untitled

バイオ医薬品の特性解析

バイオ医薬品の特性解析

ACQUITY UPLC

ACQUITY UPLC

®

®

SYNAPT

SYNAPT

TM

TM

_{G2 HDMS}

_{G2 HDMS}

TM

TM

日本ウォーターズ株式会社

日本ウォーターズ株式会社

ソリューションセンター

ソリューションセンター

©2010 Nihon Waters K.K.

日本薬学会第130年会併催 薬科機器展示会

新技術・新製品セミナー

2010/3/29 13:00-13:20

バイオ医薬品に適した

バイオ医薬品に適した

LC/MS

LC/MS

より複雑な分子の機器分析に求められるのは

Monoclonal Antibody

より高い解像度

＋

多様性

＋

データ解析能力

MW 6,000

Insulin

MW 34,000

EPO

MW 147,000

Aspirin

MW 180

サイズ＝複雑さ

バイオ医薬品に適した

バイオ医薬品に適した

LC/MS

LC/MS

ACQUITY UPLC

ACQUITY UPLC

®

®

_/SYNAPT

_/SYNAPT

TM

TM

_{G2 HDMS}

_{G2 HDMS}

TM

TM

©2010 Nihon Waters K.K. 3

ACQUITY UPLC

ACQUITY UPLC

®

®

_{とカラムテクノロジー}

_{とカラムテクノロジー}

HPLC

Speed

耐圧 ：

15,000 psi

システム容量 ：

120 µL

ACQUITY UPLC

ACQUITY UPLC

®

®

より質の高い

より質の高い

LC/MS

LC/MSデータ

データ

HPLC

HPLC

UPLC

®

Resolution

Sensitivity

=

UPLC

® ©2010 Nihon Waters K.K. 5

UPLC

®

Sensitivity

Better MS Data

Better MS Data

耐圧

20,000 psiのカラム充てん剤

Anal. Chem. 2003, 75, 6781-6788

U.S. Patent No. 6,686,035 B2

バイオ医薬品

バイオ医薬品

UPLC

UPLC

®

®

_カラム

_カラム

1.

UPLC

®

_{Amino Acid Analysis Solution}

標準物質による

2.

Peptide Separation Technology

3.

Oligonucleotide Separation Technology

標準物質による

厳しいQCチェック

4.

Protein Separation Technology

SYNAPT

SYNAPT

TM

TM

_HDMS

_HDMS

TM

TM

©2010 Nihon Waters K.K. 7

PITTCON 2007

SYNAPT

SYNAPT

TM

TM

_G2

_{G2 HDMS}

_HDMS

TM

TM

_システム

_システム

最先端の

Q-TOFに３つの独自機能を付加

・イオンモビリティ

・デュアルディソシエーション

MS

E

_{取込みモ ド}

世界初の

Q-TOFから10数年

高レベルに改善された基本性能

・

MS

E

_{取込みモード}

ESI ⇔ MALDI

簡易な切り替え

SYNAPT

SYNAPT

TM

TM

_G2

_G2

Q

Q--TOF

TOF性能

性能、

、

IMS

IMS性能

性能

9

高分解能

> 40,000 FWHM

9 ダイナミックレンジ

> 10

5

高分解能、高質量精度MS/MS、定量性

向上、高速データ取得率を提供する革新

的なハイブリッド四重極-飛行時間型MS

9 高質量精度

1 ppm RMS

9 UPLC

®

_{対応データ取得率}

20 spectra/sec

9 クラスリーディングの感度

©2010 Nihon Waters K.K. 9

高分解能、高質量精度、高効率IMSを

組み合わせた四重極-IMS-飛行時間型MS

9 従来の

4倍以上

のモビリティ分解能

9 IMS精密質量測定

9 ソフトウェアによって

衝突断面積情報

取得

9 構造解析に最適なTAPフラグメンテーション

多様なアプリケーションをサポートする

多様なアプリケーションをサポートする

解析ソフトウェア

解析ソフトウェア

SYNAPT

SYNAPT

TM

TM

_HDMS

_HDMS

TM

TM

_による

_による

抗体製剤分析ソリューション

抗体製剤分析ソリューション

©2010 Nihon Waters K.K. 11

インタクト

還元

ペプチド

アミノ酸

糖鎖・修飾

構造

抗体製剤の特性解析

抗体製剤の特性解析

ワークフロー

ワークフロー

- 分子量測定

- 不純物分析

- 糖鎖プロファイリング

- 補欠分子族の確認

- LC,HC分析

- 糖鎖プロファイリング

- ペプチドマッピング

- ペプチドシークエンス

- 培地由来の成分

- 末端アミノ酸

- 構成アミノ酸

- 修飾の確認/同定

酸化・脱アミド

etc

- S-S結合

- 糖組成

- 糖鎖構造

- 糖鎖立体構造

Goal

- 分子量測定

- 不純物分析

インタクト

還元

ペプチド

アミノ酸

糖鎖・修飾

構造

- LC,HC分析

- 糖鎖プロファイリング

- ペプチドマッピング

- ペプチドシークエンス

- 修飾の確認/同定

- 酸化・脱アミド etc

Ⅰ

Ⅰ．

．分子量測定、不純物分析、糖鎖プロファイリング

分子量測定、不純物分析、糖鎖プロファイリング

不純物分析

- 糖鎖プロファイリング

- 補欠分子族の確認

糖鎖プロファイリング

ペプチドシ クエンス

- 培地由来の成分

- 末端アミノ酸

- 構成アミノ酸

酸化 脱アミド

etc

- S-S結合

- 糖組成

- 糖鎖構造

- 糖鎖立体構造

Goal

Watersのソリューション

ƒ

インタクトタンパク専用LC/MSカラム

M

PREP

TM

_Mi

_D

_lti

_{C l}

©2010 Nihon Waters K.K. 13

—

MassPREP

TM

_{Micro Desalting Column}

—

Protein Separation Technology Column

ƒ

ロット間解析、デコンボリューションソフト

—

BiopharmaLynx

TM

—

MaxEnt1

インタクト

インタクト

IgG

IgG分析ワークフロー

分析ワークフロー

IgG製剤

軽鎖および重鎖

LC/MS

（脱塩カラム）

DTT還元

BiopharmaLynx

TM

_解析

分子量測定

ロット間比較

不純物分析

糖鎖プロファイリング

MassPREP

TM

_Desalting

Column :

ハイスループット

検体

3

モノクローナル抗体の高速オンライン脱塩

モノクローナル抗体の高速オンライン脱塩

LC/MS

LC/MS

+ 51

Charge state

Pre-run

Blank

TIC (0.0 – 3.0 min)

G0F/G1F

G1F/G1F

１検体 ＝

3 min

MaxEnt1 :

高精度デコンボリューションソフト

イオン強度の定量的解析

-S -S --S -S --S-S --S-S --S -S --S -S --S-S --S-S --S -S --S -S --S -S --S -S -S -S S S SS S S ( ) ( ) ( ) ( ) -S -S --S -S --S-S --S-S --S -S --S -S --S-S --S-S --S -S --S -S --S -S --S -S -S -S S S S S S S SS SS S S S S ( ) ( ) ( ) ( ) ©2010 Nihon Waters K.K. 15

0.5 µg

IgG1

Post-run

Blank

GOF/G0F

G0F/G2F

G1F/G2F

G0/GOF

G2F/G2F

Gal Fuc Man Fuc Gal Fuc Gal Fuc Man Fuc Man Fuc

BiopharmaLynx

BiopharmaLynx

TM

TM

_{によるインタクトタンパク解析}

_{によるインタクトタンパク解析}

BiopharmaLynx

TM

_:

ロット間比較

不純物検出

糖鎖プロファイリングの確認

- 分子量測定

- 不純物分析

インタクト

還元

ペプチド

アミノ酸

糖鎖・修飾

構造

- LC,HC分析

- 糖鎖プロファイリング

- ペプチドマッピング

- ペプチドシークエンス

- 修飾の確認/同定

- 酸化・脱アミド etc

Ⅱ

Ⅱ．

．アミノ酸、ペプチド、修飾

アミノ酸、ペプチド、修飾

etc

etc

不純物分析

- 糖鎖プロファイリング

- 補欠分子族の確認

糖鎖プロファイリング

ペプチドシ クエンス

- 培地由来の成分

- 末端アミノ酸

- 構成アミノ酸

酸化 脱アミド

etc

- S-S結合

- 糖組成

- 糖鎖構造

- 糖鎖立体構造

Goal

Watersのソリューション

ƒ

UPLC

®

_{AAA solution}

P

tid M

i

l ti

©2010 Nihon Waters K.K. 17

ƒ

Peptide Mapping solution

—

RapiGest

TM

_SF

—

Peptide separation technology column

—

MS

E

_{取り込みモード}

—

BiopharmaLynx

TM

_1.2

IgG製剤

ペプチドマッピングワークフロー

ペプチドマッピングワークフロー

ペプチド

LC/MS

（

PSTカラム）

トリプシン消化

BiopharmaLynx

TM

_解析

ペプチドカバレージマップ

ロット間比較

修飾ペプチド検索

修飾サイトの特定

6 0e 2 7.0e-2

90 min

HPLC 2.1 x 250 mm, 3.5 µ

Peptide Separation Technology

Peptide Separation Technology

8 0e 2 9.0e-2 1.0e-1 Time 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00 AU 1.0e-2 2.0e-2 3.0e-2 4.0e-2 5.0e-2 6.0e-2

55 min

UPLC

®

_{2.1 x 150 mm, 1.7 µ}

ƒ

Improved resolution

ƒ

Reduced run time

PST Column :

高速、高分離ペプチドマッピング

©2010 Nihon Waters K.K. 19 Time 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00 48.00 50.00 52.00 54.00 56.00 AU 2.0e-2 3.0e-2 4.0e-2 5.0e-2 6.0e-2 7.0e-2 8.0e-2

ƒ

TFA or Formic acid

ƒ

pH 1-12, High Temp

ƒ

Columns QC tested

with a peptide map

% G2 (M+H)+3 m/z 976.02 6 3 6 3

PST Column :

High Resolution Separation of

High Resolution Separation of

Glycopeptides by UPLC

Glycopeptides by UPLC

®

®

% 47.40 47.60 47.80 48.00 48.20 48.40 48.60 48.80 49.00 % 1 47.40 47.60 47.80 48.00 48.20 48.40 48.60 48.80 49.00 2 G1 (M+H)+3 m/z 922.00 G0 (M+H)+3 m/z 867.99 6 3 6 3 6 3 6 3 6 3 6 3 6 6

PST Column :

糖ペプチドの分離にも有効

Time 47.40 47.60 47.80 48.00 48.20 48.40 48.60 48.80 49.00 % 1 m/z 867.99 3 3

Mouse IgG glycoforms were detected using extracted mass chromatograms of the triply charged glycopeptides. The positional isomers of G1 have been separated by UPLC®.

BiopharmaLynx

BiopharmaLynx

TM

TM

_{によるペプチドマッピング解析}

_{によるペプチドマッピング解析}

©2010 Nihon Waters K.K. 21

BiopharmaLynx

TM

_:

ロット間比較

カバレージマップ

差クロマトグラム

修飾ペプチド解析

LC/MS

LC/MS

E

E

_{Data Acquisition}

_{Data Acquisition}

1 sec

MS

Precursor

Precursor

MS

E

Fragments

MS

E

_{取込みモード}

_:

情報のロスがない

LowEnergy ⇒ 質量情報

HighEnergy ⇒ 配列情報

BiopharmaLynx

BiopharmaLynx

TM

TM

_{1.2 :}

_{1.2 :}

フラグメントイオンによるペプチドアサイン機能

フラグメントイオンによるペプチドアサイン機能

©2010 Nihon Waters K.K. 23

BiopharmaLynx

TM

_{ver.1.2 :}

MS

E

_{データ対応}

フラグメントイオン（b/yイオン）による

より高確度な帰属

1.

1. Fragmentation patterns can be compared between analyses

Fragmentation patterns can be compared between analyses

2.

2. Potential alternative peptide assignments tested and selected

Potential alternative peptide assignments tested and selected

3.

3. Modifications can be assigned to specific residues

Modifications can be assigned to specific residues

BiopharmaLynx

BiopharmaLynx

TM

TM

_{1.2 :}

_{1.2 :}

アサインの確認

アサインの確認

BiopharmaLynx

TM

_{ver.1.2 :}

帰属根拠の確認には

１クリックでスペクトル画面へ

- 分子量測定

- 不純物分析

インタクト

還元

ペプチド

アミノ酸

糖鎖・修飾

構造

- LC,HC分析

- 糖鎖プロファイリング

- ペプチドマッピング

- ペプチドシークエンス

- 修飾の確認/同定

- 酸化・脱アミド etc

Ⅲ

Ⅲ．

．糖鎖

糖鎖

不純物分析

- 糖鎖プロファイリング

- 補欠分子族の確認

糖鎖プロファイリング

ペプチドシ クエンス

- 培地由来の成分

- 末端アミノ酸

- 構成アミノ酸

酸化 脱アミド

etc

- S-S結合

- 糖組成

- 糖鎖構造

- 糖鎖立体構造

Goal

Watersのソリューション

ƒ

LC/ESI/MSによるインタクトIgG測定

ƒ

IgGから糖鎖を切り出して測定

©2010 Nihon Waters K.K. 25

—

MassPREP

TM

_{Glycoanalysis Kit}

—

Glycan separation technology column

—

MALDI/MS

ƒ

糖ペプチドのサイト特定と定量的測定

—

BiopharmaLynx

TM

糖鎖解析ワークフロー

糖鎖解析ワークフロー

IgG製剤

糖ペプチド

& ペプチド

N-結合型糖鎖

2

ベル化

IgG(糖鎖なし)

PNGaseF

トリプシン

2-ABラベル化

LC/FLR/MS

(GSTカラム)

LC/MS

（脱塩カラム）

MALDI/MS

LC/MS

（

PSTカラム）

GST column :

ヒトIgGでメジャーな13糖鎖の

分離で

QCチェックしたカラム

Glycan

Glycan Separation Technology

Separation Technology

MassPREP

TM

_{Glycoanalysis kit :}

PNGaseFによる糖鎖切り出し

HILIC SPEでのクリーンアップ

MALDIマトリックス

©2010 Nihon Waters K.K. 27

5 pmol inj. ProZyme 2-AB IgG in 75-65% ACN 46G

22500.000 25000.000 27500.000 30000.000

090520_YAA026_ABC_ProIgG_02 (1) ACQUITY FLR ChA Ex330,Em420 nm Range: 30662 24.58 18.57 31.87 G0F _G1F G2F

FLR

GST

GSTカラムによる

カラムによる

2

2--AB

ABラベル化糖鎖の

ラベル化糖鎖の

LC/FLR/MS

LC/FLR/MS

10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00 E U x 10e 4 0.000 2500.000 5000.000 7500.000 10000.000 12500.000 15000.000 17500.000 20000.000 15.47 20.07 21.22 25.60 26.63 26.98 28.50 37.43 33.17 34.28 41.03

090520_YAA026_ABC_ProIgG_02 1: TOF MS ES+

BPI 77.8 24.56 G0 G1 Man6 Man5 G2FS1 G0FGN G1FGN

5 pmol inj. ProZyme 2-AB IgG in 75-65% ACN 46G

100

090520_YAA026_ABC_ProIgG_02 1047 (18.564) Cm (1038:1056) 1: TOF MS ES+

702

792.3

G2 G1FS1

Loss -15 Da of labeled glycans

GST column ：

高い糖鎖分離能

高感度蛍光検出

GST column ：

ESI/MSによる構造情報

% 18.55 31.85 25.57 40.48

BPI

% 758.2 792.8 1583.7 793.3 1380.6 793.8 1177.5 820.3840.3 1218.5 1381.6 1382.6 1584.7 1585.7 1586.6 (M+H)+ (M+2H)2+ Loss of GN

Loss -15 Da of labeled glycans

ESI/MSによる構造情報

GOF G1F A)

フリー糖鎖のMALDI/TOF

切出したフリー糖鎖の

切出したフリー糖鎖の

MALDI/MS

MALDI/MS

m/z 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 G2F GlcNAc GlcNAc Y1 B5 Y2 Y3 Y4 B2 Y5 B1 Y4/Y5

B)

質量情報：

高感度でシンプルなスペクトル

マイナー糖鎖も検出可能

©2010 Nihon Waters K.K. 29 m/z 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 Man Fuc Man Fuc B4 3 B3 B2 B1 Y4 B2 Y5 B1 (M+Na)+ B5 Y5 B4 B5/Y5 Y4 B5/Y5/Y5 B3/Y5 Y3 B2 B3/Y5/Y5 Y5/Y5 Y4/Y4 B5/Y5/Y4 Y2 B1 B5Y3

G0FのMALDI/Q-TOF

構造情報：

Q-TOFモードで

フラグメンテーションの確認

インタクト

還元

ペプチド

アミノ酸

糖鎖・修飾

構造

抗体製剤の特性解析

抗体製剤の特性解析

ワークフロー

ワークフロー

- 分子量測定

- 不純物分析

- 糖鎖プロファイリング

- 補欠分子族の確認

- LC,HC分析

- 糖鎖プロファイリング

- ペプチドマッピング

- ペプチドシークエンス

- 培地由来の成分

- 末端アミノ酸

- 構成アミノ酸

- 修飾の確認/同定

酸化・脱アミド

etc

- S-S結合

- 糖組成

- 糖鎖構造

- 糖鎖立体構造

Goal

あらゆる特性解析に対応可能

分析項目 UPLC®_分離 MS 検出器

Software Solution system 物理的化学的特性解析の分類ICHガイドライン Q6B

インタクトマス MassPREPTM_micro desalting column PrST column SYNAPT TM BiopharmaLynxTM MaxEntTM₁ 6.1.2 a) 分子量・分子サイズ 6.1.1 c) 末端アミノ酸配列

抗体分析のソリューション

抗体分析のソリューション

まとめ

まとめ

抗体 製剤評価

ペプチドマッピング PST column SYNAPT_TUV TMHDMSTM

BiopharmaLynxTM MaxEntTM₃ BioLynxTM DriftScopeTM 6.1.1 c) 末端アミノ酸配列 6.1.1 d) ペプチドマップ 6.1.1 e) スルフヒドリル基及びジスルフィド結合 6.1.1 f ) 糖組成・糖鎖構造 6.1.2 e) 液体クロマトグラフィパターン 6.2.2 a) 切断体 6.2.2 b) 切断体以外の分子変化体 アミノ酸組成 AccQ・Tag TM_Ultra BEH C18column SYNAPT

TM EmpowerTM MassLynxTM 6.1.1 b) アミノ酸組成 糖鎖解析 GST column SYNAPTTMHDMSTM FLR SimGlycan* DriftScopeTM 6.1.1 f) 糖組成・糖鎖構造 - MALDI/SYNAPTTM

糖組成 Amide column SYNAPT_FLR TM BioLynxTM

©2010 Nihon Waters K.K. 31

アグリゲーション、重合体 SEC, IEX TUV EmpowerTM_{, MassLynx}TM _{6.2.2 c) 凝集物}

HCP同定 nanoACQUITY 2D RP-RP TRIZAICTM SYNAPT TM _PLGS 6.2.1 a) 細胞基材に由来する不純物 6.2.1 b) 細胞培養液に由来する不純物 6.2.1 c) 細胞培養以降の工程に由来する不純物 HCP定量 nanoACQUITY _TRIZAICTM TQ Verify

E TargetLynxTM コンフォメーション、サブユニット - SYNAPT TMHDMSTM _DriftScopeTM 6.1.2 f) 分光学的性質 nanoACQUITY HDX*_SYNAPTTM -薬物動態 同定 PST column SYNAPTTM _PLGS 定量 PST column TQ Verify_TargetLynxE TM

SYNAPT

∼60merまでのピーク分離にてQCチェックしたカラム

①

①核酸医薬の

核酸医薬の

LC/MS

LC/MS分析

分析

UPLC

UPLC

®

®

_{によるオリゴヌクレオチドの分離}

_{によるオリゴヌクレオチドの分離}

ACQUITY

®

_{BEH OST C}

18

, 50 x 2.1 mm, 1.7 µm column

30-60 mer oligothymidine ladder, 0.2 mL/min

©2010 Nihon Waters K.K. 33

40T

0

minutes

8

50T

60T

UV 260 nm

移動相：

A: 15 mM TEA, 400 mM HFIP aq.

B: 50% Solvent A, 50% MeOH

①核酸医薬の

①核酸医薬の

LC/MS

LC/MS分析

分析

不純物分離

不純物分離

合成核酸よりも短い

short-mer不純物の高いピーク分離能

核酸LC/MSの

スタンダードメソッド

TIC MS

①

①核酸医薬

核酸医薬の

の

LC MS

LC MS分析

分析

ProMass for MassLynx

ProMass for MassLynx

TM

TM

_{ワークフロー}

_{ワークフロー}

Deconvolution

-3

-4

自動デコンボリューション

Deconvolution

-5

charged envelope parent MW

1) MassLynx

TM

_{と ProMass間での簡易なデータのやり取り}

2) バックグラウンド除去とピーク検出の全自動化

©2010 Nihon Waters K.K. 35

3) 設定されたシーケンスに基づくマススペクトルのピークアサイン

4) １塩基脱離の適切なアサイン

5) 結果のレポートフォーマット化

自動ピーク検出

①核酸医薬の

①核酸医薬の

LC MS

LC MS分析

分析

ProMass

ProMass for MassLynx

for MassLynx

TM

TM

_結果表示

_結果表示

検出されたピーク情報をテーブルに表示

保持時間、質量数、イオン強度、シーケンス

分析項目

UPLC

®

_分離

MS

検出器

Software

Solution system

分子量 修飾確認

OST column

HFIP/TEA（1本鎖）

SYNAPT

TM

MaxEnt

TM

₁

ProMass

核酸分析のソリューション

核酸分析のソリューション

まとめ

まとめ

核酸

製剤評価

分子量、修飾確認

OST column

Ammonium bicarbonate（２本鎖）

SYNAPT

TM

MaxEnt

TM

₁

ProMass

配列確認

OST column

SYNAPT

TM

MaxEnt

TM

3

Spreadsheet

*

-

MALDI/SYNAPT

TM

不純物解析

OST column

SYNAPT

_TUV

TM

ProMass

PEG化核酸

(MassPREP

TM

_{desalting column)}

SYNAPT

TM

HDMS

TM

MaxEnt

TM

₁

BiopharmLynx

TM

©2010 Nihon Waters K.K. 37

PEG化核酸

(MassPREP

desalting column)

_{(charge stripping)}

BiopharmLynx

DriftScope

TM

コンフォメーション、衝突断面積

-

SYNAPT

TM

_HDMS

TM

_DriftScope

TM

薬物動態

同定

OST column

SYNAPT

TM

_ProMass

定量

OST column

BEH C

18

1.0mm column

nanoACQUITY UPLC

®

(TRIZAIC

TM

₎

SYNAPT

TM

_QuanLynx

TM

総括

総括

バイオ医薬分析のためのトータルソリューション

バイオ医薬分析のためのトータルソリューション

ACQUITY UPLC

®

カラムテクノロジー

SYNAPT

TM

_{G2 HDMS}

TM

アプリケーションマネージャ

Xevo

TM

_{QTof MS}

一般ポスター発表

一般ポスター発表

Q

Q--Tof

Tofを用いたバイオ医薬品の特性解析

を用いたバイオ医薬品の特性解析

1.

UPLC

®

_{/MSを用いた遺伝子組換えIgGの糖鎖の定量}

2

Nano UPLC

®

_{/MSを用いたIgGのペプチドマッピング}

2.

Nano UPLC

®

_{/MSを用いたIgGのペプチドマッピング}

3.

イオンモビリティを用いたリガンド結合タンパクの構造変化の解析

4.

UPLC

®

_{/イオンモビリティTofを用いた糖ペプチドの定性および定量的解析}

5.

UPLC

®

_{/MSおよびUPLC}

®

_/MS

E

_{を用いた核酸製剤の迅速な特性および配列}

©2010 Nihon Waters K.K. 39

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ブース番号

45