764中 村 澄 子,岡 留 博 司,與 座 宏 一,原 口 和 朋,奥 西 智 哉,鈴 木 啓 太 郎,佐 藤 光,大 坪 研 一 〔Nippon Nogeikagaku Kaishi
報 文 〔Nippon Noeikagaku Kaishi Vol. 78, No.8, pp. 764∼779, 2004〕
PCR法
に よ る世 界 の 広 範 な特 性 の 米 の識 別 お よ び 食 味 要 因 の 探 索
中村澄子,岡 留博司,與 座宏一,原 田和朋,奥 西智哉,鈴 木啓太郎,佐 藤
光*,大 坪研一
(独立行政法人食品総合研究所,*九 州大学大学院農学研究院
平成16年3月11日
受理
Differentiation
and search for palatability-factors
of world-wide rice grains by PCR method
Sumiko NAKAMURA,
Hiroshi OKADOME,
Koh-ichi YOZA, Kazutomo
HARAGUCHI,
Tomoya OKUNISHI,
Keitaro SUZUKI, Hikaru SATOH,* and Ken'ichi OHTSUBO
National Food Research Institute, Kan-nondai, Tsukuba, Ibaraki 305-8642, Japan
*Faculty of Agriculture , Graduate School, Kyushu University, Hakozaki, Higasi-ku, Fukuoka 812-8581, Japan
It is well known
that rice palatability
is affected
by variety
or cultivar
and variety
characteristics
are mainly
determined
by DNA structure.
In this paper, palatability
estimation
method for rice grains was investigated
using
PCR primers
accumulated
for cultivar
identification
and novel primers
developed
by the relationship
with starch
properties
or protein
compositions.
(1) It was shown that the proliferated
DNAs by PCR, using the primers
related
with granule
bound starch
synthase
(GBSS), soluble
starch
synthase
(SSS), branching
enzyme
(BE), and debranching
enzyme
(DBE), revealed
the
marked
differences
between
japonica
and indica
subspecies
of rice,
It seems
to be plausible
that
the main
component
of rice grains
is starch.
(2) A part of DNA sequences
of glutelin
gene was shown to be different
between
japonica
and indica subspecies
as
a results of PCR using glutelin-related
and prolamin-related
primers.
(3) For the purpose
of numerizing
the results
of PCR, discriminative
DNA bands were binarized
as 0 (disappeared)
or 1 (appeared)
and were subjected
to the multiple
regression
analysis.
Palatability
estimation
equations
were
developed
using
above
mentioned
independent
variables
based
on the results
of PCR against
the dependent
variables
related
with the palatability
factors,
such as amylose
content,
protein
content,
adhesiveness
of cooked
rice grains,
and consistency
of rice flours.
These equations
showed
multiple
regression
coefficients
of 0.92, 0.81,
0.93, and 0.84 for the calibration.
Validation
tests were carried
out against
the different
rice samples
and it
revealed
the adaptability
of these estimation
equations.
(Received
March
11, 2004)
Key words:
rice; palatability;
DNA analysis;
PCR; multiple
regression
analysis
序
論
米 の 食 味 に 品種 が 強 く影 響 す る こ とは よ く知 られ て い る
が,品 種 特 性 はDNAに
よ って規 定 さ れ る た め, DNAに
着
目 した 食 味 評 価 や 食 味 推 定 は意 味 が あ る も の と考 え ら れ
る.特 に,育 種 に お け る良 食 味 系 統 の選 抜,流 通 加 工 段 階
で の原 料 米 の 評 価,ま
た ご く少 量 の 試 料 に よ る鑑 定 や,貿
易 で の検 査 の よ うに,評 価 に 時 間 を か け られ な い場 合 に,
当 該 試 料 米 の 特 性 を推 定 す る に は,DNAに
基 づ く方 法 が
必 要 と され る.
米 の主 成 分 は デ ンプ ンで あ る.デ
ンプ ンの 特 徴 は米 の
品質 特 性 に 強 くか か わ って お り,米 飯 の物 理 特 性,例 え ば 硬
さや 粘 りに 強 く影 響 す る、 これ ま で は,デ
ンプ ンの ア ミロ
ー ス 含 量 が 最 も強 く特 性 に影 響 す る と さ れ て お り1)
,粳
の
特 徴 で あ る ア ミロ ー ス の 形 成 に お い て,顆 粒 結 合 型 デ ンプ
ン合 成 酵 素GBSS(granule bound starch synthase)が ア ミ ロ ー ス 形 成 に 深 くか か わ っ て い る と さ れ て い る .デ ン プ ン の 主 要 構 成 成 分 で あ る ア ミ ロ ペ ク チ ン は,α-1 ,4一グ リ コ シ ド結 合 で 分 子 鎖 を 伸 長 す る 可 溶 性 デ ン プ ン 合 成 酵 素 (soluble starch synthase;SSS)と, α-1,6-グ リ コ シ ド結 合 を 形 成 し て 枝 を っ け る 枝 作 り 酵 素(branching gnzyme; BE)と,さ ら に α-1,6-グ リ コ シ ド結 合 を 切 断 す る 枝 切 り酵 素(debranching enzyme:DBE)が 総 合 的 に 働 い て 合 成 さ れ る2),3).米 は イ ン ド型 と 日 本 型 の2種 類 の 亜 種 に 分 類 さ れ,そ の デ ン プ ン特 性 も大 き く 異 な っ て い る .Babaら は イ ネ のSSS遺 伝 子 を ク ロ ーニン グ し て そ の 構 造 を 明 ら か に し て い る4)。中 村 ら はSSSIIaが イ ン ド型 米 と 日 本 型 米 と の ア ル カ リ崩 壊 性 の 相 違 に か か わ っ て い る こ と を 報 告 して い る5).本 研 究 で は,SSS , BE, DBEな ど,デ ン プ ン合 成 に か か わ る と 予 想 さ れ る 各 種 の 酵 素 に 関 係 す るPCR用 プ ラ (44)
Vol.78, No.8,2004〕 広 範 な 米 の 食 味 要 因765
イマ ーを 設 計 し,試 料 米 か ら調 製 した鋳 型DNAを
用 い て
PCRを
行 い,デ
ンプ ン特 性 か ら米 の 分 類 や 食 味 推 定 を 行
う可 能 性 につ いて 検 討 を加 え た.
ま た,米 の 食 味 に は,タ
ンパ ク質 含 量 も深 くか か わ っ て
お り,山 下 と藤 本6)や石 間 ら7)によ って,タ
ンパ ク質 含量 と
食 味 との 間 に負 の 相 関 の あ る こ とが報告 され て い る.さ
ら
に,最 近 で は,タ
ンパ ク質 の 総 量 の み な らず,グ
ル テ リ ン
やプ ロ ラ ミ ンな ど の タ ンパ ク質 の組 成 も米 品 質 に影 響 す る
ことが増 村 ・田 中 らに よ って報 告8)さ れ て い る.そ
こで,
本 研究 で は米 の主 要 貯 蔵 タ ンパ ク質 で あ る グル テ リンや プ
ロラ ミンに関 係 す る プ ライ マ ー を探 索 し,タ
ンパ ク質 の点
か ら米 を分 類 した り,食 味 特 性 の 推 定 を 行 う可 能 性 に つ い
て も検 討 を加 え た.
筆者 らは,こ れ ま で に,PCR法
に よ る米 の 品 種 判 別 技 術
に関 す る研 究 を行 い,RAPD法
やSTS化
プ ラ イ マ ー に よ
るPCRに
よ って わ が 国 の 作 付 け面 積 上 位 の 米 や 餅 の 原 料
米の 品種 判 別 を行 って きた9),10).さらに,各 種 のSTS化
プ
ライマ ー を組 み 合 わ せ て極 良 食 味 米 で あ る コ シ ヒカ リを 他
品種 と識 別 す る プ ライ マ ー セ ッ トを 開 発 して きた11).そ の
過 程 で,PCRに
お い て良 食 味 米 に共 通 して 出 現 す るDNA
バ ン ドや食 味 の比 較 的 劣 る米 に特 有 に 出現 す るDNAバ
ン
ドの存 在 す る こ と に気 づ い た.前 述 の よ うに,品 種 が 食 味
に影 響 す る重 要 な要 因 で あ る こ と と も考 え 併 せ,PCR法
によ るDNA食
味判 別 の 可 能 性 に つ い て 検 討 し,日 本 型 の
国内産 米 を対 象 に,官 能 検 査 結 果 や 米 飯 物 性 測 定 値 に 対 す
るDNA推
定 式 を作 成 し,未 知 試 料 へ の 適 用 性 に っ いて も
検討 を行 い,そ の 結 果 を報 告 して き た12)、しか し,こ の 方
法 で は,日 本 の主 要 な 米 を 試 料 と して 推 定 式 を作 成 した た
め,世 界 の広 範 な米 に は適 用 が 困 難 で あ る.ま た,使 用 す
るプ ライ マ ーお よ び増 幅 す るDNAの
意 味 が 明 らか で は な
いため,実 用 的 意 味 は あ る もの の ,食 味や米飯物性 とPCR
で増 幅 したDNAと
の関 係 が考 察 で きな い,分
子 育種 へ の
適用 が困 難 で あ る と い う問 題 が 残 さ れ て いた.イ
ネ ゲ ノ ム
研究が 進 展 し,日 本 晴 の全 ゲ ノ ム塩 基 配 列 が 決 定 さ れ た.
しか し各 種 の 米 の 食 味 特 性 を 遺 伝 子 レ ベ ル で推 定 す る に
は,品 種 間 の 微 妙 な配 列 の差 異 と食 味 特 性 の 相 違 と の 関 係
を調 べ る必 要 が あ る、 ま た米 の 食 味 要 因 と して デ ンプ ンの
ア ミロ ー ス含 量 と タ ンパ ク質 含量 が 重 視 され て い る が1)最
近 で はア ミロペ クチ ン鎖 長 分 布 に関 係 す る各 種 の デ ンプ ン
合成酵 素 の影 響 も調 べ る必 要 が あ る5).
本研 究 で は,イ
ン ド型,日 本 型 を含 む世 界 の 広 範 な特 性
の米 のDNAを
抽 出 して鋳 型 と し、 上 記 の デ ンプ ン関 連 お
よび タ ンパ ク質 関 連 の プ ラ イ マ ーを 含 む各 種 の プ ライ マ ー
を用 いてPCRを
行 い,増 幅 す るDNAの
多 型 を もと に,①
イ ン ド型米 と8本 型 米 の 識 別,②
デ ンプ ン関 連 酵 素 遺 伝 子
や タ ンパ ク 質 関 連 遺 伝 子 に よ る 品 種 系 統 の 識 別,③ 米 の 食 味 に か か わ る 諸 要 因(ア ミ ロ ー ス 含 量,タ ン パ ク 質 含 量, 精 米 粉 糊 化 特 性 値,お よ び 米 飯 付 着 量 な ど)の 推 定 な ど に 関 す る 検 討 を 行 っ た.そ の 結 果,世 界 の 広 範 な 特 性 の 米 の 識 別 に 有 用 な プ ラ イ マ ー や 米 飯 物 性,米 粉 糊 化 特 性 な ど と 深 くか か わ っ て い る プ ラ イ マ ー が 見 い だ さ れ,世 界 の 広 範 な 特 性 の 米 の グ ル ー プ 分 け やPCR法 に よ る 成 分 ・特 性 の 推 定 の 可 能 性 が 示 さ れ た の で 報 告 す る. 試 料 お よ び 実 験 方 法 1.試 料 米 試 料 は,温 帯 ジ ャ ポニ カ と し て,台 中65号,Sweet Rice,滋 賀 羽 二 重 も ち,こ が ね も ち,は く ち ょ う も ち,ヒ ノ ヒ カ リ,ひ と め ぼ れ,コ シ ヒ カ リ,あ き た こ ま ち,き ら ら 397,初 星,ヤ マ ヒ カリ,ア キ ニ シ キ,む つ ほ ま れ,フ ジ ヒ カ リ,チ ヨ ニ シ キ,金 南 風,日 本 晴,Ilpum, Calmochi, Medium grain, Long grain, Forbidden rice, Pelde, Kyeema, Doongara Paellea rice, Illabong,国 宝 ロー ズ, 田 牧 米,Vaccah, Calriso,熱 帯 ジ ャ ポ ニ カ と し て, Elio, Carnaroli Arborio,イ ン ド型 米 と して, EM2003, Jasmin Rice, Kalijira, Texmati, Masuri, Tamxoan, Basmati, カ サ ラ ス,WAB96, WITA7, WITA239,南 京11号, IR 36,IR2061-214., RD21, RD23,ル ア ン プ ラ トー,日 印 交 雑 種 と し て,夢 十 色,ホ シ ユ タ カ,サ リ ー ク イ ー ン,JIF25, JI F30, JIF41, JIF42を 用 い た. 2.ア ミ ロ ー ス 含 量 お よ び タ ン パ ク 質 含 量 の 測 定 試 料 を 試 験 用 籾 摺 り 機(サ タ ケ 製THU-35A,東 広 島) に よ っ て 籾 摺 り し,試 験 用 精 米 器(ケ ッ ト化 学 研 究 所 製 パ ー レ ス 卜.東 京)で 歩 留 ま り90%に 精 白 し て 精 米 を 得 た. こ の 精 米 を サ イ ク ロ ン サ ン プ ル ミル(Udy社 製)に よ っ て 粉 砕 して 試 料 と し た.ブ リア ー ノ の ヨ ー ド比 色 法13)に 従 っ て 測 定 し た.検 量 線 は ポ テ ト ア ミ ロ ー ス(シ グ マ 社 製,Po taco amylose III)と 米 ア ミロ ペ ク チ ン(脱 脂 除 タ ン パ ク し た も ち 米 粉 末)を40/60,30/70,20/80,10/90, 0/100の 割 合 に 混 合 し て 作 製 し た 、 試 料 粉 末 の タ ンパ ク 質 含 量 は 燃 焼 法(LECO FP-528型 窒 素 分 析 装 置)に よ っ て 全 窒 素 含 量 を 求 め,米 に お け る 窒 素 タ ン パ ク 質 換 算 係 数5.95を 乗 じて タ ンパ ク 質 含 量 と した. 3.米 飯 の 調 製 と 物 性 測 定 前 項 の 精 米 を 湿 度70%に お い て 水 分含量.14.5%±0.5% に 調 整 し た.こ れ ら の 精 米 試 料 各10gを 外 径6 .Ocm,底 径4.2cm,高 さ5.5cmの プ リ ン カ ッ プ に 秤 取 し,純 水16 mLを 加 え,25℃ で1時 間 吸 水 さ せ た .そ の 後,電 気 炊 飯 器(東 芝製RC183,東 京)に5個 並 べ,釜 に75mLの 純 粋 を 加 え,20分 間 炊 飯 し た .ス イ ッ チ が 切 れ た 後,15分 間766中 村 澄 子,岡 留 博 司,與 座 宏 一,原 口 和 朋,奥 西 智 哉,鈴 木 啓 太 郎,佐 藤 光,大 坪 研 一 〔Nippon Nogeikagaku Kaishi 蒸 ら し,ふ た を 開 け て 米 飯 試 料 を プ リ ン カ ッ プ か ら ガ ラ ス シ ャ ー レ に 移 し,プ ラ ス テ ィ ッ ク 袋 に 密 閉 し て25℃ で2 時 間 静 置 し た.そ の 各30粒 を1粒 ず つ,テ ン シ プ レ ッ サ ー(タ ケ トモ 電 機 製 マ イ ボ ー イ,東 京)を 用 い て 岡 留 ら つ方 法14)こ よ り 物 性 を 測 定 し た.測 定 項 目 は,圧 縮 率25% こよ る米 飯 表 層 部 の 付 着 量(L3)で あ る, 4.精 米 粉 の 調 製 と 米 粉 糊 化 特 性 の 測 定 精 米 粉3,0g(乾 物 当 た り)に25mLの 純 水 を 加 え,豊 島ら の 方 法15)に よ り ラ ピ ッ ド ビ ス コ ア ナ ラ イ ザ ー(RVA, ニ ュ ー ポ ー トサ イ エ ン テ ィ フ ィ ッ ク 社 製,Warriewood) で糊 化 特 性 を 測 定 し た.す な わ ち,50℃ で1分 間 撹拌 した 後,4分 間 で50℃ か ら93℃ ま で 昇 温 し,93℃ で7分 間 撹 拌を 続 け た 後,93℃ か ら50℃ ま で4分 間 で 降 温 し,50℃ で3分 間 撹拌 を 続 け た 後 の 粘 度 を 採 択 し た.測 定 項 目 は コ ン シ ス テ ン シ ー(最 終 粘 度 と最 低 粘 度 の 差)で あ る. 5,DNAの 調 製 方 法(CTAB法) 前 記 精 米 を 粉 砕 器(イ ワ タ ニ 製 ミ ル サ ーIFM-100,東 京)に よ っ て 粉 砕 して 得 た 精 米 粉 末 試 料0.4gか らCTAB 法に よ りDNAを 抽 出 ・精 製 した. DNAを 試 料0.4 g(2 nL容 の 微 量 遠 心 チ ュ ー ブ)に 対 して2×CTAB液(2%セ チ ル ト リ メ チ ル ア ン モ ニ ウ ム プ ロ ミ ド(CTAB),20 mMエ チ レ ン ジ ア ミ ン4酢 酸(EDTA),1.4 M NaCl, 0.1Mト リス ヒ ドロ キ シ ル ア ミ ノ メ タ ン/塩 酸 緩 衝 液(ト リス 緩 衝 液, p H8.0)0.6 mLに 滅 菌 水0.2mLを 加 え た 水 溶 液 を 加 え, 35℃ で30分 間 抽 出 した.同 液 に 等 量 の ク ロ ロ ホ ル ム ・イ ソ ァ ミル ア ル コ ー ル(24:1,v/v, CI)を 加 え,ロ ー テ ー タ ー(タ イ テ ッ ク製TAITEC RT-50 ,東 京)に よ っ て15分 間,緩 や か に 撹拌 し た,次 い で 冷 却 遠 心 機(日 立himac C R21F,日 立)に よ っ て8000g,15分 間 遠 心 分 離 し,上 層 を 新 し い 微 量 遠 心 チ ュ ー ブ に 移 し た.こ れ に10%CTAB 液 0.08mLと0.8 mLのCIを 加 え,ロ ー テ ー タ ー で15分 間 緩 や か に 撹拌 し た 後 に8000gで15分 間 遠 心 分 離 し,上 層を 新 し い チュー ブ に 移 し た.こ の 液 に2.5倍 容 の 沈 殿 用 緩 衝 液(50mMト リ ス 緩 衝 液, pH 8.0,10mM EDTA,1% C TAB)を 加 え,-80℃ で5分 間 静 置 し,沈 殿 を 生 成 さ せ た.沈 殿 を8000gで15分 間 の 遠 心 分 離 で 回 収 し,0.2M Na C1を 含 む ト リ ス ・EDTA緩 衝 液(TE)0.5 mLに 溶 解 し,等 量 の イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル を 添 加 し た.転 倒 混 和 し た 後,8000gで15分 間 遠 心 分 離 し,沈 殿 を 回 収 し た. 沈 殿 を0.2mLのTEに 溶 解 し,10 mg/mLのRNAse 〔ニ ッ ポ ン ジ ー ン社 製,牛 膵 臓RNAse A,10mg/mL)を1 1L加 え,55℃ で1時 間RNA分 解 を 行 っ た.処 理 後,等 量 の中 性 フェ ノ ー ル を 加 え て 精 製 し,8000gで15分 間 遠 心 分離 を 行 い,上 層 を 新 し い チ ュ ー ブ に 移 し た.こ れ に 等 量 7)フ ェ ノ ー ・レ/ク ロ ロ ホ ル ム(1:1 ,v/v)を 加 え,8000g で15分 間 遠 心 分 離 を 行 い,上 層 を 新 し い チュー ブ に 移 し た.こ れ に0.2MのNaClと2倍 容 の 氷 冷 エ タ ノ ー ル を 加 え てDNAを 沈 殿 さ せ,70%エ タ ノ ー ル50μLで 洗 浄 し た 後,30μLの10倍 希 釈TEで 溶 解 し,鋳 型DNAと し た ・ 外 国 産 米 で 試 料 が 極 め て 少 な い も の に つ い て は 筆 者 ら の 酵 素 法16)でDNAを 調 製 し た. 6.プ ラ イ マ ー の 設 計 本 研 究 に お い て は,PCRに お い て,3種 類 の プ ラ イ マ ー を 使 用 し た.第1の 種 類 は,デ ン プ ン 合 成 酵 素 に 関 係 す る プ ラ イ マ ー で あ り,M1A, GBSS3, GBSS4, NSSI, SSII, DBE, G4, NK4な ど が こ れ に 相 当 す る.こ こ で, GBSSは デ ン プ ン顆 粒 結 合 型 デ ン プ ン合 成 酵 素,SSは 可 溶 性 デ ン プ ン合 成 酵 素,DBEは デ ン プ ン枝 切 り酵 素, G4は デ ンプ ン 枝 作 り 酵 素 と そ れ ぞ れ 関 係 す る プ ラ イ マ ー で あ る. GBSS3, GBSS4, SSIIは 文 献4,17に 記 載 さ れ た デ ン プ ン 合 成 酵 素 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 内 を 数 個 の ブ ロ ッ ク に 分 け,各 ブ ロ ッ ク ご と に プ ラ イ マ ー を 設 計 し,PCRの 結 果,品 種 間 差 異 の 見 い だ さ れ た 塩 基 部 分 の プ ラ イ マ ー を 使 用 し た. MlA, G4, NK4, NSSIは,品 種 判 別 用 に 当 研 究 室 で 開 発 し たSTSプ ラ イ マ ー で あ り,開 発 後 に デ ン プ ン 合 成 酵 素 と の 関 係 が 示 唆 さ れ た プ ラ イ マ ー で あ る.DBEで は 中 村 の 報 告18)し た デ ン プ ン 枝 切 り 酵 素 の15,241bpか ら な る 領 域 を6個 の ブ ロ ッ ク に 分 け,各 ブロ ッ ク ご と に プ ラ イ マ ー を 設 計 し て,PCRを 行 い,増 幅DNAに 品 種 間 差 異 の 認 め ら れ た 部 分 を 見 い だ し た.次 い で こ の 識 別 性 の 高 い 領 域 (12,204∼12,690 bp)内 の 変 異 を 明 ら か に す る た め,5品 種 の 試 料 米DNAを 鋳 型 と し て 当 核 領 域 を 特 異 的 に 増 幅 す るPCRを 行 い,クロー ニ ン グ を 各 試 料 米 ご と に5ク ロ ー ンず つ 行 っ て,品 種 内 で の 一 塩 基 置 換 で は な い 部 分 で 塩 基 配 列 を 決 定 し,ジ ャ ポ ニ カ お よ び イ ン デ ィ カ 亜 種 で 特 徴 的 に 相 違 す る 塩 基 配 列 部 分 で2次 プ ラ イ マ ー を 設 計 し た.こ の 結 果 を 図1に 示 す.第2の 種 類 は タ ンパ ク 質 組 成 に 関 係 す る プ ラ イ マ ー で あ り,Gluは グ ル テ リ ン 由 来 の プ ラ イ マ ー,Pro13, Pro13FNは プ ロ ラ ミ ン13kDa由 来 の プ ラ イ マ ー,Pro10は プ ロ ラ ミ ン10kDa由 来 の プ ラ イ マ ー で あ る.Pro10はYouら19)の 塩 基 の う ち36∼488 bpま で を, Pro13, Pro13FNはShaら の 文 献20に 記 載 さ れ た 米 貯 蔵 タ ン パ ク 質 の 遺 伝 子 の 塩 基 配 列761∼1130bpま で と 341∼1130bpま で を 設 計 し た プ ラ イ マ ー で あ る . Gluは, Washidaら の 報 告21)し た グ ル テ リ ン遺 伝 子 の 調 節 遺 伝 子 内M7(tgcaaagt)塩 基 配 列 か ら 構 造 遺 伝 子620 bpま で を 1次 プ ラ イ マ ー と し,9種 類 の 試 料 米 のDNAを 鋳 型 と す るPCRを 行 い,」 増 幅 し たDNAを ク ロ ー ニ ン グ してDBE と 同 様 に 各 試 料 米5ク ロ ー ン を 読 ん で 品 種 内 一 塩 基 置 換 で は な い 部 分 で 塩 基 配 列 を 決 定 し,ジ ャ ポ ニ カ,イ ンデ イ (46)
Vo1.78, No.8,2004)広 範 な 米 の 食 味 要 因767 図IDebranching enzymeの2次 プ ラ イ マ ー の塩 基 配 列 (A)5'側 塩 基 配 列 aの 部 分 は 日本 型米 の 識 別 プ ラ イ マ ー位 置. bの 部 分 は イ ン ド型 米 の 識 別 プ ラ イ マ ー位 置. (B)3'側 塩 基 配 列 aの 部 分 は 日本 型 米 の 識 別 プ ライ マ ー 位 置. bの 部 分 は イ ン ド型 米 の識 別 プ ラ イ マ ー位 置. 図2グ ル テ リン調 節 遺 伝 子,構 造 遺 伝 子 内 変 異 部 分 (A)調 節 遺 伝子 内 の 日本 型 米 と イ ン ド型 米 の 変 異 部 分 (B)構 造 遺 伝 子 内 の 日本 型 米 とイ ン ド型 米 の変 異 部 分
カに共 通 して 特異 的 に相 違 す る部 分 の調 節 遺 伝 子 部 分 と構
造遺 伝 子部 分 にか け て プ ライ マ ー を設 計 した.図2に
調 節
遺伝 子 内 の変 異 部 分 と構 造 遣 伝 子 内 の 変異 部 分 を示 す.
第3の 種 類 は,前12)で
使 用 した品 種 識 別 用 に開 発 した
プ ライ マ ー で あ り,M11,P5,G22,F6,S13,E30,J6,B43,
WK9で
あ る、 これ らのプ ライマ ーの塩 基配列 と今回使 用
した プ ラ イ マ ー の 塩 基 配 列 を 表1に
示 す.
7.,PCRに よ るDNAの 増 幅 と 多 型 の 検 出 こ の 鋳 型DNA 400 ng/1μL, DNAポ リ メ ラ ー ゼ(タ カ ラ バ イ オ 製,Taq golymerase,5U/ ,μL,大 津)0.2,μL,反 応 用 緩 衝 液(12mMト リス 塩 酸,60 m順KC1, pH 83)2.0 μL,dNTPs(100μM)2μL,25 mM MgCl22μLの 混 合 液 に5pmol/μLのSTS化 対 合 プ ラ イ マ ー0 .2∼0.6μLを 加 え,滅 菌 水 に よ っ て総 液 量 を20μLと し た .各 プ ラ イ マ ー のPCR条 件 を 表2に 示 す よ う に, PCR条 件 は プ ラ イ マ ー768中 村澄子.岡 留 博 司.與 座 宏一.原口 和朋.奥 西 智 哉,鈴 木 啓 太 郎.佐 藤光.大 坪研 一 〔Nippon Nogeikagaku Kaishi 表l STS化 プ ラ イ マ ー の 塩 基 配 列 に よ っ て 異 な る が,サ ー マ ル サ イ ク ラ ー(タ カ ラ バ イ オ 製 MP,大 津)を 用 い て,96℃ で1分 間 変 性,50∼72℃ で1 分 間 ア ニ ー リ ン グ,72℃ で2分 間 伸 長 と い う サ イ ク ル を 35回 繰 り 返 し た.増 幅DNAを 含 む 反 応 液15,μLに ロ ー デ ィ ン グ 緩 衝 液(1mM EDTA,グ リ セ リ ン30%,ブロ モ フ ェ ノ ー ル ブ ル ー0.25%,滅 菌 水69.5%)3μLを 加 え, 2%ア ガ ロ ー ス ゲ ル(ニ ッ ポ ン ジ ー ン 製Agarose S)に チ ャ ー ジ し,電 気 泳 動 装 置(コ ス モ バ イ オ 製 ミ ュ ー ピ ッ ド, 東 京)を 用 い て 膏 流 雷 序100Vで30分間 泳 動し.エ チ ジ ウ ム ブロ ミ ド(500ng/mL)で1時 間 染 色 後,紫 外 線 照 射 し てDNAバ ン ドパ タ ー ン を 撮 影 し た. DNA分 子 量 マ ー カ ー はMarker 4(和 光 純 薬 製,φX174フ ァ ー ジHaeIII) を 使 用 し た. 8.増 幅DNAの 切 り 出 し,精 製 と 塩 基 配 列 の 決 定 PCR後 の 電 気 泳 動 を 行 っ た2%SeaKem GTG agarose か ら 目 的 バ ン ドを 紫 外 線 照 射 下 で 切 り 出 し,3倍 容 の ヨ ウ 化 ナFリ ウ ム に よ っ てDNAを 溶 出 し た 後,ガ ラ ス ビ ー ズ 吸 着 法(タ カ ラ バ イ オ 製,EasyTrap ver.2,大 津)に よ り DNAを 回 収 し た.そ のDNAを トポ ク ロ ー ニ ン グ キ ッ ト (イ ン ビFロ ジ ェ ン製,Toga XL CIoning Kit)を 用 い て ラ イ ゲ ー シ ョ ン し,大 腸 菌 に 組 み 込 ん で37℃ で18時 間 培 養 し,ア ル カ リ ミニ プ レ ッ プ 法(キ ア ゲ ン 製QIAprep Spin Miniprep kit使 用)に よ っ てDNAを 抽 出 ・精 製 し た.そ のDNAを シ ー ク エ ン シ ン グ 用 キ ット(Applied Biosystems製, big Dye Terminator Cycle Sequencing
Kit, V1-1)を 用 い て 増 幅 し, 自 動 シ ー ク エ ンサ ー (Ap-plied Biosystems製370)に よ っ て 塩 基 配 列 を 決 定 した. 9.ア ミ ロ ー ス 含 量,タ ン パ ク 質 含 量,米 飯 物 性 値(L3),精 米 粉 糊 化 特 性 値 に 対 す るPCR食 味 推 定 式 の 作 成 と 適 用 性 の 検 定 前 項 で 述 べ たPCRに お け る 各 識別 バ ン ドの 出 現 の 有 無 を2値 化 し だ2}.す な わ ち,バ ン ドが 出 現 し た 場 合 を1,出 現 し な か っ た 場 合 を0と して 説 明 変 数 と し,ア ミ ロ ー ス 含 量,タ ンパ ク質 含 量,米 飯 物 性 値(L3),精 米 粉 糊 化 特 性 値 を 目 的 変 数 と し て 変 数 増 減 法 に よ り重 回 帰 分 析 を 行 っ た. 統 計 処 理 はExce12000の 統 計 ソ フ ト ウ エ ア を 使 用 し た. 10.試 料 米 のPCR結 果 に 基 づ く ク ラ ス タ ー 分 析 広 範 な 世 界 の 米23品 種 を23種 類 の プ ラ イ マ ー でPCR を 行 い,PCRに お け る 各 識 別 バ ン ド の 出 現 の 有 無 を2値 化 し た.す な わ ち,バ ン ドが 出 現 し た 場 合 を1,出 現 し な か っ た 場 合 を0と して 説 明 変 数 と し,ク ラ ス タ ー 分 析 を 行 っ た.統 計 解 析 ソ フ トは オ ー ド メ イ ン社 の ロー タ ス1-2-3利 用 の 多 変 量 解 析 を 使 用 し,解 析 理 論 は 石 原 ら の 理 論22)に よ っ た. 実 験 結 果 1.STS化 プ ラ イ マ ー に よ る 各 品 種 のPCR結 果 各 品 種 の 精 米 試 料 か ら調 製 し た 鋳 型DNAを 用 い,各 種 のSTS化 プ ラ イ マ ー 単 独 あ る い は 複:数:のSTS化 プ ラ イ マ ー を 組 み 合 わ せ て 反 応 液 に 共 存 さ せ てPCRを 行 っ た 結 果 を 表3お よ び図3に 示 す. Na.1∼24の 試 料 米 は 検 量 線 作 成 に,No.25∼39の 試 料 米 は 未 知 試 料 と し て 適 用 性 検 定 に 使 用 し た, (48)
Vo1.78, No.8,2004)広 範 な 米 の 食 味 要 因769
表2PCR条 件*
*TaKaRa PCR Thermal Cycler MP使 用. DNA濃 度 は260nmの 吸 収 波 長 に よ る 。
2.成分 測 定 お よ び 物 理 特 性 測 定 の 結 果 ヨ ー ド比 色 法 で 測 定 し た ア ミ ロ ー ス 含 量 ,燃 焼 法 で 測 定 し た タ ンバ ク 質 含 量,テ ン シ プ レ ッ サ ー に よ っ て 測 定 し た 米 飯 物 性 測 定 値 お よ びRVAに よ っ て 測 定 し た 精 米 粉 糊 化 特 性 値 の 測 定 結 果 を 表4に 示 す.ま た 各 プ ラ イ マ ー に よ る PCR結 果 と,ア ミ ロ ー ス 含 量,タ ンパ ク質 含 量,米 飯 物 性 値(L3),精 米 粉 糊 化 特 性 値 と の 相 関 を 表5に 示 す.こ の 結 果,ア ミロ ー ス 含 量 に 対 して1%有 意 の 相 関 が あ っ た プ ラ イ マ ー はNSSI, MIA, P5, DBE-1, F6 , Pro10で, GBSS由 来 の プ ラ イ マ ー が4個 含 ま れ て い た.タ ンパ ク質 含 量 に 対 し て1%有 意 の 相 関 が あ っ た の はGlu, DBE-1, NSSI, MIA, NK4, M11, P5 , J6で タ ン パ ク 質 由 来 の プ ラ イ マ ー はGluの み で あ っ た.米 飯 物 性 値(L3)に 対 し て1%有 意 の相 関 が あ っ た プ ラ イ マ ー は,DBE-1 , Glu, Pro13, Pro10, NSSI, MIA, Nk4, M11, P5,J6で 相 関 係 数 の 高 い 複 数 要 因 の プ ラ イ マ ー が 見 い だ さ れ た.精 米 粉 糊 化 特 に 対 し て 1%有 意 の 相 関 が あ っ た プ ラ イ マ ー はNSSI , MIA, NK4, M11, P5, J6, DBE-1 , Glu, Pro10で, GBSS由 来 の プ ラ イ マ ー が5個 含 ま れ て い た . 3.イ ン ド型 米 と 日 本 型 米 と の 識 別 イ ン ド型 米 お よ びB本 型 米 を 試 料 と し て 鋳 型DNAを 調 製 し,デ ン プ ン合 成 酵 素 関 連 の プ ラ イ マ ー で あ るDBEの イ ン デ ィ カ 用(A)DBE-I.,お よ び ジ ャt一 力 用(B)DBE-J を 用 い て 行 っ たPCRの 結 果 を 図4に 示 す.こ の 結 果, DBE由 来 で イ ン ド型 米 と 日 本 型 米 を 識 別 す る こ と が 可 能 と な っ た.ま た,グ ル チ リ ン に お い て は,図2の 塩 基 を 基 に プ ラ イ マ ー を 設計し,PCRを か け た 結 果 を 図3(bプ ラ イ マ ー)に 示 す.こ の 結 果,ジ ャ ポ ニ カ 型 と イ ン デ ィ カ 型 の 識 別 が ほ ぼ で き た.ま た,グ ル テ リ ン の 構 造 遺 伝 子 内 の タ ンパ ク 質 変 異 を 図5に 示 す.こ れ に よ り,イ ン ド型 米 と 日本 型 米 で は,貯 蔵 タ ンパ ク 質 グ ル テ リ ン に 変 異 部 分 が 示 さ れ た.次 に,プ ロ ラ ミ ン13kDaの341∼1130 bpの 領 域 を ク ロ ー ニ ン グ し た 塩 基 配 列 を 図6に 示 す.こ の 結 果, イ ン ド型 米 と 日 本 型 米 で,一 部 分 塩 基 配 列 の 異 な る 部 分 が 見 い だ さ れ た. 4.ア ミロー ス 含 量,タ ン パ ク 質 含 量,米 飯 物 性 値(L3),精 米 粉 糊 化 特 性 値 の 推 定 式 の 作 成 お よ び そ の 適 用 性 検 討 の 結 果 表2のPCR結 果 の う ち,8個 の プ ラ イ マ ー に よ るPCR の 結 果 を 前 項 で 述 べ た 方 法 に よ って2値 化 し,24種 類 の 試 料 米 の ア ミ ロ ー ス 含 量 を 目 的 変 数 と す る 重 回 帰 分 析 を 行 っ た 結 果,下 記 の 式(1)を 得 た . Y=29.73-1.50×S13-0.65×DBE-15.1×Glu +4.71×NSSI+9.46×SSII-5 .96×P5 -8.47×E30-7.44×Pro13 (1) こ の 重 回 帰 式 の 重 相 関 係 数(R)は ,0.92で あ っ た 。 散 布 図 を 図7(A)aに 示 す.
770中 村 澄 子,岡 留 博 司,與 座 宏 一,原 口 和 朋,奥西 智 哉,鈴 木 啓 太 郎,佐 藤 光,大 坪 研 一〔Nippon Nogeikagaku Kaishi 表321プ ラ イ マ ー に よ る
この 重 回帰 分 析 に 基 づ くア ミロ ー ス 含 量 推 定 式(1)の,
未 知 試 料 に 対 す る適 用 性 を 検 定 す るた め に,表4に
示 す
15種 類 の 未 知 試 料 米 の ア ミロ ー ス含 量 に対 して 式(1)を
適 用 した場 合 の 重 相 関 係 数 は0.72で
あ っ た.こ
の場 合 の
散 布 図 を 図7(A)bに
示 す.次
に タ ンパ ク質 含 量 推 定 式 は4
種 類 のSTS化
プ ラ イ マ ー に 対 応 す る識 別 バ ン ドの 出 現 の
有 無 を2値
化 して 説 明 変 数 と し,表4に
示 す タ ンパ ク質 含
量 を 日 的 変 数 と した 重 回 帰 分 析 の 結 果,下 記 のPCR食
味
推 定 式 を得 た.
Y=7.80-0.53×MIA-1.65×Glu+0
.44×SSII
+0.39×J6
(2)
この 重 回 帰 式 の重相 関 係 数(R)は ,0.81で
あ った.散 布
図 を図7(B)aに
示 す.こ
の 重 回 帰 分 析 に 基 づ く食 味 推 定 式
(2)の,未 知 試 料 に対 す る適 用性 を検 定 す る た め に,表4に
示 す13種
類 の 未 知 試 料 米 の タ ンパ ク 質 含 量 に 対 して 式
(2)を 適 用 した 場 合 の 重 相 関係 数 は0.62で
あ った.こ
の 場
合 の 散 布 図 を図7(B)bに
示 す.次
に米 飯 物 性 測 定 値 の推 定
式 の作 成 は7種
類 のSTS化
プ ラ イ マ ー に 対 応 す る識 別 バ
ン ドの 出現 の 有 無 を2値
化 して 説 明 変 数 と し
,表2に
示 す
米 飯 物 性 測 定 値(米 飯 表 層 の 付 着 量(L3))を
目的 変 数 と し
た重 回 帰 分 析 の 結 果,下
記 のPCR食
味 推 定 式 を得 た .
Val.78, No.8,2004〕 広 範 な 米 の 食 昧 要 因771 PCR結 果 Y=0.063+0.0359×NK4+0.475×Gl u×0.246×P5+0.0201xB43 +0.124×M11-0.0848×G22+0.549×Pro13 (3) こ の 重 回 帰 式 の 重 相 関 係 数(R)は0.93で あ っ た.散 布 図 を 図7(c)aに 示 す.こ の 重 回 帰 分 析 に 基 づ く物 性 推 定 式 (3)の,未 知 試 料 に 対 す る適 用 性 を 検 定 す る た め に,表4に 示 す15種 類 の 未 知 試 料 米 の 物 性 測 定 値EL3)に 対 し て 式 (3)を 適 用 した 場 合 の 重 相 関 係 数:は0.82で あ っ た.こ の 場 合 の 散 布 図 を 図7(c)bに 示 す 。 次 に 精 米 粉 糊 化 特 性 値 の 推 定 式 の 作 成 は9種 類 のSTS化 プ ラ ィ マ ー に 対 応 す る 識 別 バ ンド の出現の有無を2値化し て説明変数とし,前項 で述 べ た 精 米 粉 糊 化 特 性 値:の う ち,コ ン シ ス テ ン シ ー を 目 的 変 数 と し た 重 回 帰 分 析 の 結 果,下 記 のPCR推 定 式 を 得 た. Y=142-30.2×Glu-11.1×MIA-43×G4 +18.1×DBE+11.4×G22十61×S13 +44.2×GBSS4- 39.7×Pro13FN+17.6×WK9
(4)
こ の重 回 帰 式 の 重 相 関 係 数 は0.84で
あ っ た.散 布 図 を
図7(D)aに
示 す.
この 重 回 帰 分 析 に基 づ く推 定 式(4)の,未
知 試 料 に 対 す
る適 用性 を検 定 す る た め に,表4に
示 す14種
類 の 未 知 試
料 米 の糊 化 特 性 値(コ
ン シス テ ン シー)に
対 して 式(4)を
適 用 した 場 合 の重 相 関 係 数 は0.72で
あ っ た,こ の場 合 の
772中 村 澄 子,岡 留 博 司,與 座 宏 一,原 口和 朋,奥 西 智 哉,鈴 木 啓 太 郎,佐 藤 光,大 坪 研 一 〔Nippon Nogeikagaku Kaishi 図339品 種 の 広 範 な 世 界 の 米 のPCRの 結 果 1∼24ま で は 食 味 推 定 式 作 成 用 に 使 用 し た. 1:EM20032:ス イ ー ト ラ イ ス 3:羽 二 重 精 4:ひ と め ぼ れ 5:コ シ ヒ カ リ6:日 本 晴7:イ ラ ボ ン8:国 宝 ロ ー ズ9:田 牧 米 10:バ ッ カ ー11:エ リ オ 12:カ ル ナ ロ リ13:カ ル リ ソ14:ア ル ボ リ オ15:ジ ャ ス ミ ン ラ イ ス 16:カ リ ジ ラ 17:テ キ サ マ テ ィ18:マ ス リ19:タ ム ソ ア ン20:バ ス マ テ ィ21:夢 十 色22;ホ シ ユ タ カ23:サ リ ー ク イ ー ン24:台 中65号 25∼39ま で は 食 味 推 定 式 検 査 用 に 使 用 し た. 25:こ が ね も ち26:ヒ ノ ヒ カ リ27:あ き た こ ま ち28:き ら ら39729:一 品30:カ ル モ チ10131:中 粒 米32:黒 米33:ペ ル デ34:カ イ ー マ35:パ ェ リ ア36:長 粒 米37:ド ー ン ガ ラ38:南 京11号39:IR2061 M:DNA分 子 量 マ ー カ ー(和 光 純 薬 工 業Marker 4)
矢 印:a:DBEI b:Glu c:G4 d:SS II e:Pro10 f:P5 g:NSSI h:GBSS4 i:Pro13FN j:J6 k:M1A 1:GBSS3 m:NK4 n:Pro130:WKg p:B43 q:M1l r:G22 s:F6 t:E30 u:S13
Vol.78, No.8,2004〕 広 範 な 米 の 食 味 要 因773
散布 図 を 図7(D)bに
示 す.
5.PCR結
果 に 基 づ く試 料 米 の ク ラ ス タ ー 分 析 結 果
23品 種 の広 範 な 世 界 の米 か ら抽 出 ・精 製 したDNAを
鋳 型 とす る23種
類 の プ ラ イ マ ー に よ るPCR結
果 を 前 項
の方 法 に よ り2値 化 し,ク ラ ス ター分 析 した結 果 を 図8に
示 す,こ の結 果 は イ ンデ ィ カ ・熱 帯 ジ ャポ ニ カ,温 帯 ジ ャ
ポニ カが グ ル ー プ 化 され て お り,こ れ ま で の 分 類 と よ く一
致 して いた.
考
察
消費 者 の 良 食 味 指 向 を 受 け て,新 品 種 育 成,米
の生 産 ・
流 通 お よ び米 の 利 用 ・加 工 の 各 段 階 に お い て 良 食 味米 が 求
め られ て い る.そ の た め に,米 の 食 味 を精 度 良 く評 価 す る
技 術 の 開 発 が必 要 で あ る.従 来 は,官 能 検 査23),物 理 化 学
的評 価24),分 光 学 的 測 定 な どが 用 い られ て きた.こ
れ らの
食 味 評 価 方 法 は そ れ ぞ れ特 徴 が あ り,そ れ ぞ れ が 必 要 で あ
る と考 え られ る.
本 研 究 で は,米 の 食 味 に品 種 特 性 が 大 き く影 響 す る こ と
に 注 目 し,分 子 生 物 学 的 手 法,特
にPCRに
よ る米 の識 別
お よ び 微 量 食 味 評 価 手 法 の 改 良 を 主 な 目 的 に 検 討 を 加 え
た.
前 報12)で は,今
回 検 討 した プ ライ マ ー の うち で .G4に
774 中 村澄子,岡 留 博 司,與 座 宏 一,原口 和 朋,奥 西 智 哉,鈴 木 啓 太 郎,佐 藤 光,大 坪 研 一〔Nippon Nogeikagaku Kaishi 表4試 料 米 の ア ミロ ー ス含 量,タ ンパ ク質 含 量,米 飯 物 性 値,精 米 粉 の糊 化 特 性 値 よ っ て 増 幅 す る 識 別 バ ン ドDNAは,ホ モロ ジ ー 検 索 の 結 果,デ ン プ ン の 枝 作 り酵 素(branching enzyme)と の 高 い 相 同 性 が 認 め ら れ た.他 の 多 く の 識 別 バ ン ドに つ い て は ま だ 機 能 の 明 ら か な 遺 伝 子 と の ホ モ ロ ジ ー が 確 認 さ れ て い な か っ た.本 報 で は 各 識 別 バ ンドDNAの 増 幅 を も た ら す プ ラ イ マ ー に つ い て 検 討 を 加 え,増 幅DNAの 意 味 が 推 定 さ れ る プ ラ イ マ ー の 開 発 や,米 の 成 分 ・特 性 と 関 係 の 期 待 さ れ るDNAを 増 幅 す る プ ラ イ マ ー の 開 発 を 行 っ た.本 研 究 で 用 い た プ ラ イ マ ー を3種 類 の グ ル ー プ に 分 け る こ と が で き る.す な わ ち,GBSS4やDBEの よ う な デ ン プ ン合 成 酵 素 に 関 係 す る プ ラ イ マ ー,GluやProl3の よ う に,タ ン パ ク 賢 組 成 に 関 係 す る プ ラ イ マ ー,そ し て 前 報 で 使 用 し た M11,P5の よ う な,品 種 識 別 用 に 開 発 し た プ ラ イ マ ー の3 種 類 で あ る. 図3(bプ ラ イ マ ー)に 示 さ れ る よ う に,グ ル テ リ ン に 関 係 す るPCRに よ っ て イ ン ド型 米 と 日 本 型 米 が 識 別 さ れ る 可 能 性 が 示 さ れ た.こ れ は,朝 の 光,月 の 光,コ シ ヒ カ リ, LGC-1,ニ ホ ン マ サ リ, IR2061,カ サ ラ ス, WITA7,夢 十 色 の 各 試 料 米 当 核 遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ 結 果 に お い て,調 節 遺 伝 子 と 構 造 遺 伝 子 の 一 部 分 に イ ン ド型 米 と 日 本 型 米 で 特 徴 的 な 塩 基 配 列 が 見 い だ さ れ た.ま ず,調 節 遺 伝 子 内 で は,Washidaら の 報 告21)に あ る よ う に, TATAboxの 上 流 域50∼100塩 基 のpyrimidine boxか ら4塩 基 下 流 の 塩 基 が,IR2061, WITA7,夢 十 色 で はTで あ る の に 対 し, (54)
Vo1.78, No.8,2004〕 広 範 な 米 の 食 味 要 因775 表5PCR結 果 に基 づ くプ ラ イ マ ー とア ミロ ー ス含 量,タ ンパ ク質 含 量,米 飯 付 着 量,精 米 糊 化 特 性 値 との 相 関 **1%有 意,*5%有 意 図4 Debranching enzymeの イ ン ド型 米,日 本 型 米,識 別 プ ラ イ マ ー に よ るPCR結 果 左 図:イ ン ド型 米 式 滅PCR 矢 印A:DBE-I l:エ リ オ2:カ ル ナ ロ リ3:ア ル ボ リオ4:カ オ ド ク マ リ5:カ リ ジ ラ 6:EM20097:バ ス マ テ ィ 8:C709:IR206110:IR 3611;こ が ね も ち 12:は く ち ょ う も ち 13:滋 賀 羽 二 重糯14:コ シ ヒ カ リ 15:ひ と め ぼ れ16:あ き た こ ま ち17:日 本 晴 18:金 南 風19:夢 十 色20:イ ラ ボ ン21;国 宝 ロ ー ズ22:JIF2523:JIF3024:JIF4125:JIF4226:テ キ サ マ テ ィ27:タ ム ソ ア ン28:カ サ ラ ス29:WITA7 右 図:日 本 型 米 識 別PCR 矢 印B:DBE-J 1:こ が ね も ち2:滋 賀 羽 二 重糯3:は く ち ょ う も ち4:コ シ ヒ カ リ5:ひ と あ ぼ れ6:日 本 晴7:初 星8:ヤ マ ヒ カ リ9:ア キ ニ シ キ10:む つ ほ ま れ11:き ら ら39712:カ オ ド ク マ1,13:テ キ サ マ テ ィ14:マ ス リ15:カ リ ジ ラ16:タ ム ソ ア ン17: バ ス マ テ ィ18:RD2119;夢 十 色20:カ サ ラス21:RD2322:ア ル ボ リオ23:台 中65号24:C7025:バ ッ カ ー26:国 宝 ロ ー ズ27:エ リ オ28:カ ル リソ29:WITA730:WITA23931:ノ レア ン プ ラ ト ー32:フ ジ ヒ カ リ33:チ ヨ ニ シ キ M:DNA分 子 量 マ ー カ ー(和 光 純 薬 工 業 Marker4) 図5グ ル テ リ ン構 造 遺 伝 子 内 の タ ンパ ク変 異 部 分
776中 村 澄 子,岡 留 博 司,與 座 宏 一,原 口 和 朋,奥 西 智 哉,鈴 木 啓 太 郎,佐 藤 光,大 坪 研 一 〔Nippon Nogeikagaku Kaishi 図6プ ロ ラ ミン13KDの 構 造 遺 伝 子 内変 異 部 分 D7ア ミロー ス含 量,タ ンパ ク質 含 量,米 飯 物性,精 米 粉 糊 化 特 性 に対 す るDNA推 定 式 と未 知 試 料 に よ る検 査 結 果 (A)a:ア ミ ロー ス 含 量 の 推 定 式 の 作 成 (A)b:ア ミロー ス含 量 の推 定 式 の 検 定 (B)a:タ ンパ ク質 含 量 の 推 定 式 の作 成(B)b:タ ンパ ク質 含 量 の 推 定 式 の 検 定 (C)a:物 性L3の 推 定 式 の 作 成 (C)b:物 性L3の 推 定 式 の検 定 (D)a:糊 化 特 性 の 推 定 式 の作 成 (D):b糊 化 特 性 の推 定 式 の 検 定 朝 の 光,カ サ ラ ス,コ シ ヒ カ リ,LGC-1,ニ ホ ン マ サ リ,月 の 光 で はAで あ っ た.ま た,GCN4モ チ ー フ の1塩 基 上 流 が,カ サ ラ ス の みGと な り,他 の 品 種 は す べ てAで あ っ た.こ の こ と か ら,glub-1の 発 現 に か か わ っ て い る と さ れ て い る 各 モ チ ー フ 以 外 の 部 分 が,イ ン ド型 と 日 本 型 で 異 な っ て い る こ と が 示 さ れ た .構 造 遺 伝 子 内 に お い て も,明 ら
か に,イ
ン ド型 米 と 日本 型 米 とで 異 な っ て い る部 分 が数 カ
所 見 い だ さ れ た.こ
れ ら の調 節 遺 伝 子 部 分 の 相 違 点 お よ び
構 造 遺 伝 子 部 分 の 相 違 点 の配 列 に基 づ い て プ ライ マ ーを設
計 し,39種
類 の試 料 米 でPCRを
行 っ た結 果,日
本 型 米 と
イ ン ド型 米 を そ れ ぞ れ 共 通 的 に ほ ぼ 識 別 が で き る こ とが 示
され た.ま
た図5に
示 す よ う に,イ
ンド型 米 と 日本 型 米 の
(56)Vol.78, No.8,2004) 広 範 な 米 の 食 味 要 因777 図8広 範 な世 界 の米23品 種 の23種 類 の プ ライ マ ー に よ る ク ラ ス ター 分 析 間 で,貯 蔵 タ ンパ ク質 グ ル テ リ ン の 質 的 相 違 が あ る も の と 考 え ら れ た. ま た,図4に 示 す よ う に,デ ン プ ン 枝 切 り 酵素DBE (pullulanase)に 関 係 す る プ ラ イ マ ー を 用 い たPCRに よ っ て も イ ン ド型 米 と日 本 型 米 の 識 別 が 可 能 と な っ た ,一 般 に 日 本 型 米 は粘 り が 強 く,イ ン ド型 米 は 粘 りが 弱 くパ サ パ サ した 食 感 が あ る.こ れ は,主 に ア ミ ロ ー ス 含 量 の 相 違 に よ る も の と考 え ら れ る が,ア ミ ロ ペ ク チ ン の ク ラ ス タ ー 構 造 の変 異 も影 響 す る と考 え られ,日 本 型 米 はDP値(重 合 度) 10以 下 の 短 鎖 が 多 く,DP値12∼21は 少 な い .こ の 構 造 は疎 水 性 に 影 響 が あ り,デ ン プ ン が 糊 化 しや す い 要 因 と 考 え ら れ,SSSIIa遺 伝 子 の 相 違 が 起 因 す る と 言 わ れ て い る5),ま た 筆 者 ら は,九 州 大 育 成 の 変 異 米EM75(sug2, pullulanase減 少 変 異 体)を 用 い てPCRを 行 っ た 結 果,日 本 型 米 に 特 徴 的 に 出 現 す るDBE-Jプ ラ イ マ ーに お い て, 原 品 種 の 金 南 風 に 比 べ て 明 ら か な 相 違 が 確 認 さ れ た 。 こ の DBE-Jプ ラ イ マ ー お よ びDBE-Iプ ラ イ マ ー に よ るPCRの 結 果,図4に 示 す よ う に 明 瞭 に イ ン ド型 米 と 日 本 型 米 が 識 別 さ れ る こ と はSSSIIa以 に もpullulanaseの よ う に 両 者 の 相 違 を も た ら し て い る 要 因 の あ る 可 能 性 を 示 し て い る. ま た コ シ ヒ カ リの み 朝 の 光,こ が ね も ち,カ サ ラ ス,夢 十 色 と異 な っ た 塩 基 配 列 が 検 出 さ れ た.こ の 相 違 部 分 と食 味 と の 関 連 に つ い て 今 後 検 討 す る つ も りで あ る.こ れ ら の こ とか ら,イ ン ド型 米 と 日 本 型 米 の 間 に は,タ ン パ ク 質 組 成
や デ ンプ ン合 成 酵 素,デ
ンプ ン分 子 の 微 細 構 造 に相 違 の あ
る こ とが 推 定 さ れ た.
図6か
らプ ロ ラ ミ ン13kDaの341∼1130
bpの 塩 基 内
で は イ ン ド型 米 と 日本 型 米 に 共 通 して特 異 的 な 塩 基 配 列 は
見 い だ され な か った,し
か し ク ロ ー ニ ン グ しな か った他 の
品 種 に お け るPCRで
は 品 種 間 の識 別 が あ り,こ の 領 域 内
にお い て も品 種 間 で変 異 が あ る もの と推 定 さ れ る。 増 村25)
は,プ ロ ラ ミ ンは米 周 辺 のPBIに
存 在 し,物 理 的 に強 固 で
疎 水 性 を 示 し消 化 酵 素 の 働 きを受 け に くい た め粘 り を弱 く
し食 味 と は負 の影 響 が あ る と提 案 して い る。 よ って プ ロ ラ
ミ ン13kDaの
他 の塩 基 部 分 で 特 異 的 に変 異 して い る部 分
の探 求 を継 続 す る こ と は必 要 と考 え られ る。
本 研 究 は,米 の 食 味 推 定 式 を各 種 の 物 理 化 学 的 変 数 に よ
る重 回 帰 分 析 に よ っ て作 成 した 竹 生 らの 食 味 推 定 式26)や,
各 種 の 分 光 測 定 値 に 基 づ い て 食 味 を 推 定 す る 食 味 計 の 開
発27)な ど と同じ 流 れ に あ る。 異 な る点 は,世 界 の広 範 な特
性 の 米 を対 象 と した た め,目 的 変 数 に官 能 検 査 結 果 で は な
く,ア
ミ ロー ス 含 量 や 米 飯 物 性 な ど の 食 味 に 関 連 す る
成 分 ・特 性 値 を 用 い た点 で あ る.ま
た,食 味 推 定 式 作 成 の
た め の 説 明 変 数 と して,従 来 の物 理 化 学 的 測 定 値 や 分 光 学
的測 定 値 で は な く,筆 者 らが前 報12)お よ び 本 報 で報 告 した
各 種 のSTS化
プ ラ イ マ ー共 存 下 で のPCR結
果 を 用 い た
点 が 異 な って い る.
日本 人 の米 飯 食 味 嗜 好 性 に つ い て は,前 報12)報
告 した
778中 村 澄 子,岡 留 博 司,與 座 宏一,原 口 和 朋,奥西 智 哉,鈴 木 啓 太 郎,佐 藤 光,大 坪 研 一 〔Nippon Nogeikagaku Kaishi 官 能 検 査 結 果 や 「食 味 評 価 値 」 を 目 的 と し て 食 味 推 定 式 を 作 成 す る こ と が 可 能 で あ る が,世 界 各 国 に は 幅 広 い 品 質 特 性 の 米 が あ り,各 国 の 国 民 は そ れ ぞ れ 異 な っ た 食 味 嗜 好 を も っ て お り,日 本 人 の 嗜 好 性 を も っ て 普 遍 的 な 数 値 と す る こ と は で き な い 。 例 え ば,イ ン ドや タ イ で は 日 本 人 と は 逆 に,硬 く て 粘 り の 少 な い 米 の 方 が 好 ま れ る.そ こ で,普 遍 的 な 食 味 評 価 方 法 が 必 要 と な る.本 報 で は,わ が 国 の 消 費 者 の 嗜 好 と比 較 的 相 関 の 高 い,ア ミ ロ ー ス 含 量,タ ンパ ク 質 含 量,米 飯 物 性 値(L3),お よ び 精 米 粉 の 糊 化 特 性 値(コ ン シ ス テ ン シ ー)を 目 的 変 数 に 選 択 してPCR結 果 を 説 明 変 数に と して,そ れ ぞ れ 重 回 帰 式 を 作 成 し た.最 近 世 界 各 国 でDNAマ ー カ ー が 分 子 育 種 に 利 用 さ れ る よ う に な っ て お り,香 り米 の 識 別28)や ア ミ ロ ー ス 含 量 に 関 す る マ ー カ ー29)が 報 告 さ れ て い る.し か し な が ら本 研 究 の よ う に デ ン プ ン や タ ン パ ク 質 の 分 子 構 造 に 関 係 す るPCR結 果 の 多 変 量 解 析 を 用 い た 食 味 特 性 の 検 討 は こ れ ま で 例 が な く,重 回 帰 分 析 に よ る 多 様 な 食 味 推 定 は 新 規 性 が あ る と 考 え ら れ る.ま た,筆 者 ら は,ア ミロ ー ス 含 量,米 飯 物 性 な ど の 食 味 特 性 は,複 数 の 遺 伝 子 の 制 御 を 受 け る と 考 え,単 一 の マ ー カ ー で は な く,複 数 の プ ラ イ マ ー に よ るPCRの 結 果 を 重 回 帰 分 析 す る こ と に よ る 食 味 要 因 の 推 定 が 必 要 と 考 え て い る.ア ミ ロ ー ス 含 量 を 目 的 と す るDNA推 定 式(1)で は 変 数 増 減 法 に お い て,S13, DBE, Glu, SSI, SSII, P5, E30, Pro13な ど のSTS化 プ ラ イ マ ー が 選 択 さ れ た.プ ラ イ マ ー の う ち に はDBE , SSI, SSIIな ど の デ ン プ ン 合 成 酵 素 関
連 の プ ラ イ マ ー が 含 ま れ て い る こ と は 当 然 と 考 え ら れ る が Glu, Pro13な ど の タ ン パ ク 質 関 連 プ ラ イ マ ー も 含 ま れ て い る.こ の こ と は,タ ンパ ク 質 組 成 が 日 本 型 米,イ ン ド型 米 な ど の 種 類 に よ っ て 異 な っ て い る 可 能 性 を 示 して い る. こ の 重 回 帰 式(検 量 線)の 重 相 関 係 数(R)は,0.92で あ り, 未 知 試 料 に 対 す る 重 相 関 係 数 は0.72で あ っ た. タ ン パ ク 質 含 量 を 目 的 と す るDNA食 味 推 定 式(2)で は,M1A, Glu, SSII, J6のSTS化 プ ラ イ マ ー が 選 択 さ れ た.こ の 重 回 帰 式 の 重 相 関 係 数(R)は,0.81で あ り,未 知 試 料 米 に 対 し て は 重 相 関 係 数 が0.62で あ り,適 用 性 が や や 不 十 分 と思 わ れ た.タ ンパ ク 質 含 量 の 場 合 は 品 種 特 性 の み な ら ず,水 田 の 窒 素 含 量 や 施 肥 条 件 も 影 響 す る の で DNAに よ る 推 定 が 困 難 で は あ る が,今 後,タ ン パ ク 質 関 連 の プ ラ イ マ ー を 増 加 し て 適 用 性 を 改 良 す る 必 要 が あ る と 考 え られ る. 米 飯 物 性 を 目 的 と す る 食 味 推 定 式(3)で は,NK4, Glu, P5, B43, M11, G22, Prol3な ど のSTS化 プ ラ イ マ ー が 選 択 さ れ た,こ こ で は,デ ン プ ン 関 連 の プ ラ イ マ ーNK4,タ ンパ ク質 関 連 の プ ラ イ マ ーPro13 ,品 種 識 別 由 来 の プ ラ イ マ ーP5 , M11な ど が そ れ ぞ れ 選 択 さ れ て お り,米 飯 物 性
に は さ ま ざ ま な 要 因 が 関 係 して い る こ と を示 して い る． 検
量 線 の重 相 関 係 数 は0.93で
あ り,未 知 試 料 に対 す る重 相
関 係 数 は0.82で
あ り,適 用 性 はか な り高 い と思 わ れ た.
精 米 粉 の糊 化 特 性 値(コ
ン シ ス テ ン シー)を
目的 とす る
DNA推
定 式(4)で
は, Glu, M1A,
G4, DBE, G22, S 13,
GBSS4,
Pro13FN,
WK9な
ど のSTSプ
ラ イ マ ー が 選 択 さ
れ た.こ
こで も米 飯 物 性 と 同 様 に,デ
ンプ ン関 連 の プ ライ
マ ーMIA,
G4, DBE, GBSS4,タ
ンパ ク質 関 連 の プ ラ イ マ
ーGlu
, Pro13FN, 品種識
別 由 来 の 機 能 未 知 の プ ラ イ マ ー
G22,Sl3が
選 択 さ れ て お り,糊 化 特 性 に も さ ま ざ ま な要
因 が 影 響 して い る こ とが 示 唆 され た.こ
の 重 回 帰 式 の重 相
関 係 数 は0.84で
あ り,未 知 試 料 に 対 す る 重 相 関 係 数 は
0.72で あ っ た.
これ らのPCR食
味 推 定 式 の場 合 は,従 来 の 食 味 宮 能 検
査,物 理 化 学 的 測 定 値 あ る い は 分 光 学 的 測 定 値 に基 づ い た
食 味 推 定 と は異 な る視 点 か ら米 の 食 味 を 推 定 しよ う と した
もの で あ り,遺 伝 子 構 造 に基 づ く品 種 特 性 か ら食 味 を 推 定
しよ う と試 み た点 に 特徴 が あ る.し
た が っ て,本 報 で提 示
したPCR食
味 推 定 技 術 は,官
能 検 査,物
理 化 学 的食 味評
価 とは異 な る分 子 生 物 学 的 食 味 評 価 と位 置 づ け る こ とが で
き る.し か しなが ら,PCRに
基 づ く食 味 推 定 技 術 に 関 す る
研 究 は,開 始 さ れ た ば か りで あ り,使 用 して い る プ ライ マ
ー の種 類 も ま だ 少 な い
.本 報 で提 案 した デ ンプ ン合 成 酵素
や タ ンパ ク質 組 成 が 米 の 食 味 に 強 く影 響 して い る か ど うか
につ い て も,酵 素 活 性 と食 味 と の 関 係,タ
ンパ ク質 の組 成
と食 味 との 関 係 な ど,今 後 解 決 しな け れ ば な ら な い 問題 が
残 さ れ て い る。 さ ら に,PCR食
味 推 定 技 術 は,遺 伝 子 の配
列 に基 づ く方 法 で あ る た め,① 栽 培,貯
蔵,精
米 な どの 品
種 以 外 の 食 味 要 因 が 反 映 され な い,② 食 味 推 定 式 の理 論 的
基 盤 が まだ 確 立 され て い な い な どの 点 も考 慮 に入 れ て お か
な け れ ば な らな い.図8に
示 す ク ラ ス タ ー 分 析 結 果 は,従
来 の育 種 分 野 で の 分 類 と よ く一 致 して い た.ま
た 品種 上 の
特 徴 も よ く反 映 して い る。 これ は 用 い たPCRプ
ラ イ マ ー
が 各 試 料 米 の 品 質 特 性 と関 連 す る プ ラ イ マ ー で あ るた め と
推 測 され る,
今 後,本
報 で 提 案 した 各 種 のPCR食
味 推 定 式 を,米
の
育 種,生
産,流
通,利
用 の各 分 野 で 実 際 に 使 用 し,推 定式
の効 果 あ る い は問 題 点 を 明 らか に して い く こ と が 必 要 で あ
る.例 え ば,育 種 の 分 野 に お い て は,籾
や 玄 米 の 胚 芽 と反
対 側 の 半 粒 か らDNAを
抽 出 してPCRを
行 い, PCR食
味
推 定 式 に基 づ い て 良 食 味 米 候 補 を 選 抜 し,DNAを
抽 出 し
た 残 りの胚 芽 含 有 半 粒 を 用 い て次 世 代 を 育 成 して い く とい
っ たPCR半
粒 育 種 の 実 用 化 に つ な が って い く可 能 姓 が 期
待 され る.一 方,米
の利 用 の 分 野 に お い て は,市 販 の弁 当
の 米 飯1粒
か らDNAを
抽 出 してPCRを
行 い
, PCR食
味
(58)Vol.78, NO.8, 2004〕 広 範 な 米 の 食 味 要 因779
