蜂蜜中に残留する動物用医薬品の新規分析法の開発

蜂蜜中に残留する動物用医薬品の新規分析法の開発

Development of the novel determination

for veterinary drug residues in honey

2014 年

略 語 表

本 文 中 で は 以 下 の 略 語 を 用 い る ．

AM 5 antibiotic medium 5 抗 生 物 質 検 査 用 培 地 5

BGA Bacillus subtilis BGA バ チ ル ス サ ブ チ ル ス BGA 試 験 菌

CCD colony collapse disorder 蜂 群 崩 壊 症 候 群

ce collision energy コ リ ジ ョ ン エ ナ ジ ー

cep collision cell entrance potential コ リ ジ ョ ン セ ル 電 圧

CPFX ciprofloxacin シ プ ロ フ ロ キ サ シ ン

CV the inter-assay coefficients of variation 相 対 標 準 偏 差

DFX difloxacin ジ フ ロ キ サ シ ン DMZ dimetridazole ジ メ ト リ ダ ゾ ー ル DNFX danofloxacin ダ ノ フ ロ キ サ シ ン dp declustering potential オ リ フ ィ ス プ レ ー ト に か か る 電 圧 ERFX enrofloxacin エ ン ロ フ ロ キ サ シ ン FL fluorescence detection 蛍 光 検 出 器 GC gas chromatography ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー HLB カ ラ ム hydrophilic-lipophilic-balanced column 逆 相 ポ リ マ ー 系 カ ラ ム HMMNI 2-hydroxymethyl-1-methyl -5-nitroimidazole 2- ヒ ド ロ キ シ メ チ ル -1 - メ チ ル -5-ニ ト ロ イ ミ ダ ゾ ー ル IPZ ipronidazole イ プ ロ ニ ダ ゾ ー ル IPZ-OH 1-methyl-2-(2’-hydroxyisopropyl) -5-nitroimidazole 1-メ チ ル -2 -(2’-ヒ ド ロ キ シ イ ソ プ ロ ピ ル )-5-ニ ト ロ イ ミ ダ ゾ ー ル LC liquid chromatography 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

LLA lab-lemco agar ラ ブ － レ ム コ 寒 天 培 地

LOD limit of detection 検 出 限 界 値

LOQ limit of quantitation 定 量 下 限 値

MAX カ ラ ム mixed-mode anion-exchange column 逆 相 ミ ッ ク ス モ ー ド 陰 イ オ ン 交 換 型 カ ラ ム

MCX カ ラ ム mixed-mode ation-exchange column 逆 相 ミ ッ ク ス モ ー ド 陽 イ オ ン 交 換 型 カ ラ ム

MNZ-OH 1-(2-hydroxyethyl)-2-hydroxymethyl -5-nitroimidazole

1-(2-ヒ ド ロ キ シ エ チ ル )-2-ヒ ド ロ キ シ メ チ ル ニ ト ロ イ ミ ダ ゾ ー ル

MRL maximum residue limit 残 留 基 準 値

MRM multiple-reaction monitoring

MS mass spectrometry 質 量 分 析 計

MS/MS tandem mass spectrometry タ ン デ ム 型 質 量 分 析 計

NFPA nonafluoropentanoic acid ノ ナ フ ル オ ロ ペ ン タ ン 酸

NH2 カ ラ ム aminopropyl column ア ミ ノ プ ロ ピ ル 相 陰 イ オ ン 交 換

型 カ ラ ム

NRFX norfloxacin ノ ル フ ロ キ サ シ ン

OBFX orbifloxacin オ ル ビ フ ロ キ サ シ ン

PSA カ ラ ム primary secondary amine column 1 級 ， 2 級 ア ミ ン 相 陰 イ オ ン 交 換 型 カ ラ ム

QuEChERS quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe

ク エ ッ チ ャ ー ズ 法

RNZ ronidazole ロ ニ ダ ゾ ー ル

SEM standard error of the mean 標 準 偏 差

SRFX sarafloxacin サ ラ フ ロ キ サ シ ン

WAX カ ラ ム mixed-mode weak anion-exchange column

逆 相 ミ ッ ク ス モ ー ド 弱 陰 イ オ ン 交 換 型 カ ラ ム

WCX カ ラ ム mixed-mode weak cation-exchange column

緒 言 蜂 蜜 は ，古 代 か ら 食 品 の 貴 重 な 甘 味 源 や 調 味 料 と し て 用 い ら れ て き た (Inoue, 1980)． 近 年 ， 食 生 活 の 向 上 に 加 え 健 康 志 向 の 高 ま り と と も に ， 世 界 中 で そ の 消 費 量 は 増 大 し て い る ． 養 蜂 業 で は ， 蜂 蜜 の 安 定 供 給 の た め ， 蜜 蜂 の 飼 育 管 理 を 徹 底 さ せ ， 蜂 蜜 の 生 産 を 確 保 し な け れ ば な ら な い ． 他 の 家 畜 同 様 に ， 蜜 蜂 に も 種 々 の 病 気 が あ り ， そ の 主 な も の は 微 生 物 感 染 に よ る も の で あ る ． そ れ ら の 疾 病 の 予 防 ・ 治 療 の た め ， 動 物 用 医 薬 品 が 使 用 さ れ る (Figure 1) (Bailey et al., 1968, Genersch et al., 2010, Takeba et al., 1995)． か つ て Paenibacillus larvae に よ る ア メ リ カ 腐 蛆 病 と Mellisococcus pluton に よ る ヨ ー ロ ッ パ 腐 蛆 病 の 予 防 お よ び 治 療 に ， サ ル フ ァ 剤 ， テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 お よ び マ ク ロ ラ イ ド 系 抗 生 物 質 を 給 餌 の 形 で 摂 取 さ せ て い た (Martel et al., 2006)． し か し な が ら ， 原 因 菌 が こ れ ら の 抗 菌 薬 に 対 し て 耐 性 を 獲 得 し て き た (Alippi et al., 2005 ， Mutinelli, 2003)． 現 在 ， こ れ ら の 薬 物 に 代 わ り ， フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 が 養 蜂 で 用 い ら れ て い る (Durden et al.， 2010)． 加 え て ， 養 蜂 業 で の 新 た な 懸 案 と し て ， 突 然 蜜 蜂 が い な く な る 蜂 群 崩 壊 症 候 群 (Colony collapse disorder; CCD，別 名；い な い い な い 病 ) が 発 生 し ，養 蜂 家 だ け で な く ， 蜜 蜂 を 受 粉 媒 介 に 用 い て い る 農 業 生 産 に も 深 刻 な 影 響 を 与 え て い る (Chen et al., 2008, Stokstad, 2007)． そ の 原 因 は 複 合 的 な も の と 考 え ら れ て お り ， そ の 中 で も 原 虫 ， 細 菌 ， ウ ィ ル ス ， 真 菌 お よ び ダ ニ に よ る 感 染 症 が 大 き な 要 因 の 一 つ と 推 測 さ れ て い る (Oldroyd, 2007)． こ れ ら の 感 染 症 に よ る 蜜 蜂 の 減 少 を 防 止 す る た め ， 養 蜂 で は 動 物 用 医 薬 品 に 依 存 す る 状 態 に 陥 っ て い る ．さ ら に ，CCD を 誘 発 す る こ と が 指 摘 さ れ て い る 真 菌 症 の ノ ゼ マ 病 の 治 療 で ， 新 た に 2 系 統 の 薬 物 ， フ マ ギ リ ン お よ び ニ ト ロ イ ミ ダ ゾ ー ル 系 駆 虫 薬 が 使 用 さ れ る よ う に な っ た (Katznelson et al., 1952， Louise et al.， 2001， McCowen et al.， 1951, Sakamoto et al.， 2011， Zhou et al.， 2007)．

Figure 1 The concept of this study. し か し な が ら ， こ れ ら の 動 物 用 医 薬 品 に 対 し て 蜂 蜜 の 食 品 衛 生 上 の 安 全 対 策 を 行 っ て い る 国 は ，現 在 で も ほ と ん ど な い ．EU，オ ー ス ト ラ リ ア ，カ ナ ダ お よ び イ ン ド に お い て の み ， か つ て 使 用 さ れ て い た テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 抗 生 物 質 ， ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル お よ び マ ク ロ ラ イ ド 系 抗 生 物 質 に 対 す る 蜂 蜜 中 の 残 留 基 準 値 が 設 定 さ れ ， こ れ ら 薬 物 の 規 制 が 行 わ れ た に 留 ま る ． 2008 年 の FAO／ WHO 合 同 会 議 に お い て 養 蜂 で 用 い ら れ て い る 薬 物 の 一 日 摂 取 許 容 量 が 提 示 さ れ た ． つ ま り ， 既 存 の 薬 物 だ け で な く 新 規 の 薬 物 に 対 し て も ， 蜂 蜜 の 食 品 衛 生 上 の 安 全 性 を 確 保 す る た め の 国 際 的 な 体 制 構 築 が 始 め ら れ て い る ．

Honey

Necessary to regulate and monitor

the level of residual drugs in honey

Residual

veterinary

drugs

Veterinary

drugs

Potential risk for

the consumer’s health

Diseases

of bee

Foulbrood

CCD

分 析 技 術 の 進 歩 は ， 以 前 の 技 術 で は 検 出 で き な か っ た レ ベ ル で の 分 析 を 可 能 と し て い る ． こ の 様 な 技 術 的 な 背 景 か ら 現 在 で は ， 数 値 化 に よ る 残 留 規 制 が 主 流 に な っ て い る ． 我 が 国 で は ， 生 産 段 階 で 「 飼 料 の 安 全 性 の 確 保 お よ び 品 質 の 改 善 に 関 す る 法 律 (2007 改 正 ) 」 お よ び 「 薬 事 法 (2011 改 正 ) 」 に よ り ， こ れ ら の 薬 物 の 使 用 を 規 制 し ， 対 象 薬 物 ， そ の 用 法 ・ 用 量 お よ び 出 荷 前 の 休 薬 期 間 な ど が 定 め ら れ て い る ． こ れ ら の 法 律 で 蜜 蜂 へ の 使 用 が 認 め ら れ て い る の は ， ア メ リ カ 腐 蛆 病 へ の ミ ロ サ マ イ シ ン お よ び 蜜 蜂 ダ ニ へ の ア ミ ト ラ ズ と フ ル バ リ ネ ー ト の み で あ る ．一 方 ，消 費 段 階 で は ，「 食 品 衛 生 法 (2009 改 正 ) 」に 基 づ き ，蜂 蜜 で も そ の 薬 物 残 留 量 が 規 定 さ れ て い る ．2006 年 以 前 の 我 が 国 で は ，「 畜 水 産 食 品 中 か ら こ れ ら の 動 物 用 医 薬 品 が 検 出 さ れ て は な ら な い 」， す な わ ち 「 ゼ ロ 規 制 」 で あ っ た ． し か し な が ら ， 分 析 技 術 の 進 歩 を 基 に ，「 ポ ジ テ ィ ブ リ ス ト 」 が 施 行 さ れ た ． こ の リ ス ト で は ， 食 品 ご と に 約 300 種 類 の 動 物 用 医 薬 品 に 対 し ， 残 留 基 準 値 (Maximum Residue Limit； MRL) が 設 定 さ れ た ． こ の リ ス ト で 蜂 蜜 に 40 種 類 の 薬 物 で MRL が 設 定 さ れ た (Table 1)．

Table 1 MRLs of veterinary drugs on honey in Japan.

Analytes MRL,g/kg Analytes MRL,g/kg Analytes MRL,g/kg

Altrenogest 3 Dimetridazole Not-detected level Nafcillin 50

Amitraz 200 Dipropyl 4 Notgestmet 0.1

Amoxicillin 8 Emamectionbenzoate 0.5 Oxytetracyclin 300

Ampicillin 9 Famphur 20 Chlortetracycline (The sum of

Benzylpenicillin 4 Fenitrothion 2 Tetracycline three drugs)

Betamethasone 0.3 Fipronil 50 Piperazine 50

Brotizolam 1 Fluvalinate 50 Prednisolone 0.7

Chloramphenicol Not-detected level Flumethrin 5 Ronidazole Not-detected level

Clenbuterol Not-detected level Glycalpyramide 30 Thiabendazole 20

Clostebol 0.5 Lasalocid 5 Trenbolone Acetate Not-detected level

Clorsulon 20 Metoclopramid 5 Trichlorfon 4

Chlormadinone 2 Metronidazole Not-detected level Warfarin 1

Coumaphos Not-detected level Mirosamycin 50 Zeranol 2

Dexamethasone Not-detected level

し か し な が ら ，近 年 CCD お よ び 耐 性 菌 の 問 題 を 背 景 に ，養 蜂 に お い て 使 用 が 拡 大 し て い る 次 の 系 統 の 薬 物 に つ い て は ， 蜂 蜜 中 の 残 留 が 規 制 さ れ て い な い ． フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 抗 菌 薬 は ， 他 の 畜 水 産 食 品 で は 基 準 値 が あ る も の の ， 蜂 蜜 で は 規 定 さ れ て い な い ． 加 え て ， フ マ ギ リ ン は ポ ジ テ ィ ブ リ ス ト に 掲 載 さ れ て お ら ず ， 現 在 で も 全 く 残 留 規 制 が 成 さ れ て い な い ． さ ら に ， ニ ト ロ イ ミ ダ ゾ ー ル 系 駆 虫 薬 は 不 検 出 項 目 と し て 規 制 さ れ て い る も の の ， 蜂 蜜 中 の 本 薬 物 へ の 適 し た 残 留 分 析 法 は な い た め ， 実 質 的 に は 規 制 で き な い 状 態 に あ る ． そ の た め ， こ れ ら 3 系 統 の 薬 物 は 検 査 対 象 外 で あ っ た (Figure 2)．こ れ ら 3 系 統 の 薬 物 は 発 が ん 性 お よ び 耐 性 菌 出 現 な ど ヒ ト へ の 影 響 も 大 き く ， 食 品 と し て の 蜂 蜜 の 安 全 を 確 保 す る 目 的 で ， 蜂 蜜 中 の 薬 物 の 残 留 を 規 制 す る こ と が 急 務 で あ る ．

Figure 2 The residual regulation for veterinary drugs and current problems.

蜂 蜜 中 に 残 留 す る 動 物 用 医 薬 品 で は ， 現 在 ま で に ， こ れ ら の 残 留 基 準 値 が 設 定 さ れ た 薬 物 を 中 心 に ， 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ (Gaudin et al., 2013, Jinbo et al., 1992， Kusano et al., 2004, Myllyniemi et al., 2001) お よ び 機 器 を 用 い た 分 析 法 (Caldow et al., 2007， Cronly et al., 2010， Fujita et al., 2008, Horie et al., 1992, Kaufmann et al., 2002， Takeba et al., 1984, Verzegnassi et al., 2002) の 開 発 が 進 め ら れ ， そ れ ら の 方 法 を 用 い た 検 査 が 行 わ れ て き た ．

The Food Sanitation Law (Positive List from 2006)

MRL (300) MRL on honey (40) Insufficient reported methods Veterinary drugs

Not list on positive

list system

Not set up MRL on

honey

Set up MRL, but insufficient

reported methods

し か し な が ら ， 残 留 基 準 値 が 設 定 さ れ た 薬 物 の 既 報 で は ， こ れ ら の 薬 物 は ， 分 析 で の 選 択 性 ， 検 出 感 度 お よ び 定 量 性 が 低 く ， 適 切 な 測 定 の 実 施 は 困 難 な こ と が 示 さ れ て い る ． そ こ で 本 研 究 で は ， 蜂 蜜 中 の フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 (第 1 章 )， フ マ ギ リ ン (第 2 章 ) お よ び ニ ト ロ イ ミ ダ ゾ ー ル 系 駆 虫 薬 (第 3 章 ) へ の 適 し た 新 規 分 析 法 の 開 発 を 試 み た ． 新 規 分 析 法 を 構 築 す る に あ た っ て ， 次 の 3 点 を 目 指 し た ．  試 験 溶 液 の 調 製 で は ， 試 料 由 来 成 分 を 十 分 に 除 去 で き る 高 精 製 度 か つ 目 的 薬 物 の 効 率 的 な 抽 出 に よ り 高 回 収 率 が 得 ら れ る 方 法 と し た ．  測 定 で は ， 薬 物 の 特 徴 を 利 用 し た 効 率 的 な 測 定 法 を 選 択 し ， 求 め ら れ る 残 留 レ ベ ル を 検 出 で き る 感 度 を 得 る こ と か つ 正 確 な 定 性 ・ 定 量 を 可 能 と す る こ と と し た ．  そ の 新 規 分 析 法 を 各 薬 物 の 検 査 に 用 い る た め ，2010 年 に 厚 生 労 働 省 が 通 知 し た「 残 留 農 薬 等 試 験 法 の 妥 当 性 評 価 ガ イ ド ラ イ ン (改 訂 )」 の 基 準 に 適 し て い る こ と が 必 要 と な っ た ． そ こ で ガ イ ド ラ イ ン に 則 っ て ， 開 発 し た 分 析 法 の 妥 当 性 評 価 (single-laboratory validation study) を 実 施 し た ．

第 1 章 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ お よ び 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る 蜂 蜜 中 残 留 フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 分 析 法 蜂 蜜 中 の 抗 生 物 質 お よ び 合 成 抗 菌 薬 の 行 政 検 査 で は ， 従 来 か ら 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 を 行 っ て い た ． 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 は ， 抗 菌 性 を 有 す る 物 質 で あ れ ば 対 象 以 外 の 薬 物 も 検 出 可 能 か つ 操 作 性 が 簡 便 で あ る ．こ の 分 析 は ，「 食 品 中 か ら 抽 出 し た 試 験 溶 液 を 直 径 10 mm の ペ ー パ ー デ ィ ス ク に 浸 漬 さ せ ， 試 験 菌 含 有 培 地 (試 験 平 板 )上 で 18 時 間 培 養 す る ． 抗 菌 活 性 を 有 す る 薬 物 が 含 有 さ れ て い る と ， ペ ー パ ー デ ィ ス ク の 周 囲 に 菌 が 増 殖 し て い な い 部 分 (阻 止 円 ) を 生 じ る ． そ こ で 阻 止 円 の 直 径 が 12 mm 以 上 の 場 合 ， 薬 物 が 残 留 し て い る と 判 定 さ れ る 」 と い う 方 法 で あ る ． こ の 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 の 短 所 は ，抗 菌 活 性 を 有 す る 物 質 の 検 出 に 限 ら れ る こ と で あ る ． 加 え て ， 抗 菌 活 性 が 検 知 さ れ て も ， そ の 薬 物 の 同 定 作 業 は 容 易 で は な い こ と が 多 い ． 2008 年 1 か ら 2 月 に 行 政 検 査 を 実 施 し た 23 件 の 蜂 蜜 の う ち 2 件 で ， 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ の 結 果 ， 細 菌 増 殖 に 対 す る 阻 止 円 の 形 成 が 観 察 さ れ た (Figure 3)．

Figure 3 Microbiological screening results of honey samples on the plate of Bacillus subtilis in Antibiotic Medium 5.

(a) negative honey samples, (b) and (c) positive honey samples .

こ の 阻 止 円 を 形 成 し た 抗 菌 性 物 質 は ， Bacillus subtilis の 増 殖 抑 制 能 が 高 か っ た こ と か ら ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 生 物 質 と 推 定 さ れ た ． し か し な が ら ， 薄 層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で の 定 性 分 析 の 結 果 か ら ， ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 生 物 質 と は 異 な る 抗 菌 薬 で あ る こ と が 示 さ れ た ．当 時 ，EU の 食 品 安 全 委 員 会 発 表 の 食 品 緊 急 安 全 情 報 (RASFF，2008) に ， 蜂 蜜 中 に フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 残 留 が 報 告 さ れ た ． そ こ で ， LC/MS/MS 法 を 用 い 定 性 分 析 を 行 っ た 結 果 ， フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の ノ ル フ ロ キ サ シ ン と シ プ ロ フ ロ キ サ シ ン が 検 出 さ れ た ． こ の 薬 物 を 定 量 す る た め ， 厚 生 労 働 省 か ら 通 知 さ れ て い る フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 分 析 法 に 従 い 分 析 を 行 っ た ． 逆 相 系 の ポ

(a)

(b)

(c)

Diameter of the inhibition zone : 23.6mm

Diameter of the inhibition zone : 16.2mm

リ マ ー カ ラ ム (Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) カ ラ ム ) (Waters Corp., Milford, MA, USA) を 用 い た 精 製 の 後 ， LC (蛍 光 検 出 器 ) を 用 い て 測 定 す る と ， フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の ピ ー ク に 蜂 蜜 由 来 成 分 の そ れ が 大 き く 重 な り ， 目 的 と す る 物 質 の 定 性 お よ び 定 量 と も に で き な か っ た (Figure 4a)．一 方 ，LC/MS/MS を 用 い た 測 定 で は ， 薬 物 の ピ ー ク の 検 出 は 可 能 で あ っ た の で (Figure 4b)，そ の ピ ー ク の ス ペ ク ト ル か ら ノ ル フ ロ キ サ シ ン と 定 性 解 析 さ れ た (Figure 4c)． し か し な が ら ， 蜂 蜜 由 来 の 成 分 に よ る イ オ ン 化 促 進 効 果 に よ り ， そ の 定 量 は で き な か っ た ． 0 10 20 30 40 50 NRFX 10 0 In tens it y

Retention time (min)

(a)

(b)

NRFX

0 10 20

Retention time (min)

0 500 500 Int ens ity 0 50 m/z 320 → 276 m/z 320 → 302 m/z 320 → 233 m/z 320 → 205 0 100 276 m/z 100 200 300 400 233 205 320 [M+H] + 302 50 In ten si ty

(c)

フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 が 残 留 し て い た 理 由 に ， 近 年 ， 蜜 蜂 の 腐 蛆 病 治 療 へ の 本 薬 物 の 使 用 が 推 測 さ れ た ． し か し な が ら ， 他 の 畜 水 産 食 品 に は 残 留 基 準 値 が 設 け ら れ て い る が ， 蜂 蜜 に は 本 薬 物 の 基 準 値 が な く ， 検 査 対 象 外 で あ っ た ． こ の 薬 物 は ， ヒ ト へ の 影 響 と し て ， 薬 剤 耐 性 菌 の 出 現 ， 菌 交 代 症 お よ び ア レ ル ギ ー を 誘 発 す る こ と が 危 惧 さ れ て い る (Turnidge et al., 2004)． そ こ で ， 食 品 と し て の 安 全 性 を 確 保 す る た め ，蜂 蜜 に 適 し た 分 析 法 を 開 発 し ，本 薬 物 の 残 留 実 態 を 把 握 す る こ と が 必 要 と な っ た ． 分 析 法 の 改 良 に あ た り ， ま ず ， フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 物 性 を 利 用 し て ， こ れ ら の 薬 物 を 抽 出 し か つ 測 定 の 妨 害 と な る 蜂 蜜 由 来 の 成 分 を 除 去 で き る 精 製 法 に つ い て 検 討 し た ． 次 に ， 既 報 の 検 出 限 界 値 で は ， 基 準 値 に 相 当 す る 残 留 薬 物 量 を 検 出 で き な い こ と か ら ， 測 定 方 法 と し て 簡 易 な 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 と 高 感 度 な LC (蛍 光 検 出 器 ) 法 を 併 用 す る た め の 条 件 検 討 を 行 っ た ． 本 章 で は ， 対 象 薬 物 を 腐 蛆 病 に 有 効 と さ れ る ノ ル フ ロ キ サ シ ン ， エ ン ロ フ ロ キ サ シ ン お よ び エ ン ロ フ ロ キ サ シ ン 代 謝 物 の シ プ ロ フ ロ キ サ シ ン と サ ラ フ ロ キ サ シ ン と し た ． さ ら に ， LC (蛍 光 検 出 器 ) 装 置 で 分 析 可 能 な 同 系 統 の ダ ノ フ ロ キ サ シ ン ， オ ル ビ フ ロ キ サ シ ン お よ び ジ フ ロ キ サ シ ン に つ い て も 検 討 し た (Figure 5)． O N N HN F COOH CH3 O N N HN F COOH Norfloxacin (NRFX) Ciprofloxacin (CPFX) O N N N F COOH O H3C N N N F COOH Enrofloxacin (ERFX) O N N HN F COOH F H F H3C 3 C Danofloxacin (DNFX)

Orobifloxacin (OBFX) Difloxacin (DFX)

F O N N N F COOH C H3 F N O N N F COOH H Sarafloxacin (SRFX) C H3

1− 1 実 験 方 法 1− 1− 1 試 料 分 析 条 件 の 検 討 で は ， 蜂 蜜 由 来 成 分 の 影 響 が 大 き い ソ バ 蜜 を 用 い た ． 妥 当 性 評 価 に は ，夾 雑 物 が 異 な る 蜂 蜜 の 代 表 と し て ，ア カ シ ア 蜜 ，百 花 蜜 お よ び ソ バ 蜜 を 使 用 し た ． 蜂 蜜 は 実 験 で 使 用 す る ま で ， 暗 所 に 室 温 で 保 存 し た ． 1− 1− 2 標 準 品 標 準 品 と し て ， ノ ル フ ロ キ サ シ ン ， シ プ ロ フ ロ キ サ シ ン ， 塩 酸 サ ラ フ ロ キ サ シ ン お よ び 塩 酸 ジ フ ロ キ サ シ ン (Sigma-Aldrich， Saint Louis, MO, USA)， メ シ ル 酸 ダ ノ フ ロ キ サ シ ン お よ び エ ン ロ フ ロ キ サ シ ン (Kanto Chemical Co., Tokyo, Japan)，オ ル ビ フ ロ キ サ シ ン (Hayashi Pure Chemical Industry, Osaka, Japan) を 使 用 し た ．

1− 1− 3 標 準 原 液

1− 1− 5 試 薬

(a) 超 純 水 は ， Milli-Q シ ス テ ム (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) を 用 い て 作 製 し た ．ア セ ト ニ ト リ ル (LC grade)，メ タ ノ ー ル (LC grade)，ギ 酸 (99%; LC/MS grade) ， ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 (100%; 生 化 学 用 ) お よ び ア ン モ ニ ア 水 (28%; 特 級 ) は ， Wako Pure Chemical Industries Ltd か ら 購 入 し た ．

1− 1− 6 薬 物 の 抽 出 と 精 製 法

十 分 に 攪 拌 し た 蜂 蜜 10.0 g を ポ リ プ ロ ピ レ ン 製 遠 心 管 (50 mL) 内 に 秤 量 し ，こ れ に Na2EDTA含 有 マ キ ル ベ ン 緩 衝 液 40 mL を 加 え た ．ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー (Vortex-Genie 2； Scientific Industries Inc., Bohemia, NY, USA) で 十 分 に 混 和 し た 後 ， 超 音 波 (Bransonic 5510； Branson, Danbury, CT, USA) に 10 分 間 か け た ． こ の 混 液 を 高 速 冷 却 遠 心 器 (AX-320； Tomy Seiko Co., Tokyo, Japan) を 用 い て 遠 心 を 行 い (1840×g， 10 分 間 ， 15℃ )， 得 ら れ た 上 清 画 分 を 綿 栓 で 濾 過 し た ．

メ タ ノ ー ル 10 mL，次 に pH 4.0 の Na2EDTA 含 有 マ キ ル ベ ン 緩 衝 液 10 mL を 用 い て コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ し て お い た Mixed-mode cation-exchange (MCX) カ ラ ム (6 mL/150 mg, Waters Corp.) に ， 2 mL/min の 速 度 で 上 清 画 分 を 滴 下 し た ． 続 い て ， MCX カ ラ ム を pH 4.5 の リ ン 酸 緩 衝 液 10 mL を 用 い て 洗 浄 し ，減 圧 下 (10 mmHg) で 3 分 間 吸 引 乾 燥 し た ． さ ら に ， メ タ ノ ー ル 5 mL， ア セ ト ニ ト リ ル 5 mL， お よ び 再 び pH 4.5 の リ ン 酸 緩 衝 液 10 mL を 用 い て 洗 浄 し た ．

Sample (honey) 10.0 g

extract with Na₂EDTA-McIlvaine buffer (pH 4.0) 40 mL

mix on a vortex, sonicate (10 min)

centrifuge (1840 x g, 10 min, 15o_C)

The aqueous layer MCX column

wash with phosphate buffer (pH 4.5) 10 mL

wash with methanol 5 mL, acetonitrile 5 mL, phosphate buffer (pH 4.5) 10 mL

attache to the top of the MAX column

MCX – MAX dual column

elute into the MAX column directly from the MCX column

with 15% (v/v) methanol – 80% (v/v) water – 5% (v/v) ammonium solution 10 mL

MCX column was removed

MAX column

wash with 5% ammonium solution 1 mL

wash with methanol 1 mL

elute from MAX column with

5% (v/v) 1-heptanesulfonic acid sodium salt solution (0.1 M) – 95% (v/v) methanol 10 mL

The eluate

evaporate to dryness

The residue

redissolve in phosphate buffer (pH 7.0) 250 μL

The examination solution

dilute 4-fold with phosphate buffer (pH 7.0)

Microbiological screening LC/FL

1− 1− 7 測 定 法

1− 1− 7− 1 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法

(a) 試 験 平 板 の 作 製 ： ペ プ ト ン (Becton Dickinson & Co. , Sparks, MD, USA) 5.0 g， ラ ブ − レ ム コ 末 (細 菌 用 牛 肉 エ キ ス ) (Oxoid Ltd, Cambridge, UK) 3.0 g お よ び 精 製 寒 天 (Oxoid Ltd) 15.0 g を 超 純 水 1 L に 溶 解 し ， 121℃ に て ， 15 分 間 の 高 圧 蒸 気 滅 菌 (SX-300; Tomy Seiko Co.) を 行 っ た 後 ， 50℃ で 保 温 し た ． こ の 培 地 に ， 市 販 芽 胞 液 Bacillus subtilis BGA (BGA; Merck KGaA, Darmstadt, Germany) を 105 CFU/mL の 濃 度 に な る よ う に 混 和 し た ． 菌 を 混 和 し 培 地 を 8 mL ず つ シ ャ ー レ (直 径 90 mm， 深 さ 15 mm， 電 子 線 滅 菌 済 ； Nissui Pharmaceutical Co., Tokyo, Japan) に 分 注 し ， 試 験 平 板 (Metal (-) LLA) を 作 成 し た ． 他 に ， 検 討 し た 平 板 と し て ， 抗 生 物 質 検 査 用 培 地 5 (AM 5;Becton Dickinson & Co.) は 25.5 g を ，ラ ブ − レ ム コ 寒 天 培 地 (Metal (+) LLA; Oxoid Ltd) は 23.0 g を 超 純 水 1 L に 溶 解 し ， 同 じ 方 法 で 試 験 平 板 (AM 5 と Metal (+) LLA) を 作 製 し た ．

(b) 測 定 方 法 ： ペ ー パ ー デ ィ ス ク (直 径 10 mm, 厚 さ 1.5 mm， 吸 水 量 0.2 mL; Advantec Toyo Roshi Kaisha Ltd, Tokyo, Japan) を 使 用 前 に ，121℃ に て ，15 分 間 の 高 圧 蒸 気 滅 菌 を 行 っ た ． 0.5g の Tween 80®

(Wako Pure Chemical Industries Ltd) を 100 mL の 超 純 水 に 混 和 し た (用 時 調 製 )．乾 燥 し た ペ ー パ ー デ ィ ス ク に ，150 μL の 0.5% Tween 80®を 滴 下 し ，再 度 乾 燥 さ せ て か ら 測 定 に 用 い た (0.5％ Tween 80®含 有 ペ ー パ ー デ ィ ス ク )． こ の 0.5% Tween 80®含 有 ペ ー パ ー デ ィ ス ク を 試 験 平 板 に 留 置 し ， そ の 直 上 か ら 試 験 溶 液 150 μL を 滴 下 し ，30℃ で 16 か ら 18 時 間 培 養 し た 後 ，ペ ー パ ー デ ィ ス ク の 周 囲 の 阻 止 円 の 直 径 を デ ジ タ ル ノ ギ ス (CD-15; Mitutoyo Co., Kanagawa, Japan) で 計 測 し た ．

(c) 試 験 平 板 の 力 価 ： 試 験 平 板 の 力 価 は ， ノ ル フ ロ キ サ シ ン (0.5 μg/mL, 150 μL) を 用 い て 判 定 し た ． 本 実 験 条 件 下 で の 阻 止 円 の 直 径 は 18.5±1.0 mm で あ っ た ．

1− 1− 7− 2 LC (蛍 光 検 出 器 ) 法 お よ び LC/MS/MS 法

(a) LC 条 件 ： 分 離 は ， LC-10A シ リ ー ズ (Shimadzu Co., Kyoto, Japan) 装 置 を 用 い て 行 っ た ． 分 析 カ ラ ム は ， CAPCELL-PAK MGⅢ (150×2.0 mm id, 5 μm pd; Shiseido, Tokyo, Japan) を 接 続 し た ．ノ ナ フ ル オ ロ ペ ン タ ン 酸 (97% NFPA； Analytical grade， Kanto Chemical Co.) 2 mL を 1 L の 超 純 水 に 混 和 し 0.2% に し た (用 時 調 製 )． こ の 0.2% NFPA 水 溶 液 と ア セ ト ニ ト リ ル (39+11, v/v) 混 液 を 流 速 0.2 mL/min で 移 動 相 と し て 用 い た ． カ ラ ム 温 度 は 40℃ ， 試 験 溶 液 の 注 入 量 は 10 μL (蛍 光 検 出 器 ) も し く は 5 μL (MS 検 出 器 ) と し た ．

(b) 検 出 ： 蛍 光 検 出 器 (RF-10AXL； 励 起 波 長 280 nm，蛍 光 波 長 445 nm) お よ び MS 検 出 器 (Discovery MAX； Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) を 使 用 し た ． MS/MS の イ オ ン 化 は ， エ レ ク ト ロ ス プ レ イ モ ー ド (ポ ジ テ ィ ブ ) で 行 い ， ス プ レ ー 電 圧 は 5 kV， 脱 溶 媒 温 度 を 312oCお よ び キ ャ ピ ラ リ ー 温 度 を 210oC に 設 定 し た ． ガ ス は ， シ ー ス ガ ス (N2， 60 arb)， オ グ ジ ュ ア リ ー ガ ス (N2， 55 arb) お よ び コ リ ジ ョ ン ガ ス (Ar， 1.0 arb) を 用 い た ． 各 フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の Multiple-reaction monitoring (MRM) 条 件 を Table 2 に 示 す ．

Table 2 Multiple-reaction monitoring parameters of fluoroquinolones.

Fluoroquinolones Transition, m/z Collision energy, eV Tube lens, V

NRFX 320→233a 17 127 320→276 9 CPFX 332→245a 11 119 332→288 8 ERFX 360→316a 9 116 360→245 19

a _{Ion used for quantification.}

1− 1− 8 妥 当 性 評 価 試 験

7 種 の フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 が 検 出 さ れ な い こ と を 本 法 で 確 認 し た 3 種 の 蜂 蜜 10.0 g に ，100 μL の 混 合 標 準 溶 液 2 を 添 加 し ，ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー で 混 和 し た 後 ， Figure 6 に 示 す 手 順 に 従 っ て 試 験 溶 液 の 調 製 を 行 っ た ． 各 薬 物 の 定 量 に ， LC (蛍 光 検 出 器 ) 法 を 用 い た ． 一 日 2 試 行 を 5 日 間 行 い ， Figure 7 に 示 す 4 つ の 性 能 パ ラ メ ー タ ー ， 選 択 性 (Selectivity) ， 真 度 (Trueness) ， 精 度 (Precision) お よ び 定 量 下 限 値 (LOQ) を 求 め ， ガ イ ド ラ イ ン の 基 準 と 比 較 し た ．

Good separation of the peaks of target compounds from the peaks of the matrix

Trueness, Precision Fortification level, μg/kg Trueness, % Repeatability, % Intermediate precision, % ≦ 1 70-120 30> 35> 1 ＜X ≦ 10 70-120 25> 30> 10 ＜X ≦ 100 70-120 15> 20> Selectivity Limit of Quantification

Performance characteristics of single-laboratory validation study

Selectivity Trueness Precision Repeatability Intermediate precision Limit of Quantification S/N=10

1－ 1－ 9 残 留 実 態 調 査 本 分 析 法 を 用 い て ， 2007 年 か ら 2012 年 に 東 京 都 内 で 購 入 し た 蜂 蜜 160 検 体 に つ い て 残 留 フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 実 態 調 査 を 行 っ た ．蜜 源 お よ び 原 産 国 を Table 3 に 示 す ．微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 に て 阻 止 円 の 形 成 が 観 察 さ れ た 試 料 に つ い て ， LC (蛍 光 検 出 器 ) お よ び LC/MS/MS を 用 い 測 定 し た ． 蜂 蜜 中 に 薬 物 の 残 留 が 認 め ら れ た 場 合 ， さ ら に 2 試 行 を 行 い ， 3 試 行 の 定 量 結 果 を 平 均 し た ．

Table 3 Honey samples.

(a) Flower of origin Sample (b) Country of origin Sample

Multiflo wer (百 花 ) 63 Japan 26

Acacia (アカシア) 35 China 37

Clover (クローバー) 16 Argentina 16

Lotus (レンゲ) 10 Hungary 16

Orange (オレンジ) 8 New Zealand 10

Buckwheat (ソバ) 5 Canada 9

Manuka (マヌカ) 3 Italy 8

Eucalyptus (ユーカリ) 2 Spain 5

Sunflower (ヒマワリ) 2 Switzerland 5

Litchi (ライチ) 2 USA 4

Rose (バラ) 2 Great Britain 3

Armand (アーモンド) 1 France 3

Chestnut (クリ) 1 Australia 2

Coffee (コーヒー) 1 Taiwan 2

Golden rods (ゴールデンロッド) 1 Other countries 14

1－ 2 結 果 お よ び 考 察 1－ 2－ 1 薬 物 の 抽 出 と 精 製 法 従 来 の 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 で 得 ら れ た 逆 相 と 強 陽 イ オ ン 交 換 と の ミ ッ ク ス モ ー ド で あ る MCX カ ラ ム で 精 製 し た 溶 液 を ， LC (蛍 光 検 出 器 ) で 測 定 し た 結 果 を Figure 8 に 示 す ． ベ ー ス ラ イ ン が Figure 4a の そ れ よ り も 早 く 低 下 し ， ノ ル フ ロ キ サ シ ン の ピ ー ク が 観 察 さ れ た ． し か し な が ら ， こ の 分 離 能 で は 定 量 は 出 来 な か っ た ．

Figure 8 LC/FL chromatogram of positive honey samples (Figure 3b) prepared using the MCX column.

10 0 In te n si ty

Retention time (min)

10 0 In te n si ty

Retention time (min)

0 10 20 30 40 50

O N N HN F COOH CH3

Carboxylic acid function

Piperazinyl funciton SO3- MCX MAX N+ HLB N O NRFX N O N O フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 は ，Figure 9 に 示 す よ う に ピ ペ ラ ジ ニ ル 基 (pKa 8 か ら 9) と カ ル ボ キ シ ル 基 (pKa 5) を 有 す る 両 性 物 質 で あ る ．そ の た め ，MCX カ ラ ム に 保 持 さ れ る 際 ， 逆 相 相 互 作 用 に 加 え ， ピ ペ ラ ジ ニ ル 基 と ス ル ホ ン 酸 基 と の 強 陽 イ オ ン 交 換 相 互 作 用 が 働 く と 考 え ら れ る ． 加 え て ， フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 は カ ル ボ キ シ ル 基 を 有 す る の で ， 3 級 ア ミ ノ 基 の 官 能 基 が 付 加 さ れ 強 陰 イ オ ン 交 換 型 ミ ッ ク ス モ ー ド 固 相 で あ る MAX カ ラ ム に も 保 持 さ れ る と 考 え ら れ る ．

Figure 9 Chemical structure of each solid-phase-extraction column, and interaction with NRFX.

水 － 5% (v/v) ア ン モ ニ ア 水 混 液 お よ び 20% (v/v) メ タ ノ ー ル － 75% (v/v) 水 － 5% (v/v) ア ン モ ニ ア 水 混 液 を 用 い ， フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 を MCX カ ラ ム か ら そ れ ぞ れ 溶 出 さ せ た ． メ タ ノ ー ル 濃 度 が 20%の 場 合 ， エ ン ロ フ ロ キ サ シ ン ， オ ル ビ フ ロ キ サ シ ン お よ び ジ フ ロ キ サ シ ン の 溶 出 が 良 好 で あ る こ と が 示 さ れ た (Figure 10a)． 次 に ，MAX カ ラ ム へ の 保 持 率 を 次 の よ う に 算 出 し た ．上 記 の メ タ ノ ー ル 濃 度 の 異 な る 3 種 の 混 液 10 mL に フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 混 合 標 準 液 1 を 100 L 添 加 し ，MAX カ ラ ム に 滴 下 し た ．そ の 後 ，5% (v/v) ク エ ン 酸 (0.1M)－ 95% (v/v) メ タ ノ ー ル 混 液 5 mL を 用 い て MAX カ ラ ム か ら 溶 出 さ せ た ． メ タ ノ ー ル 濃 度 が 10% の 場 合 ， 薬 物 の 保 持 が 良 好 と な っ た (Figure 10b)．そ こ で ，以 後 の 実 験 で は ，MCX お よ び MAX カ ラ ム を 連 結 し ，MCX に 続 い て MAX カ ラ ム へ 連 続 的 に 滴 下 で き る 混 液 の 組 成 を 15% (v/v) メ タ ノ ー ル － 80% (v/v) 水 － 5% (v/v) ア ン モ ニ ア 水 混 液 と し た ．

Figure 10 Effects of the proportion of methanol in the solution eluted from the MCX column into the MAX column (a) on the recoveries of NRFX, CPFX, DNFX, ERFX, OBFX, SRFX, and DFX from the MCX column and (b) on the retentions of NRFX, CPFX, DNFX, ERFX, OBFX, SRFX, and DFX in the MAX column. Each value represents the mean±SEM of five replications.

次 に ， MAX カ ラ ム に 保 持 さ せ た 各 薬 物 の 回 収 率 を 上 げ る た め ， MAX カ ラ ム か ら の 溶 出 溶 液 の 組 成 に つ い て 検 討 し た ．MAX カ ラ ム は 強 陰 イ オ ン 交 換 カ ラ ム な の で ，カ ウ ン タ ー イ オ ン で あ る 陰 イ オ ン 性 物 質 と し て ， ギ 酸 ， ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 ， 炭 酸 ， ク エ ン 酸 お よ び ヘ プ タ ン ス ル ホ ン 酸 の 可 否 に つ い て 検 討 し た ． 前 述 し た 15% (v/v) メ タ ノ ー ル － 80% (v/v) 水 － 5% (v/v) ア ン モ ニ ア 水 混 液 10 mL に ， フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 混 合 標 準 液 1 を 100 L 添 加 し ，MAX カ ラ ム に 負 荷 し た ．2% (v/v) ギ 酸 － 98% (v/v) メ タ ノ ー ル ， 2% (v/v) ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 － 98% (v/v) メ タ ノ ー ル ， 5% (v/v) 炭 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 (0.1 M)－ 95% (v/v) メ タ ノ ー ル ， 5% (v/v) ク エ ン 酸 水 溶 液 (0.1 M) － 95% (v/v) メ タ ノ ー ル お よ び 5% (v/v) 1-ヘ プ タ ン ス ル ホ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 (0.1 M)－ 95% (v/v) メ タ ノ ー ル の 各 5 mL を 用 い て ， 薬 物 の 溶 出 液 へ の 回 収 率 を 算 出 し た ． そ の 結 果 ，ヘ プ タ ン ス ル ホ ン 酸 を カ ウ ン タ ー イ オ ン と し た 時 に ，MAX カ ラ ム か ら の フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 溶 出 率 が 最 も 高 く な る こ と が 示 さ れ た (Figure 11)．そ こ で ，MAX カ ラ ム か ら フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 を 溶 出 さ せ る 溶 液 は 5% (v/v) 1-ヘ プ タ ン ス ル ホ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 (0.1 M)－ 95% (v/v) メ タ ノ ー ル を 用 い る こ と と し た ．

Figure 11 Effect of the anions present in the solution eluted from the MAX column on the recoveries of NRFX, CPFX, DNFX, ERFX, OBFX, SRFX, and DFX. Each value is the mean±SEM of five replications.

夾 雑 物 の 多 い ソ バ 蜜 を ，MCX お よ び MAX カ ラ ム の 両 方 を 用 い て 精 製 し た 時 の 効 果 を Figure 12b に 示 す ． HLB カ ラ ム の み で 精 製 を 行 っ た Figure 12a に 比 べ ， 溶 出 溶 液 に 蜂 蜜 由 来 の 色 は 残 ら ず ， LC (蛍 光 検 出 器 ) ク ロ マ ト グ ラ ム で 観 察 さ れ た 蜂 蜜 由 来 の 夾 雑 物 に よ る 妨 害 ピ ー ク を 除 去 で き た ．

Figure 12 Effect of solid-phase-extraction column on color of extracted solution, and LC chromatograms of buckwheat extract (a) fortified with 10 g/kg NRFX, CPFX, ERFX, OBFX, SRFX, DFX, and 2 g/kg DNFX prepared using the official Japanese method involved the use of a polymeric column and (b) fortified with 10 g/kg NRFX, CPFX, ERFX, OBFX, SRFX, DFX, and 2 g/kg DNFX prepared with this method using a dual MCX-MAX column.

測 定 す る 溶 液 中 の 夾 雑 物 の 低 減 は ， Figure 13 に 示 す よ う に 行 わ れ た と 考 え ら れ る ． 他 の 畜 水 産 食 品 と 異 な り ， 蜂 蜜 の 主 成 分 は 糖 類 (約 80%) お よ び 水 分 (約 20%) で ,他 に ビ タ ミ ン ， ミ ネ ラ ル ， 有 機 酸 ， ア ミ ノ 酸 お よ び フ ラ ボ ノ イ ド 等 が 含 ま れ る (食 品 成 分 表 ， 2013， Ćirić et al.， 2012， González-Miret et al.， 2005)． さ ら に ， 蜂 蜜 の 色 調 を 変 化 さ せ る「 褐 変 化 」の 原 因 と な る 5-ヒ ド ロ キ シ フ ル フ ラ ー ル が メ ト ラ ー 反 応 を 介 し 0 10 20 30 40 50 10 0 In te n si ty

Retention time (min)

DNFX SRFX DFX ERFX OBFX NRFX CPFX DNFX SRFX DFX ERFX OBFX NRFX CPFX

(a)

(b)

Polymeric cartridge _{Dual MCX-MAX cartridge}

て 生 成 さ れ る ．こ れ ら が 機 器 分 析 測 定 の 妨 害 と な っ て い る (Lopez et al.，2008)．ま ず ， MCX カ ラ ム に フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 を 保 持 さ せ ，高 い 極 性 を 有 す る 糖 は カ ラ ム 内 に 保 持 さ れ ず に 流 出 し ， 続 く カ ラ ム 内 の 洗 浄 に よ り 酸 性 物 質 の 有 機 酸 お よ び フ ラ ボ ノ イ ド を 流 出 さ せ る ．次 に ，MAX カ ラ ム に 薬 物 を 保 持 さ せ ，そ の 洗 浄 に よ り 塩 基 性 物 質 の 塩 基 性 ア ミ ノ 酸 や コ リ ン な ど を 流 出 さ せ た ． こ の 結 果 ， Figure 12b に 示 す よ う に ， フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の ピ ー ク の 検 出 お よ び 定 量 が 可 能 と な っ た ．

Figure 13 Schematic representation of this cleanup procedure .

Extracted solution

① Load Sample

③ Elute from MCX column and load to MAX column

Hydrophilic matrix Acidic matrix Basic matrix

Amphoteric materials

② Wash

⑤ Elute from MAX column ④ Wash

MCX column

MAX column

Acidic matrix were eluted.

Basic matrix and amphoteric materials were eluted from MCX column, and loaded to MAX column.

Basic matrix were eluted.

1－ 2－ 2 LC (蛍 光 検 出 器 ) を 用 い た 測 定 法 の 条 件

LC (蛍 光 検 出 器 ) 法 の LC で の 分 離 条 件 に つ い て 検 討 し た ．カ ラ ム は CAPCELL-PAK MGⅢ (150×2.0 mm id, 5 m pd) を 用 い た ．イ オ ン ペ ア に NFPA を 用 い ，移 動 相 に 78% (v/v) NFPA 水 溶 液 (0.2%)－ 22% (v/v) ア セ ト ニ ト リ ル 混 液 を 用 い た 時 ， 液 体 ク ロ マ ト グ ラ ム は 7 種 の フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 高 い 分 離 能 を 示 し た (Figure 14)．

Figure 14 Liquid Chromatogram of standard solution of 6 fluoroquinolones (0.5 g/mL) and DNFX (0.1 g/mL). 混 合 標 準 溶 液 (6 薬 物 ; 0.01 か ら 1 g/mL， ダ ノ フ ロ キ サ シ ン ; 0.002 か ら 0.2 g/mL) の 7 段 階 の 濃 度 に 対 し ， ピ ー ク 面 積 値 を そ れ ぞ れ プ ロ ッ ト し ， 各 フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 検 量 線 を 作 製 し た と こ ろ ，検 量 線 は い ず れ も 直 線 性 を 示 し ，Figure 15 に 示 す よ う に そ れ ら の 相 関 係 数 は い ず れ も r= 0.9997 以 上 で あ っ た ． 0 10 20 30 40 50 60 SRFX DFX OBFX CPFX DNFX NRFX ERFX 2 1 0 In te n si ty

1－ 2－ 3 妥 当 性 評 価 試 験 本 分 析 法 に つ い て 妥 当 性 評 価 試 験 を 行 っ た ． 妥 当 性 評 価 は 食 品 由 来 成 分 の 影 響 を 鑑 み て ， 食 品 ご と に 行 う よ う に 規 定 さ れ て い る ． 蜂 蜜 由 来 の 成 分 に よ る 色 や 透 過 性 に よ っ て 分 析 に 与 え る 影 響 が 異 な る (Lopez et al., 2008)． そ こ で ， 蜂 蜜 の 色 が 異 な る 代 表 的 な 試 料 と し て ， ア カ シ ア 蜜 (淡 黄 色 )， 百 花 蜜 (黄 色 ) お よ び ソ バ 蜜 (茶 色 ) を 使 用 し た ． 1－ 2－ 3－ 1 選 択 性 ア カ シ ア 蜜 ，百 花 蜜 お よ び ソ バ 蜜 に 混 合 標 準 溶 液 2 を 添 加 し た 時 の 典 型 的 な LC (蛍 光 検 出 器 ) の ク ロ マ ト グ ラ ム を Figure 16 に 示 す ．フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 7 薬 物 の ピ ー ク と ア カ シ ア 蜜 ， 百 花 蜜 お よ び ソ バ 蜜 由 来 の 夾 雑 物 に よ る ピ ー ク と の 分 離 は い ず れ も 良 好 で ， 本 分 析 条 件 下 で 夾 雑 ピ ー ク が フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 定 性 お よ び 定 量 に 影 響 を 及 ぼ さ ず ， か つ ， そ の 選 択 性 は ガ イ ド ラ イ ン の 基 準 に 適 合 し た ．

Figure 16 LC chromatograms of acacia, multiflower, and buckwheat honey fortified with 10 g/kg NRFX, CPFX, ERFX, OBFX, SRFX, DFX, and 2 g/kg DNFX, (a), (c), (e) : fortified, (b), (d), (f ) : unfortified, in each window.

acacia multiflower 0 10 20 30 40 50 buckwheat (b) SRFX DFX ERFX OBFX CPFX DNFX NRFX 10 0 (a) (d) SRFX DFX ERFX OBFX CPFX DNFX NRFX (c) (f) (e) In te n si ty 10 0 SRFX DFX ERFX OBFX CPFX DNFX NRFX

Retention time (min)

1－ 2－ 3－ 2 真 度 お よ び 精 度 本 分 析 法 を 用 い た 時 の フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 真 度 お よ び 精 度 を 算 出 し た 結 果 を Table 4 に 示 す ． 真 度 70.8 か ら 88.1%， 併 行 精 度 4.7% 以 下 お よ び 室 内 精 度 5.9% 以 下 で ， い ず れ の パ ラ メ ー タ ー も Figure 7 に 示 す 厚 生 労 働 省 の ガ イ ド ラ イ ン の 基 準 (真 度 70～ 120%，併 行 精 度 25% 未 満 お よ び 室 内 精 度 30% 未 満 ) に 適 合 し た ．本 分 析 法 は ， 前 処 理 に お け る 精 製 度 を 上 げ た こ と で ， 蜂 蜜 の 蜜 源 が 異 な っ て も 蜂 蜜 由 来 成 分 の 影 響 を ほ と ん ど 受 け る こ と な く ， 定 性 お よ び 定 量 の 精 度 を 向 上 さ せ る こ と が で き た ．

Table 4 Results for single-laboratory validation of the proposed methods for fluoroquinolones.

Analyte Fortification level, g/kg Trueness ,%a _{Repeatability, % Intermediate precision, %}

Acacia NRFX 10 73.3 3.2 3.3 CPFX 10 74.1 2.9 2.9 DNFX 2 86.3 3.5 5.9 ERFX 10 75.4 2.7 4.3 OBFX 10 82.5 2.6 4.4 SRFX 10 75.5 1.8 3.7 DFX 10 70.8 2.4 3.7 Multiflower NRFX 10 74.0 2.3 3.8 CPFX 10 72.8 2.9 4.1 DNFX 2 83.3 3.2 5.0 ERFX 10 74.6 3.2 3.3 OBFX 10 81.3 4.7 5.6 SRFX 10 74.5 2.0 3.8 DFX 10 70.8 0.6 1.4 Buckwheat NRFX 10 76.0 1.9 2.4 CPFX 10 73.2 2.9 4.0 DNFX 2 88.1 2.9 5.3 ERFX 10 76.0 3.8 4.7 OBFX 10 87.0 4.3 4.5 SRFX 10 75.3 3.1 3.3 DFX 10 71.9 2.6 3.3 a

1－ 2－ 3－ 3 LC (蛍 光 検 出 器 ) 測 定 法 の 検 出 限 界 値 お よ び 定 量 下 限 値

LC ( 蛍 光 検 出 器 ) 測 定 で 得 ら れ た 対 象 薬 物 の ピ ー ク 前 後 の ベ ー ス ラ イ ン に 対 し S/N=3 以 上 と な る 濃 度 (検 出 限 界 値 ； Limit of detection； LOD) お よ び S/N=10 以 上 と な る 濃 度 (定 量 下 限 値 ； Limit of quantitation； LOQ) を 求 め た ． そ の 結 果 ， Table 5 に 示 す よ う に ， 本 分 析 法 の 検 出 限 界 値 は ダ ノ フ ロ キ サ シ ン が 0.6 g/kg と な り ， 他 の 薬 物 は い ず れ も 2g/kg と な っ た ． 定 量 下 限 値 は ダ ノ フ ロ キ サ シ ン が 2 g/kg， ノ ル フ ロ キ サ シ ン が 7g/kg と な り ，そ れ 以 外 の 薬 物 は い ず れ も 5 g/kg と な っ た ．ポ ジ テ ィ ブ リ ス ト 制 で の フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 残 留 基 準 値 は ， 蜂 蜜 に は 設 定 さ れ て い な い の で ，一 律 基 準 値 10 g/kg を 検 出 で き る 方 法 が 必 要 で あ る ．本 分 析 法 は ，蜂 蜜 中 の フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 を 十 分 に 検 出 で き る 能 力 を 有 す る こ と を 示 し た ．

Table 5 Limit of detection (LOD) and Limit of quantitation (LOQ) values for the fluoroquinolones by LC/FL.

Fluoroquinolones LOD,g/kg LOQ,g/kg

1－ 2－ 4 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 の 測 定 条 件 と 検 出 限 界 値

1－ 2－ 4－ 1 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 の 測 定 条 件

微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ の 条 件 検 討 を 行 う た め ， 試 験 菌 に フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 へ の 感 受 性 の 高 い Bacillus subtilus を 用 い た (Horie et al., 2008)．培 地 に AM 5 を 用 い て 試 験 平 板 を 作 製 し ， フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 抗 菌 活 性 の 検 出 限 界 値 を 調 べ た ．ノ ル フ ロ キ サ シ ン 標 準 溶 液 で は ，阻 止 円 を 検 出 で き た 最 低 濃 度 が 0.5 g/mL で あ っ た ．こ れ は ，試 料 を 40 倍 に 濃 縮 し て も ，従 来 の 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 の 測 定 条 件 で は 蜂 蜜 中 の 10 g/kg の 薬 物 残 留 量 を 検 出 で き な い ． そ こ で ， 本 法 の 検 出 感 度 の 改 善 を 行 っ た ． 吸 水 量 の 多 い ペ ー パ ー デ ィ ス ク を 用 い ， 溶 液 の 滴 下 量 を 70L か ら 150 L に 増 量 し た ．そ の 結 果 ，阻 止 円 の 直 径 は 1 か ら 2 mm 大 き く な っ た も の の ， 薬 物 の 検 出 感 度 は 上 昇 し な か っ た ． 菌 の 濃 度 を 105 CFU/mL か ら 104 あ る い は 103 CFU/mL へ と 低 下 さ せ る と ， 菌 の 生 育 が 悪 化 し ， 阻 止 円 の 境 界 線 が 不 明 瞭 に な る だ け で ， 検 出 感 度 を 上 昇 さ せ る こ と は で き な か っ た ． 次 に ， 標 準 溶 液 の 希 釈 液 の pH を pH 4.5，7.0，8.0 お よ び 10.0 で 検 討 し た と こ ろ ， pH 7.0 で 最 も 検 出 感 度 が 高 く な っ た の で ，以 後 の 実 験 で は 希 釈 液 を pH 7.0 と し た ．さ ら に ，金 属 含 有 量 の 少 な い 精 製 寒 天 を 用 い て ， 試 験 平 板 (Metal (-) LLA) を 作 製 し た ． 寒 天 以 外 同 じ 成 分 の ラ ブ － レ ム コ 寒 天 培 地 で 作 製 し た 試 験 平 板 (Metal (+) LLA) を 対 照 と し た ．Figure 17 に ，ノ ル フ ロ キ サ シ ン の 標 準 溶 液 各 濃 度 (y 軸 ) に 対 し ，阻 止 円 の 直 径 (x 軸 ) を プ ロ ッ ト し た 検 量 線 を 示 す ．

Figure 17 Effect of microbiological screening conditions on sensitivity of NRFX .

緑 線 で 示 す Metal (+) LLA 培 地 の 検 量 線 は ，対 照 群 で あ る 青 で 示 す AM5 培 地 の そ れ と 同 様 の も の と な っ た ．一 方 ，オ レ ン ジ 線 で 示 す Metal (-) LLA 培 地 の 検 量 線 は ，緑 で 示 す Metal (+) LLA 培 地 の 検 量 線 よ り 右 方 向 に シ フ ト し た ． す な わ ち ， ノ ル フ ロ キ サ C o n c e n tr a ti o n o f N R F X (m g /m L ) 10 12 14 16 18 20 22 24 26 1 0.1

Low Sensitivity High

Diameter of the inhibition zone (mm)

Test plate The Disk

● AM5 Not processed

● Metal (+) LLA Not processed

● Metal (-) LLA Not processed

シ ン へ の 試 験 平 板 の 感 受 性 上 昇 が 示 さ れ ， 検 出 限 界 値 も 0.5 か ら 0.3 g/mL と 低 下 し た ．予 め 界 面 活 性 剤 Tween 80®_{で 処 理 し た デ ィ ス ク を 用 い る と ，そ の 検 量 線 (赤 ) は さ} ら に 右 方 へ シ フ ト し ， 検 出 限 界 値 も 0.2 g/mL に な り ， 従 来 法 よ り 高 感 度 と な る 検 出 が 可 能 と な っ た ． こ れ は ， pure agar を 用 い る こ と で ，培 地 に 含 ま れ る 金 属 イ オ ン の 配 位 に よ る フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 抗 菌 活 性 低 下 (Ferrini et al., 2006) を 回 避 で き た こ と に 加 え ，Tween 80®_{を 用 い る こ と で ，薬 物 の 培 地 へ の 拡 散 効 率 を 上 げ る こ と} が で き た た め と 考 え ら れ た ． こ れ ら の 結 果 か ら ， 以 後 の 実 験 で は 検 査 平 板 に Metal (-) LLA 培 地 お よ び Tween 80®を 処 理 し た デ ィ ス ク を 用 い る こ と と し た ． 1－ 2－ 4－ 2 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 の 検 出 限 界 値 本 分 析 法 の 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 に お け る 検 出 限 界 値 を 次 の よ う に 求 め た ． 薬 物 を 添 加 し て い な い ソ バ 蜜 の 抽 出 お よ び 精 製 を 行 い ， 試 験 溶 液 を 作 成 す る 際 ， 各 薬 物 の 標 準 溶 液 で 残 さ を 溶 解 し ， マ ト リ ッ ク ス 存 在 下 の 各 フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 検 出 限 界 値 を 求 め た ．検 出 限 界 値 は ，阻 止 円 直 径 が 12 mm に な る 濃 度 と し た ．そ の 結 果 ， 7 種 の フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 検 出 限 界 値 は Table 6 に 示 す よ う に 0.04 か ら 0.25 g/mL と な っ た ．こ の 濃 度 か ら 蜂 蜜 か ら 検 出 で き る 限 界 値 を 最 終 希 釈 倍 率 濃 度 と 回 収 率 で 補 正 し て 求 め た と こ ろ ，1 か ら 9 g/kg で あ っ た ．こ の 検 出 限 界 濃 度 の 前 後 3 濃 度 の 薬 物 を ア カ シ ア 蜜 ， 百 花 蜜 お よ び ソ バ 蜜 に そ れ ぞ れ 添 加 し ， Figure 6 に 従 っ て 3 試 行 の 試 験 を 行 い ， 試 行 濃 度 内 で 阻 止 円 が 検 出 さ れ た 最 低 濃 度 を 検 出 限 界 値 と し た ． そ の 結 果 ， 本 分 析 法 の 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ で 蜂 蜜 か ら 検 出 で き る 各 薬 物 の 限 界 値 は ， 2 か ら 9 g/kg と な っ た (Table 6)． 従 来 法 の 検 出 限 界 値 は ， 20 か ら 50 g/kg で あ っ た の で ，法 的 な 一 律 基 準 値 10 g/kg を 検 出 で き な か っ た ．そ の 一 方 で ， 本 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 は ， 十 分 に 検 出 で き る 能 力 を 有 す る こ と を 示 し た ．

Table 6 LOD values obtained for the fluoroquinolones by the microbiological method .

Fluoroquinolones LOD of standard solution under_{buckwheat matrix ,g/mL} LOD in honey,g/kg

微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 は ， 用 い た 試 験 菌 に 感 受 性 の あ る 抗 菌 性 物 質 で あ れ ば ， 目 的 物 質 以 外 で も 抗 菌 活 性 と し て 検 出 し て し ま う 可 能 性 が あ る ． 蜂 蜜 に も 抗 菌 性 物 質 が 含 ま れ て い る が ， 今 回 用 い た 3 種 の 蜂 蜜 を 本 法 で 分 析 し た と こ ろ ， 蜂 蜜 成 分 に 由 来 す る 擬 陽 性 は 検 出 さ れ な か っ た ． さ ら に ， 他 の 抗 生 物 質 が 残 留 し て い た 場 合 ， 本 分 析 法 で 検 出 さ れ る 限 界 値 を 調 べ た ． ペ ニ シ リ ン 系 の ベ ン ジ ル ペ ニ シ リ ン ， テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 の オ キ シ テ ト ラ サ イ ク リ ン ， マ ク ロ ラ イ ド 系 の ミ ロ サ マ イ シ ン お よ び ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 の ゲ ン タ マ イ シ ン を 蜂 蜜 に 添 加 し ， 本 法 を 分 析 し た 時 の 検 出 限 界 値 は 250 g/kg 以 上 で あ っ た (Table 7)． こ の 値 は ， 他 の 抗 生 物 質 の い ず れ の 残 留 基 準 値 よ り も 高 値 で あ り ， 本 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 は ， フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 を 高 い 選 択 性 を 持 っ て 検 出 で き る こ と を 示 し た ．

Table 7 LOD values obtained for other veterinary drugs with the microbiological method.

Veterinary drugs LOD in honey, g/kg MRL, g/kg

Benzylpenicillin >10000 4a

Oxytetracycline >10000 300a

Mirosamicin 10000 50a

Gentamicin 250 10b

a For honey.

b Default regulatory limit (uniform limit level) set by the positive list system for agricultural chemical residues in foods in Japan.

Table 8 Results of determination of fluoroquinolones by microbiological screening method and LC/FL of 17 positive honey samples.

Screening LC/FL

Sample

No. Flower of origin ID of inhibitionzone, mm Fluoroquinolonesidentified Concn, g/kg

1 Multiflower 30.6 NRFX 189 CPFX 32 ERFX 33 2 Acacia 25.3 NRFX 16 CPFX 10 3 Acacia 21.7 NRFX 19 CPFX 4a ERFX 3a 4 Multiflower 19.3 NRFX 8 CPFX 5 5 Multiflower 19.1 NRFX 8 CPFX 5 6 Multiflower 17.3 NRFX 9 7 Lotus 16.5 NRFX 9 CPFX 2a 8 Lotus 16.4 NRFX 8 CPFX 4a 9 Acacia 16.3 NRFX 7 CPFX 3a 10 Acacia 13.7 NRFX 5a CPFX 2a 11 Multiflower 13.0 NRFX 2a CPFX 4a 12 Multiflower 12.7 NRFX 2a ERFX 4a 13 Multiflower 12.6 NRFX 4a CPFX 3a 14 Multiflower 12.5 CPFX 4a 15 Multiflower 12.3 NRFX 4a CPFX 3a 16 Multiflower 12.2 NRFX 5a 17 Lotus 12.1 CPFX 2a

2008 年 に 抗 菌 性 物 質 の 残 留 が 推 定 さ れ た 蜂 蜜 (検 体 番 号 1) の 結 果 を Figure 18 に 例 示 す る ． 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ 法 に お い て ， 試 験 平 板 に 30.6 mm の 明 瞭 な 阻 止 円 が 形 成 さ れ (Figure 18a)，フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 の 残 留 が 推 定 さ れ た ．LC (蛍 光 検 出 器 ) を 用 い て 測 定 を 行 っ た と こ ろ ， 妨 害 ピ ー ク と 重 な ら ず ， ノ ル フ ロ キ サ シ ン 189 g/kg, シ プ ロ フ ロ キ サ シ ン 32 g/kg お よ び エ ン ロ フ ロ キ サ シ ン 33 g/kg が 検 出 さ れ た (Figure 18b)． さ ら に ， LC/MS/MS 法 で ， オ レ ン ジ で 示 す 定 量 イ オ ン お よ び 青 色 で 示 す 確 認 イ オ ン ピ ー ク と も に ， 上 記 薬 物 が 検 出 さ れ た (Figure 18c)．

Figure 18 Results of positive honey samples obtained in this methods. (a) Microbiological screening results on the plate of BGA in Metal (-) LLA.

(b) LC/FL chromatograms of (ー) positive honey samples, and (ー ) standard solutions 0.5 g/mL NRFX, CPFX, ERFX, OBFX, SRFX, DFX, and 0.1 g/mL DNFX.

(c) MRM chromatograms of positive honey samples. (ー) quantitative ions, and (ー) confirmative ions. 5 0 m/z 320→ 233 5 0 In te n si ty 12 15 18 2 0 2 0 12 15 18 1 0 1 0 14 17 20 NRFX CPFX ERFX

Retention time (min)

m/z 320→ 276 m/z 332→ 245 m/z 332→ 288 m/z 360→ 316 m/z 360→ 245

(c)

(a)

Diameter of the inhibition zone : 30.6 mm Diameter of the inhibition zone

(b)

Figure 18a の よ う に 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ で 阻 止 円 を 形 成 し た 全 検 体 か ら ， フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 合 成 抗 菌 薬 を 検 出 し た ． な お ， 蜂 蜜 の 分 析 の 際 に 微 生 物 学 的 ス ク リ ー ニ ン グ で 問 題 と な る 蜂 蜜 由 来 の 抗 菌 性 物 質 に よ る 阻 止 円 形 成 ， す な わ ち 擬 陽 性 が 本 分 析 法 で は 観 察 さ れ な い こ と も 確 認 し た ． ノ ル フ ロ キ サ シ ン を 検 出 し た 14 検 体 に つ い て ，LC (蛍 光 検 出 器 ) 法 と LC/MS/MS 法 で の 定 量 値 の 相 関 性 に つ い て 検 討 し た ． LC (蛍 光 検 出 器 ) 法 お よ び LC/MS/MS 法 に よ る 定 量 値 の 相 関 性 は r= 0.9896 で 高 く ，い ず れ の 方 法 で も 信 頼 性 の 高 い 定 量 値 が 得 ら れ る こ と が 示 さ れ た (Figure 19)．

Figure 19 Correlation between NRFX concentration determined by LC/FL and NRFX concentration determined by LC/MS/MS.

第 2 章 LC/MS/MS に よ る 蜂 蜜 中 残 留 フ マ ギ リ ン の 分 析 法

養 蜂 業 で 深 刻 な 問 題 と な っ て い る CCD を 誘 発 す る ノ ゼ マ 病 (家 畜 伝 染 病 予 防 法 で の 届 出 伝 染 病 に 指 定 ) は ，微 胞 子 虫 の Nosema apis お よ び Nosema ceranae に よ る 真 菌 症 で あ る (Huang et al.， 2007， Klee et al.， 2007， Williams et al.， 2008)． こ の 感 染 症 の 治 療 薬 に ， Aspergillus fumigatus に よ り 産 生 さ れ る ポ リ エ ン 系 抗 生 物 質 の フ マ ギ リ ン が 用 い ら れ る (Figure 20) (Katznelson et al., 1952， McCowen et al.， 1951)． ノ ゼ マ 病 に よ り 蜜 蜂 が 突 然 い な く な る 現 象 は ， フ マ ギ リ ン の 使 用 で 予 防 で き る こ と が 示 さ れ て い る (Higes et al.， 2008， Huang et al.， 2013)． 実 際 に ， フ マ ギ リ ン に よ る CCD 治 療 は 中 部 大 西 洋 養 蜂 研 究 お よ び 普 及 コ ン ソ ー シ ア ム (Mid-Atlantic Apiculture Research and Extension Consortium) で 推 奨 さ れ ，北 米 の 養 蜂 家 の 間 で 広 く 使 用 さ れ て い る (William et al., 2008)．

Figure 20 Chemical structure of fumagillin.

2－ 1 実 験 方 法

2－ 1－ 1 試 料

1－ 1－ 1 と 同 様 の も の を 使 用 し た ．

2－ 1－ 2 標 準 品

標 準 品 の フ マ ギ リ ン は Wako Pure Chemical Industries Ltd か ら 購 入 し た ．

2－ 1－ 3 標 準 原 液 標 準 品 を 10.5 mg (純 度 補 正 ) 秤 量 し た ． メ タ ノ ー ル に 溶 解 後 ， 100 mL に 定 容 し ， 標 準 原 液 (100 g/mL) と し た ． 調 製 し た 標 準 原 液 を ， 遮 光 瓶 中 で 暗 所 に 4℃ で 保 存 し た ． 本 標 準 原 液 は ， 調 整 後 少 な く と も ， 1 年 間 安 定 で あ っ た ． 2－ 1－ 4 標 準 溶 液 標 準 溶 液 は 使 用 す る 直 前 に 調 製 し た ． 標 準 原 液 を 0.1% ギ 酸 含 有 ア セ ト ニ ト リ ル で 段 階 希 釈 し ， 添 加 用 に 0.01, 1 お よ び 10 g/mL の 3 濃 度 ， さ ら に ， 検 量 線 用 に 0.005 か ら 5， 0.1 か ら 10 お よ び 1.0 か ら 100 ng/mL の 間 の 7 段 階 の 濃 度 の 標 準 溶 液 を 調 製 し た ． 2－ 1－ 5 試 薬 (a) 超 純 水 ，ア セ ト ニ ト リ ル ，メ タ ノ ー ル お よ び ギ 酸 は ，1－ 1－ 5 と 同 様 の も の を 用 い た ．

(b) ギ 酸 ア ン モ ニ ウ ム 水 溶 液 (1 mol/L; LC grade) は ，Wako Pure Chemical Industries Ltd の も の を 用 い た ．

Figure 21 Sample preparation procedure for analysis of fumagillin in honey. Sample (honey) 5.0 g

add water 10 mL mix on a vortex (1 min)

add acetonitrile containing 0.1% formic acid 20 mL mix on a vortex (1 min)

add inorganic reagents for fumagillin: sodium chloride 1.0 g, trisodium citrate dihydrate 1.5 g magnesium sulfate 4.0 g

shake (10 min) using a mechanical shaker

centrifuge (1840 x g, 5 min, 4o_C)

The acetonitrile layer

dilute to 20 mL with acetonitrile containing 0.1% formic acid

The Extraction solution 1 mL

WAX column

pass through

elute from WAX column with acetonitrile containing 0.1% formic acid 1 mL

Both eluates

collect into a volumetric test tube

dilute to 2 mL with acetonitrile containing 0.1% formic acid

The examination solution in an amber glass vial

2－ 1－ 7 LC/MS/MS を 用 い た 測 定 条 件

(a) LC 条 件： 分 離 は ，LC-20A シ リ ー ズ (Shimadzu Corp.) 装 置 を 用 い て 行 っ た ．分 析 カ ラ ム は Sunniest C8 (100×2.0 mm id, 5 m pd) (ChromaNik Technologies Inc., Osaka, Japan) を 接 続 し た ．移 動 相 に は ，(A) 0.01% ギ 酸 含 有 2 mM ギ 酸 ア ン モ ニ ウ ム 水 溶 液 と (B) メ タ ノ ー ル を グ ラ ジ エ ン ト (10% B (0 min), 10-90% B (10 min), 90% B (10min), 90-10% B (0.1 min), お よ び 10% B (5min)) で 用 い た ．流 速 は 0.2 mL/min， カ ラ ム 温 度 は 40℃ ， 注 入 量 は 10 L と し た ．

(b) MS/MS 条 件：MS 検 出 器 は ，API 5500 Qtrap mass spectrometer (AB Sciex, Framingham, MA, USA) を 使 用 し た ． MS/MS の イ オ ン 化 は ， エ レ ク ト ロ ス プ レ イ モ ー ド (ネ ガ テ ィ ブ ) で 行 い ， イ オ ン ス プ レ ー 電 圧 は -4.5 kV， イ オ ン 源 の 温 度 は 600o

2－ 2 結 果 お よ び 考 察

2－ 2－ 1 薬 物 の 抽 出 と 精 製 法

近 年 ，残 留 農 薬 (Anastassiades et al.，2003，Lehotay，2007，2011，Mullin et al.，2010， Schenck et al.，2008，Wang et al.，2010) お よ び 動 物 用 医 薬 品 (Aguilera-Luiz et al.，2008， Frenich et al.，2010，Nakajima et al.，2012) の 抽 出 お よ び 精 製 に QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe) 法 が 広 く 取 り 入 れ ら れ て い る ． QuEChERS 法 は ， 水 お よ び 有 機 溶 媒 を 用 い て 食 品 中 か ら 薬 物 を 抽 出 し ， 硫 酸 マ グ ネ シ ウ ム に よ る 脱 水 お よ び 塩 化 ナ ト リ ウ ム に よ る 塩 析 効 果 を 利 用 し ， 目 的 薬 物 を 含 む 有 機 溶 媒 層 と 夾 雑 物 を 含 む 水 層 に 液 液 分 配 す る (Figure 22)．さ ら に 必 要 に 応 じ て 固 相 抽 出 カ ラ ム を 用 い て 二 次 精 製 を す る ． こ の 方 法 は ， 短 時 間 で 前 処 理 を 行 え ， か つ 使 用 溶 媒 量 が 少 量 で あ る と い う 利 点 が あ り ， こ れ ら を 生 か し て ， フ マ ギ リ ン の 分 析 を 行 う こ と と し た ．

Figure 22 Schematic representation of general extraction and clean-up procedure by QuEChERS method.

Sample+Water + Organic solvent

mix

+ Inorganic reagents (NaCl + MgSO4+ Buffer)

shake+centrifuge ①Extraction ②Clean-up with liquid-liquid partitioning ③Clean-up with solid-phase extraction (SPE) Organic solvent (target compounds + hydrophobic matrix)

water (hydrophilic matrix)

Hydrophilic matrix Hydrophobic matrix Target compounds

フ マ ギ リ ン の 抽 出 条 件 に つ い て は ， 次 の 2 点 に つ い て 検 討 し た ． QuEChERS 法 の 一 次 精 製 で 高 い 効 果 を 得 る に は ， 蜂 蜜 の 水 分 含 量 は 20% と 低 い た め ， 試 料 へ の 水 の 添 加 が 必 要 と な る ． 加 え て ， ア セ ト ニ ト リ ル の 蜂 蜜 へ の 直 接 の 添 加 は ， 蜂 蜜 を 固 化 さ せ ， そ れ ら の 混 和 に 障 害 が 生 じ る こ と も あ る の で ， 本 法 で の 試 料 へ の 水 の 添 加 は 必 須 と な る ． そ こ で ， 抽 出 の 初 段 階 で 試 料 に 加 え る 水 の 量 を 検 討 し た ． 蜂 蜜 5.0 g に 対 し ，超 純 水 を 2.5，5，10，15 お よ び 20 mL と 添 加 し た ．そ の 結 果 ，Figure 23 に 示 す よ う に ，10 mL の 超 純 水 を 添 加 し た 場 合 ，フ マ ギ リ ン の 回 収 率 が 最 も 高 値 の 約 70% と な り ， SEM も 収 束 し た 値 に な っ た ． そ こ で ， 蜂 蜜 に 加 え る 超 純 水 の 量 を 10 mL と し た ．

Figure 23 Effect of the amount of water added to honey on the recoveries of fumagillin. Each value is the mean±SEM of five replications.

0 20 40 60 80 100 2.5 5 10 15 20

次 に ，有 機 溶 媒 に 添 加 す る ギ 酸 の 濃 度 に つ い て 検 討 し た 結 果 を Figure 24 に 示 す ．ア セ ト ニ ト リ ル を 用 い た 時 ， フ マ ギ リ ン の 回 収 率 は 70% 以 下 で あ っ た ． フ マ ギ リ ン は 酸 性 物 質 の た め ， ア セ ト ニ ト リ ル に 0.1， 0.2， 0.5 お よ び 1% (v/v) の ギ 酸 を 加 え て ， 試 料 溶 液 中 の フ マ ギ リ ン の カ ル ボ キ シ ル 基 の 解 離 を 抑 制 し ， 水 層 か ら ア セ ト ニ ト リ ル の 有 機 溶 媒 層 へ 移 行 さ せ る よ う に 試 み た ． そ の 結 果 ， い ず れ の ギ 酸 の 濃 度 で も 回 収 率 は 90% 以 上 に な っ た ． 他 方 ， 測 定 す る 溶 液 中 の ギ 酸 濃 度 が 高 く な る と ， LC/MS/MS 法 で は フ マ ギ リ ン の 分 離 能 が 低 下 し た ． そ こ で ， ギ 酸 添 加 量 を 最 少 と し ， 抽 出 に 用 い る 有 機 溶 媒 と し て 0.1% ギ 酸 含 有 ア セ ト ニ ト リ ル を 用 い る こ と に し た ．

Figure 24 Effect of the formic acid concentration to acetonitrile on the recoveries of fumagillin. Each value is the mean±SEM of five replications.

0 20 40 60 80 100 0 0.1 0.2 0.5 1