短 鎖 割 合 に 従 っ て Fr. ＜ 20%，20% ≦ Fr. ＜ 25%，25% ≦ Fr. ＜ 30% お よ び 30% ≦ Fr. の 4 グループに分類した．それぞれ のグループか ら，JRC43（Fr. ＜ 20%），JRC41，JRC42，JRC48，JRC51， JRC52 （20% ≦ Fr. ＜ 25%），JRC31 （25% ≦ Fr. ＜ 30%）お よび JRC4，JRC20，JRC22，JRC24，日本晴（30% ≦ Fr.） の 12 品種を供試して 8 つの澱粉生合成関連遺伝子の発現 解析を行った．複数品種を供試した 20% ≦ Fr. ＜ 25% と 30% ≦ Fr. のグループについて，グループごとに発現量の 平均値を算出して比較を行ったが，調査した 8 つの遺伝子 の発現量に有意差はなく，明瞭な差異を見いだすことは出 来なかった（第 3 図）．SSI 遺伝子内に TOS17 が挿入され た変異体解析から，SSI は短鎖を合成する機能をもつこと が報告されている（Fujita et al． 2006）．しかしながら，本 研究において JRC43（Fr. ＜ 20%）は，短鎖割合の低いに もかかわらず SSI の発現量が非常に高かった．今後，品種 数を増やして検証する必要がある． 作物研究 62 号（2017） 38,6$$&7 ,6$$&7 %(,,D$&7 66,,,D$&7 66,$&7 %(,,E$&7 %(,$&7 66,,D$&7 ᪥ᮏᬕ䛾Ⓨ⌧㔞䜢䠍䛸䛧䛯䛸䛝䛾┦ᑐ್䛷♧䛧䛯䠊䜶䝷䞊䝞䞊䛿ᶆ‽ㄗᕪ䜢♧䛩䠊 ▷㙐ྜ䠄䠂䠅 ┦ ᑐ Ⓨ ⌧ 㔞 第 3 図 登熟途中における澱粉生合成酵素遺伝子の発現量 鎖長割合および発現解析の結果を用いて主成分分析を 行った．第 1 主成分（約 49％）と第 2 主成分（約 27%） によって全体の約 76% の情報を説明することができた（第 4 図）．第 1 主成分は重合度 10 以下の鎖長割合の因子負荷 量が負であり，重合度 11 以上の鎖長割合の因子負荷量が 正であった．8 つの遺伝子発現量の因子負荷量もすべて正 であり，なかでも BEIIb と ISA2 の負荷量が大きかった． 第 2 主成分は，8 つの遺伝子発現量の因子負荷量がすべて 負であり，その中でも SSIIa，BEI，BEIIa，BEIIb および ISA1 の因子負荷量の値が大きかった． Ͳ4 Ͳ3 Ͳ2 Ͳ1 0 1 2 3 4 Ͳ5 Ͳ4 Ͳ3 Ͳ2 Ͳ1 0 1 2 3 4 ➨ 咇 ᡂ ศ -5& -5& -5& -5& -5& -5& -5& -5& -5& -5& -5& ᪥ᮏᬕ ➨䠍ᡂศ 䕔 䠖Fr.㸺20.0,䕦 䠖20.0ӌFr.㸺25.0,䕺 䠖25.0ӌFr.㸺30.0,㽢䠖30.0ӌFr. 第 4 図 アミロペクチン鎖長分布と澱粉生合成遺伝子発現量に関 する主成分分析 30.0% ≦ Fr. のグループに属する品種は他のグループに 属する品種と第 1 主成分によって分けることができた．し たがって，短鎖割合が高い品種は今回調査した 8 遺伝子の 発現が概して低いことが判明した．他の 3 グループに属す る品種は，第 1 象限および第 4 象限に分布していた．BE 3 種類および SSIIa の発現量は鎖長割合とは相関が低いこ とが示唆された．BE によって付加された側鎖が SSI や
SSIIa によって伸長される（Umemoto et al．2002，Fujita et al．2006）ことが報告されており，第 4 象限に属する品種 はそれに該当するが，第 1 象限に属する品種は BE の発現 が低いため，他の要因で長鎖の割合が高くなっていると考 えられた．短鎖割合が低い品種グループは，澱粉生合成遺 伝子の発現制御が品種によって異なることが示唆された． 今後は，RNA-seq のような網羅的な発現解析を行うことに よって，澱粉生合成に関与する遺伝子の発現制御の解明に 繋げていく．
謝辞
本研究の一部は，総合科学技術・イノベーション会議の SIP（戦略的イノベーション創造プログラム）「次世代農林 水産業創造技術」（管理法人：農研機構 生物系特定産業 技術研究支援センター，略称「生研センター」）によって 実施されました．本研究で用いたイネコアコレクションは， 農研機構 遺伝資源センターより分譲を受けました．引用文献
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Umemoto, T., M. Yano, H. Satoh, A. Shomura and Y. Nakamura
The Diversity of Starch Chain-length Distribution and Expression Analyses of
Genes Related to Starch Biosynthesis in Japanese Landrace Rice Core Collection
Yuka Tojo, Masayoshi Teraishi, Hiroki Saito, Yutaka Okumoto
Graduate School of Agriculture, Kyoto University (Kitashirakawa-oiwake, Sakyoku, Kyoto, 606-8501, Japan)
Summary：Rice starch is composed of linear amylose and branched amylopectin. The physicochemical properties of starch
are influenced by amylose content and amylopectin structure. In this study, we examined the diversity of the chain length distribution of amylopectin among NIAS rice core collection of Japanese landraces, and compared the expression level of genes related to starch biosynthesis (starch synthase, branching enzyme and debranching enzyme). The measurement of the chain length distribution showed that Japonica varieties were mainly three types and more than half of them had high proportions of short chain length while the Indica species low proportions. The principal component analysis of the chain length distribution and gene expression level revealed that those with high short chain proportion were divided from other three groups withi low short chain proportion. However, any tendency was not found to devide other three groups. It was suggested that there are some gene regulation pattern for starch synthesis among varieties with low short chain proportion.
Key Words：Starch, Amylopectin, Chain-length distribution, Rice Core Collection
Journal of Crop Research 62: 37-40 (2017) Correspondence: Masayoshi Teraishi ([email protected])
（2002） Mapping of a gene responsible for the difference in amylopectin structure between japonica-type and indica-type rice varieties. Theor. Appl. Genet. 104: 1-8.
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