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A ctino bacillus
actinomycetemcomitans,
Porphyromonas
gingivalis,
Fusobacterium
nucleatum
に対 す る多形核 白血球 の活性酸素産生 と
食 ・殺 菌 系 にお よぼ す補 体, 抗 体 の影 響
荻 原 和 孝*加
藤千穂美
斎 藤 和 子
日本 歯科大学新 潟歯学部 口腔微 生物 学教室 ( 主任: 斎藤和子教授) ( 平成7年8月7日 受付)Influence
of Complement
and Antibody
on Superoxide
Production,
Actinobacillus
actinomycetemcomitans,
Porphyromonas
gingivalis
and Fusobacterium
nucleatum
Phagocytosis
and Killing
by Leukocytes
Kazutaka
Ogiwara*,
Chihomi Kato and Kazuko
Saito
Department of Oral Microbiology, School of Dentistry at Niigata, The Nippon Dental University
1-8 Hamaura-cho, Niigata 951, Japan
(
Director : Prof. Kazuko Saito)
*Present address : Department of Periodontology, The Nippon Dental University
2-3-16 Fujimi, Chiyoda-ku, Tokyo 102, Japan
The purpose of this experiment was to clarify the influence of antibody and complement on the super-oxide production [Chemiluminescence (CL) response] and periodontopathic bacteria phagocytosis and killing by polymorphonuclear leu-kocytes (PMNs) . PMNs were obtained from the peritoneal cavity of ICR mice after caseinate injec-tion. Three species of periodontopathic bacteria were used : Actinobacillus actinomycetemcomitans
(
Aa) , Porphyromonas gingivalis (Pg) and Fusobacte-rium nucleatum (Fn) . Mice were immunized with live Aa, Pg or Fn vaccine. Serum was obtained from the blood by cutting the carotid artery. Normal serum was used as complement and inactivated immune serum was used as the anti-body. The antibody titers were measured by ELISA using sonicated Aa, Pg and Fn antigen. Serum with a high antibody titer was obtained. IgG levels were high when mice were immunized with either Aa or Pg, whereas IgM levels were high when immunized with Fn. The reaction mixture for the CL response consisted of luminol solution,
serum, gelatin Hanks' solution, PMNs and the bacteria. After the CL response was complete, a portion of the reaction mixture was smeared on a glass slide, dried and stained with May-Gruenwald-Giemsa stain. Phagocytic activity was assessed using a microscope. Surviving bacteria were counted on solid medium after treatment with serum, antibody and PMNs alone or in combination.
An increase in the CL response to Aa occurred and was dependent on the addition of complement, and the response to Pg was dependent on both complement and antibody whereas the response to Fn dependent on neither complement nor antibody. The CL response to Fn was inhibited by D-galactose, N- acetyl-D-galactosamin and mannan. Phagocytic rate of PMN and the number of Aa and Fn bacteria in PMNs was enhanced in the presence of complement. The co-operation of both comple-ment and antibody was needed to increase the phagocytic ratio. The bactericidal effect of com-plement, antibody and PMN were examined in single or combination mixtures. There was no 本 論 文 の 要 旨 は, 第36回 歯 科 基 礎 医 学 会 (1994年10月17日) に お い て 発 表 し た 。
歯周 病 原 性細 菌 に対 す る補 体 ・抗 体 の 白血 球 機能 にお よ ぼす 影響 629
marked effect on killing the bacteria in any combi-nation.
In conclusion, complement plays the role of en-hancing the CL response and phagocytic activity in
response to Aa. Co-operation of complement was necesary for phagocytosis of Fn. High titer anti-body, complement and PMN had no bactericidal effect under the experimental conditions.
Key words : PMN, Antibody, Complement, CL response, Killing
要 旨: 本 実 験 は, 歯 周 病 原 性 細 菌 に 対 す る 多 形 核 白 血 球 (PMN) の 活 性 酸 素 産 生 [Chemiluninescence (
CL) 反 応] , 食 ・殺 菌 能 へ の補 体 ・抗 体 の影 響 を明 らか に す る こ とを 目 的 と した 。 PMNは カ ゼ イ ン刺 激 マ ウ ス 腹 腔 内 か ら採 取 し た。 ま た, 歯 周 病 原 性 細 菌 と し てActinobacillzas actinomycetemcomitans; Aa, Porphyro-monas gingivalis; Pg, Fusobacterium nucleatum; Fnを 使 用 した 。 マ ウ ス に生 菌 免 疫 を施 し, 超 音 波 破 砕 抗 原 に対 す る 抗 体 価 をELISA法 で 測 定 し た 。 IgGがAaとPg免 疫 マ ウ ス, IgMがFn免 疫 マ ウ ス で 高 か っ た。 CL反 応 は ル ミ ノー ル 依 存 性 のCL反 応 を測 定 し た。 食 菌 能 は各 反 応 液 をス ラ イ ドガ ラ ス に塗 抹 ・乾 燥 し, メ イ ・ グル ン ワル ド ・ギ ム ザ染 色 後, 顕 微 鏡 を使 用 して観 察 した 。 菌 の 生残 は, 血 清, 抗 体, PMN単 独 ま た は組 み合 わ せ て 反 応 させ, 平 板 培 地 上 で カ ウ ン トした 。CL反 応 の 増 加 は, Aaが 補 体, Pgで 補 体 ・抗 体 の 両 方 に依 存 し たが, Fnは 補 体, 抗 体 の どち ら に も反 応 性 を示 さ な か っ た 。 ま たFnはD-ガ ラ ク トー ス, N-ア セ チ ル ーD-ガ ラ ク トサ ミン, マ ンナ ン に よ っ て抑 制 され た 。 食 菌 能 はAaとFnが 補 体, Pgが 補 体 ・抗 体 の両 方 の 存 在 で増 加 し た。 しか し, 補 体, 抗 体, PMN単 独 また は組 み合 わ せ に よ る殺 菌 効 果 は得 られ な か っ た 。 結 論 と して, 補 体 はAaのCL反 応 と食 菌 能 の 増 加 に, 補 体 と抗 体 の 両 方 がPgのCL反 応 と食 菌 能 に関 与 し た 。 また, FnはCL反 応 で レセ プ タ ー の 相 互 作 用 が 関 係 した が, 食 菌 能 に は補 体 を必 要 と した 。 し か し, 補 体, 抗 体 は殺 菌 効 果 を示 さ な か っ た 。 索 引 用 語: PMN, 抗 体, 補 体, CL反 応, 殺 菌 能 緒 言 歯 周 炎 患 者 の 患 部 歯 肉溝 内 に は, 炎 症 性 変 化 の結 果 と して 主 に 多 形 核 白 血 球 (PMN) の滲 出 が 認 め られ る1) 。PMNは 微 生 物 に対 す る遊 走 能 や 食 菌 能 を有 し て い る。 さ ら にPMNの 食 作 用 に 伴 いrespiratory burstが 起 こ り, NADPHオ キ シ ダ ー ゼ 系 の 作 用 に よ り産 生 さ れ る活 性 酸 素 種 は酸 素 依 存 性 殺 菌 機構 に 関 与2) す る。 ま た, ア ズ ー ル顆 粒 や 特 殊顆 粒 内 の 殺 菌 性 物 質 に よ る酸 素 非 依 存 性 殺 菌 機 構 も有 して い る。 一 方, 歯 周 炎 患 者 血 清 や 患 部 歯 肉 溝 滲 出 液 ( GCF) 中, す な わ ち全 身 的 ・局 所 的 に歯 周 病 原 性 細 菌 に対 す る特 異IgG抗 体 価 の上 昇3∼5) やC3, C 5の 活 性 化6) が 認 め られ て い る。 さ らに 歯 肉 縁 下 プ ラ ー ク細 菌 で 認 め ら れ たIgGやC3に よ る コー テ ィ ン グ7) は, 一 部 の 白血 球 機 能 低 下 患 者8∼11) を 除 い て, PMNと の 相 互 作 用 に よ り効 率 よ く殺 菌 され る と考 え られ る。 し か し実 際 に は, 治 療 を施 さず 生 体 側 の 防御 機 構 の み に 頼 れ ば, 歯 周 炎 が 増 悪 す る傾 向 に あ る こ と も周 知 の事 実 で あ る。 そ こで本 実 験 で は, マ ウス に歯 周 病 原性 細 菌 で あ る Actinobacillus actinomycetemcomitans; Aa, Por-phyromonas gingivalis; Pg, Fusobacteriumz nuclea-tunn; Fnの 生 菌 免 疫 を施 し, 特 異 的 に十 分 上 昇 さ せ た 抗 体 価 を 有 す る マ ウ ス 血 清 を 用 い, PMNと 補 体, 抗 体 と の 相 互 作 用 に よ る 食 ・殺 菌 系 を 知 る 目 的 で, ル ミ ノ ー ル 依 存 性 ケ ミ ル ミ ネ ッ セ ン ス 反 応 (CL反 応) に よ る 活 性 酸 素 産 生 能, 塗 抹 染 色 標 本 の 観 察 に よ る 食 菌 能, コ ロ ニ ー 形 成 の 測 定 に よ る 殺 菌 能 を検 討 し た 。 材 料 お よ び 方 法 1.使 用 菌 株 と培 養 方 法 A a Y4株, Pg 381株, Fn ATCC 25586株 の3菌 種 を 用 い た 。Aaは, Brain Heart Infusion (BHI) 培 地 (Difco., MI, U. S .A.) を 用 い, 炭 酸 ガ ス 培 養 器 (CO2濃 度5%, Air 95%; ト キ ワ, 東 京) 中 で 37℃, 16時 間 培 養 を 行 っ た 。
Pgは, 1% Hemin (Shigma. Co., MD, U. S. A.) , 0.02% menadione (半 井 化 学, 京 都) , 5% yeast
( Difco.) 含 有BHI培 地 を 用 い, AnaeroPackケ ン キ (R) (三菱 ガ ス 化 学, 東 京) を 利 用 し たi嫌気 条 件 下 で 37℃, 16時 間 培 養 し た 。 Fnは, GAMブ イ ヨ ン (ニ ッ ス イ, 東 京) を 用 い, AnaeroPack・ ケ ン キ (R) を 利 用 し た 嫌 気 条 件 下 で37℃, 33時 間 培 養 し た 。 培 養 後 の 各 菌 は10, 000×9, 10分 間 遠 心 し て 集 菌 し, phosphate buffered saline (PBS) に て 洗 浄 し た 。 さ ら に0.1% gelatin (Difco.) 含
有Hanks'bal-630 日歯 周 誌37 (4) : 628∼640, 1995
anced salt solusion (GHBSS) 中 に 浮 遊 さ せ た 後, 分 光 光 度 計Spectronic 20型 (島 津 製 作 所, 京 都) を 用 い, 540nmの 波 長 でoptical density (O.D.) が 0.3の 菌 懸 濁 液 を 調 製 し た 。
2.使 用 動 物 お よ び 免 疫 方 法
SPF (specific pathogen free) ICRマ ウ ス (日 本 エ ス エ ル シ ー, 静 岡) 7週 齢 の 雄 を 用 い た 。 免 疫 方 法 は, 菌 懸 濁 液 (湿 重 量100mg細 菌/ml) を 抗 原 と し, マ ウ ス ー 匹 当 た り0.1mlの 抗 原 を 腹 腔 内 ・腹 腔 内 ・皮 下 の 順 で1週 間 毎 に3回 投 与 し た 。 最 終 免 疫 終 了 後14日 経 た も の を 免 疫 マ ウ ス と し た 。 3.血 清 の 調 製 法 無 処 理 マ ウ ス 血 清 (正 常 血 清) お よ び 免 疫 マ ウ ス 血 清 (免 疫 血 清) は, 頸 動 脈 切 断 の 際 に 得 た 血 液 か ら 採 取 し た 。 血 清 の 非 働 化 処 理 は, 56℃ の ウ ォ ー タ ー バ ス 中 で 30分 間 静 置 さ せ て 行 い, 直 ち に 使 用 し た 。 4.血 清 抗 体 価 の 測 定 1) 超 音 波 破 砕 抗 原 の 調 製 生 理 食 塩 液 (0.85%NaCl液) に 懸 濁 さ せ た 各 菌 体 は, 超 音 波 発 生 装 置Model UR-200P (ト ミー 精 工, 東 京) を 用 い, 氷 冷 下 に お い て120W, 5分 間 隔 で 30分 以 上 破 砕 し た 。 さ ら に12, 000×g, 10分 間 遠 心 後, そ の 上 清 を 凍 結 乾 燥 し た 。Lowry法12) に て, 蛋 白 質 量 が50μg/mlに な る よ う0.IM炭 酸buffer ( 0.02%NaN3含 有; pH9.6) で 調 製 し た も の を 各 超 音 波 破 砕 抗 原 液 と し た 。 2) 抗 体 価 の 測 定 正 常 血 清 お よ び 免 疫 血 清 のIgMとIgG抗 体 価 は, Dotyら13) の 方 法 に 準 じ, enzyme-linkedimmunosor-bentassay (ELISA) の 変 法 に よ り測 定 し た 。 超 音 波 破 砕 抗 原 液 を コ ー テ ィ ン グ (370C, 2.5時 間) し た96穴 マ イ ク ロ プ レ ー ト (Coster. Co., MA, U. S. A.) に 対 し, 2%ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン ( BSA) 含 有PBSを 加 え イ ン キ ュ ベ ー ト (4℃, 一 晩) し た。BSA含 有PBS除 去 後, 0.05% Tween20, 0.02%NaN, 含 有PBS (PBS-T) に て 洗 浄 し, PBS-Tで 段 階 希 釈 (25×2n) し た 正 常 血 清 ま た は 免 疫 血 清 を 加 え イ ン キ ュ ベ ー ト (37。C, 2.5時 間) し た 。 さ ら にPBS-Tに て 洗 浄 後, 2次 抗 体 と し て PBS-T1, 000倍 希 釈 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ 標 議 抗 マ ウ ス 免 疫 グ ロ ブ リ ン-ウ サ ギ 血 清 (ZYMED, MA, U. S. A.) を 加 え イ ン キ ュ ベ ー ト (37℃, 2 .5時 間) し た 。 最 後 にPBS-Tに て 洗 浄 後, 1mg/mlの p-nitrophenylphosphate含 有0.05M炭 酸bufferを 加 え イ ン キ ュ ベ ー ト (室 温, 20分 間) し, 1N NaOHを 加 え て 反 応 を 停 止 し た 。 吸 光 度 の 測 定 は, 反 応 停 止 後 直 ち に マ イ ク ロ フ ォ ト メ ー タ ーMTP-22 (コ ロ ナ, 茨 城) に お け る 一 波 長 ( 405nm) で 行 い, 終 末 点 が0.D.0.2と な る 血 清 希 釈 倍 数 を と っ て 抗 体 価 と し た 。 5.PMN浮 遊 液 め 調 製 前 述 マ ウ ス 腹 腔 内 に0.2%カ ゼ イ ン液 (和 光 純 薬, 大 阪) を2ml注 入 し た 。4時 間 後 にheparin (半 井 化 学, 京 都) 5U/ml含 有Hanks'balancedsalt solusionを 腹 腔 内 に 注 入 し て 吸 引 回 収 し た 。 つ い で 5℃, 400×gで5分 間 遠 心 し た 後, PBSに て3回 洗 浄 を 行 っ た 。 さ ら にGHBSSに てPMN数1×107 個/mlに 調 製 し た 。
0.4%Trypan Blue (Shigma.Co.) を 用 い た TrypanBlueExclusion法 で 計 測 し, PMNは 全 細 胞 中 の93%以 上 を 占 め, そ の 時 の 細 胞 生 存 率 は95%以 上 で あ っ た 。2時 間 後 の 細 胞 生 存 率 は, 炭 酸 ガ ス 培 養 器 (37℃, 5% CO2, 95% Air; 好 気 条 件 下) で 90%, AnaeroPack・ ケ ン キ (R) を 利 用 し た 嫌 気 条 件 下 で は85%で あ っ た 。 6.CL反 応 の 測 定 方 法 活 性 酸 素 は ル ミ ノ ー ル 依 存 性 のCL反 応 で 測 定 し た 。 PMN浮 遊 液0.2ml (2×106個) , 菌 懸 濁 液 (0.D. 0.3) 0.1ml, luminolsolution (フ タ バ メ デ ィ カ ル, 東 京) 3倍 希 釈 液0.1ml, 各 血 清 ま た はGHBSS ( 対 照) 0.05ml, 全 量 をGHBSSに て0.65mlと し た 反 応 液 を キ ュ ベ ッ ト (フ タ バ メ デ ィ カ ル) 中 で 倒 立 混 和 し た 。 直 ち にLumiphotometer TD4000 (フ タ バ メ デ ィ カ ル) に セ ッ ト し, 37℃, 1分 間 隔 で 反 応 を 自 動 的 に 記 録 し た 。 血 清 無 添 加 時 に お け る 反 応30分 間 の 値 を 積 算 し たCL積 分 値 を 基 に 各 血 清 添 加 の 影 響 を 検 討 し た 。 ま た, FnとPMNの 接 着 に 関 与 す る レ ク チ ン ・レ セ プ タ ー の 解 析 を 糖 添 加 に よ るCL反 応 の 阻 害 試 験 か ら 検 討 し た 。 マ ン ノ ー ス (mannose) , マ ン ナ ン (mannan) , D-ガ ラ ク トー ス (Ga1) , D-ガ ラ ク ト サ ミ ン ( GalN) , N-ア セ チ ル-D-ガ ラ ク ト サ ミ ン (Ga1-NAc) 1mg/mlを0.1mlとPMN浮 遊 液 (2×106 個) を 混 合, 氷 冷 下 で30分 間 前 処 理 し てCL反 応 を 行 っ た 。 糖 無 添 加 の 無 処 理PMNのCL反 応 積 分 値 を 基 に, 糖 添 加 群 のCL反 応 積 分 値 の 阻 害 率 を 求 め た 。 阻 害 率= (糖 無 添 加 時 のCL積 分 値 一 糖 添 加 時 の CL積 分 値/糖 無 添 加 時 のCL積 分 値) ×100 7.食 菌 能 の 測 定 PMN浮 遊 液0.2ml (2×106個) , 菌 懸 濁 液 (O.D.
歯周 病 原 性 細菌 に対 す る補 体 ・抗 体 の 白血 球 機 能 に お よぼ す影 響 631 表1免 疫 血 清 お よび正 常血 清 の血清抗 体価 各 菌 の超 音 波 破 砕 抗 原 に対 す る血 清 の特 異 抗 体 価 を ELISA法 によっ て測 定 した。 0.3) 0.1ml, 各 血 清 また はGHBSS (対 照) 0.05ml, 全 量 をGHBSSに て1mlと した 反 応 液 を好 気 条 件 下 お よび 嫌 気 条 件 下 で 培 養 した。 30分 (好 気 条 件 下 の み) , 60分, 120分 後 に塗 抹 標 本 を作 製 し, May-Gruenwald-Giemsa染 色 を施 した 後, 顕 微 鏡 下1, 000倍 で観 察 を行 っ た。 PMN100個 当 た り食 菌 し て い るPMNの 割 合 か ら 食 菌 率 を, 同PMN中 の 菌 数 か ら食 菌 数 を そ れ ぞ れ 求 めた 。 8.殺 菌 能 の 測 定 1) 免 疫 血 清 に お け る殺 菌 効 果 反 応 液 組 成 は菌 懸 濁 液 (O.D.0.3) 0.1ml, 各 血 清 ま た はGHBSS (対 照) 0.5ml, 全 量 をGHBSSに て1 mlと し た 。 混 和 後 直 ち に 各 増 菌 培 養 条 件 下 に 移 し た。 反 応 開 始 直 後, 60分, 120分 後 に反 応 液 を 前 述 の増 菌 培 地 で 連 続10倍 希 釈 し, spot法 に て各 平 板 に滴 下 後, 前 述 培 養 条 件 下 で 培 養 した 。 得 られ た コ ロニ ー数 か らcolonyformingunit (CFU) を求 め, 反 応 開始 直 後 のCFUを100%と した 時 の60分, 120分 後 の 生 残 率 を基 に検 討 した 。 反 応 開始 直 後 の菌 懸 濁 液 (O.D.0.3/ml) 中 の生 菌 数 は, Aaが1.5%寒 天 (Difco.) 含 有BHI寒 天 平 板 培 地 上 で2×109個 (好 気 条 件, 37℃, 2日 間 培 養) , PgがAnaeroコ ロ ン ビア 寒 天 平 板 培 地 (BBL.Co., MD, U. S. A.) 上 で5×108個 (嫌 気 条 件, 37℃, 4日 間 培 養) , FnがGAM寒 天 平 板 培 地 (ニ ツス イ) で 2×108個 (i嫌 気 条 件, 37℃, 4日 間培 養) で あ っ た 。 2) PMN殺 菌 能 へ の 血 清 添 加 に よ る効 果 食 菌 能 測 定 時 と同 様 の組 成 で あ る反 応 液 を混 和 後 直 ち に好 気 条 件 下 お よ び嫌 気 条 件 下 に移 した 。 続 い て血 清 に お け る殺 菌効 果 と同様 に希 釈 ・滴 下 し, CFUを 基 に生 残 率 を求 めた 。 PMN中 に食 菌 さた 細 菌 を分 散 す る 目 的 で, 各 希 釈 系 列 の最 初 の 希 釈 の み滅 菌 蒸 留 水 を使 用 した 。 9.統 計 学 的 解 析 そ れ ぞ れ の実 験 は繰 り返 し3回 行 い, そ の平 均 値 ± 図1Aa, Pg, Fn刺 激 に対 す るPMNの CL反 応 (血 清 無 添 加) 標 準 偏 差 か ら検 討 し た。 統 計 処 理 と して, 対 応 の な いt検 定 を行 った 。 結 果 1.Aa, Pg, Fn超 音 波 破 砕 抗 原 に 対 す る血 清 抗 体 価 Aa, Pg, Fnの 超 音 波 破 砕 抗 原 に対 す るIgMお よ びIgG抗 体 価 は, 正 常 血 清 が25×24以 下 で あ っ た の に 対 し, 免 疫 血 清 で は と も に 上 昇 が 認 め られ た (表 1) 。 特 に, AaとPg免 疫 血 清 のIgG抗 体 価 は, 正 常 血 清 と比 較 し て210倍 以 上 の 高 度 な上 昇 が 認 め られ た 。 また, Fnで も中 等 度 の 上 昇 を認 め た 。 2.Aa, Pg, Fn刺 激 に対 す るPMNのC正 反 応 1) 血 清 無 添 加 時 のCL反 応 血 清 無 添 加 時 のCL反 応 はFn刺 激 で 最 も高 く, つ い でPg刺 激, Aa刺 激 の 順 で あ っ た (図1) 。 さ らに 反 応30分 間 のCL積 分 値 は, Fn刺 激 が651.61± 121.32, Pg刺 激 で149.30±40.75, Aa刺 激 は 53.70±11.55で あ った 。 この 値 を 基 (=1) に して 血 清 添 加 に よ る影 響 を検 討 した 。
632 日 歯 周 誌37 (4) : 628∼640, 1995 図2PMNのCL反 応 に対 す る正 常血 清 お よび免 疫血 清 の添 加効 果 と非 働化 に よる影響 正 常血 清 の添加 効 果 と非働 化 に よる影響 を (a) に, 免 疫血 清 の添 加効 果 と非 働化 に よる影響 (b) を示 す。 ※印; 血 清無添 加 時のCL反 応 との比較 で統 計学 的有 意差 を認 めた 。 2) PMNのCL反 応 へ の血 清 添 加 の 効 果 正 常 血 清 の添 加 に よ って, Aa刺 激 で は血 清 無 添 加 の3.4倍 の 有 意 に 高 いCL積 分 値 の 増 加 を 認 め た ( P<0.01) が, Pg刺 激 お よ びFn刺 激 で は血 清 無 添 加 と同 程 度 で あ った (図2-a) 。 免 疫 血 清 の 添 加 で は, Aa刺 激 が3.4倍, Pg刺 激 で2.1倍 の 有 意 に 高 いCL積 分 値 の 増 加 (p<0.01) を示 した (図2-b) 。 しか し, Fn刺 激 で は血 清 無 添 加 と同程 度 のCL積 分 値 で あ っ た。 また, 非 働 化 正 常 血 清 お よ び非 働 化 免 疫 血 清 の添 加 で は, 各 菌 刺 激 と も血 清 無 添 加 と同 程 度 のCL積 分 値 で あ っ た 。 3) CL反 応 へ の 正 常 血 清 と非 働 化 免 疫 血 清 の 相 互 作 用 の検 討 正 常 血 清 と非 働 化 免 疫 血 清 の 等 量 添 加, す なわ ち補 体 と抗 体 の相 互 作 用 を正 常 血 清 単 独 添 加 と比 較 し て検 討 した (図3) 。 Aa刺 激 で は, 正 常 血 清 と非 働 化 免 疫 血 清 の 等 量 添 加 に よ り血 清 無 添加 の4.8倍 のCL積 分 値 を示 した 。 しか し, 正 常 血 清 単 独 添 加 で も3.4倍 の増 加 を示 し, 両 者 間 で 統 計 学 的有 意 差 を認 め な か った 。 Pg刺 激 で は, 正 常 血 清 と非 働 化 免 疫 血 清 の 等 量 添 加 に よ り血 清 無 添 加 の4.0倍 のCL積 分 値 を示 し, 正 常 血 清 単 独 添 加 (1.3倍) と比 較 し て も統 計 学 的 有 意 差 が 認 め られ た (p<0.01) 。 Fn刺 激 で は, 正 常 血 清 と非 働 化 免 疫 血 清 を 等 量 添 加 して も血 清 無 添 加 や 正 常 血 清 単 独 添 加 と 同 程 度 で あ った 。 3.FnのC正 反 応 系 誘 導 因 子 の 検 討 Fn刺 激 に お い て, 血 清 添 加 に よ るCL反 応 の 増 加 を認 め な い こ とや, 血 清 無 添 加 時 にAa刺 激 やPg刺 激 に比 べ 高 いCL反 応 を 示 した こ と か ら, CL反 応 系 誘 導 因 子 と し て 菌 体 とPMNの 接 着 因 子 を 糖 添 加 に よ るCL反 応 阻 害 試 験 か ら検 討 した (図4) 。 糖 に よ るCL反 応 の 阻 害 率 は, Ga1 (92.5%) と GalNAc (80.9%) で 高 く, つ い でmannan ( 56.7%) , GalN (46.0%) , mannose (34 .4%) の 順 で あ っ た 。 4.PMNの 食 菌 能 (食 菌 率, 食 菌 数) に お よぼ す 血 清 の影 響 1) Aa, Pg, Fnに 対 す る 好 気 条 件 下 で のPMN の食 菌 率 (表2) 血 清 無 添 加 時 の30分 後 の 食 菌 率 は, Aa26 .3%, Pg19.7%, Fn16.3%で あ り, 時 間 と と もに 増 加 す
歯周病原性細菌 に対する補体 ・抗体の白血球機能 におよぼす影響 633 図3正 常血 清 と非 働化 免疫 血 清 のCL反 応 に 対 す る相互作 用 の検討 る傾 向 が 特 にAaで 認 め られ た 。 Aaは 正 常 血 清 や 免 疫 血 清 の 添 加 で, Pgが 免 疫 血 清 の 添 加 に よっ て30分 後 で す で に血 清 無 添 加 の2倍 の 増 加 を 示 し た (p<0.01) が, 以 後 の 増 加 は 少 な か った 。Fnで はTF常 面 清 や 免 疫 血 清 の 添 加 に よ り. 60分 以 降 で 血 清 無 添 加 の2倍 の 増 加 を示 し た (p< 0.01) 。 しか し, 3菌 種 と も非 働 化 正 常 血 清 や 非働 化 免 疫 血 清 の添 加 で は血 清 無 添 加 と同 程 度 の食 菌 率 で あ っ た 。 また, 正 常 血 清 と非 働 化 免 疫 血 清 の 等 量 添 加 で は, 3菌 種 と も正 常 血 清 や 免 疫 血 清 の添 加 と同 程 度 の増 加 を示 した 。 2) Aa, Pg, Fnに 対 す る 好 気 条 件 下 で のPMN の 食 菌 率 (表3) 血 清 無 添 加 時 の 食 菌 率 は, 30分 後 でAa54個, Pg 40個, Fn19個 で あ っ た 。 さ ら に3菌 種 と も 時 間 と と もに増 加 す る傾 向 を示 した 。 血 清 無 添 加 と比 較 して, Aaは 正 常 血 清 や 免 疫 血 清 の 添 加 に よ っ て30分 後 で5倍 近 くの 有 意 に 多 い 増 加 ( 正 常 血 清; P<0.01, 免 疫 血 清; P<0.05) を 示 し 図4Fn刺 激 に対 す るCL反 応 にお よぼ す 各 種糖 の影 響 た 。Pgで は免 疫 血 清 の 添 加 に よ り30分 後 で2倍 の有 意 に 多 い増 加 が 認 め られ た (p<0.Ol) 。 ま た, Fnで は正 常 血 清 や 免 疫 血 清 の添 加 に よ り2倍 の 有 意 に 多 い 増 加 (P<0.01) が60分 以 降 に 認 め られ た。 さ ら に 時 間 と と も に増 加 す る傾 向 を示 した 。 しか し, 3菌 種 と も非働 化 正 常 血 清 や 非 働 化 免 疫 血 清 の添 加 で は血 清 無 添 加 と同 程 度 の食 菌 率 で あ っ た 。 正 常 血 清 と非 働 化 免 疫 血 清 の等 量 添 加 で は, 3菌 種 と も免 疫 血 清 の添 加 と同 程 度 の増 加 を示 した。 3) Pg, Fnに 対 す る嫌 気 条 件 下 で のPMNの 食 菌 率, 食 菌 数 (表4) Pgお よ びFnに 対 す る 嫌 気 条 件 下 で のPMNの 食 菌 数 は, 特 にFnで の 食 菌 数 の減 少 を認 め た が, 血 清 添 加 に よ り好 気 条 件 下 と同様 の 傾 向 を示 した 。 5.殺 菌 能 に お よぼ す血 清 添 加 の 影 響 1) 血 清 に よ る殺 菌 効 果 (表5) AaとPgに お け る 血 清 無 添 加 時 の 生 残 率 は, 120分 後 で もほ ぼ 反 応 開 始 時 の 生 残 率 を保 って い た が, Fnは60分 毎 に生 残 菌 の 減 少 を認 め た 。
634 日歯 周 誌37 (4) : 628∼640, 1995 表2Aa, Pg, Fnに 対 す るPMNの 食菌 率へ の血清 添加 に よる影 響 (好 気条 件下) 正 常 血 清 や 免 疫 血 清 の 添 加 に よ る血 清 無 添 加 以 上 の 生 残 率 の減 少 は, 120分 後 に お い て も示 さ なか っ た 。 また, Fnで は血 清 添 加 に お け る120分 後 に お い て, 血 清 無 添 加 時 の5倍 前 後 の 生 残 菌 が 認 め られ た (p< 0.05) 。 2) PMN殺 菌 能 に お け る血 清 添 加 の 影 響 ( 1) PMN単 独 殺 菌 効 果 (表6) 血 清 無 添 加 で はPMNの 有 無 に 関 わ らず, 3菌 種 と も生 残 率 の減 少 を認 め な か っ た 。 ( 2) 好 気 条 件 下 で のPMN殺 菌 能 へ の 血 清 添 加 の 効 果 (表7) 正 常 血 清 の 添 加 で は, 3菌 種 と もPMN単 独 殺 菌 効 果 以 上 の 生 残 率 の減 少 は認 め られ な か っ た。 免 疫 血 清 の 添 加 に よ り, Pgで は60分 後 に19.3%の 生 残 率 の 減 少 を示 し, PMN単 独 殺 菌 効 果 に比 べ 統 計 学 的 に 有 意 差 を認 め た (P<0.05) 。 し か し, AaとFnで は PMN単 独 殺 菌 効 果 以 上 の 生 残 率 の 減 少 を示 さ な か っ た 。 また, Fnは 血 清 の 添 加 に よ り120分 後 でPMN単 独 殺 菌効 果 の1.5倍 の 生 残 菌 を示 し, 統 計 学 的 に有 意 差 が認 め られ た (p<0.01) 。 非 働 化 正 常 血 清 や 非 働 化 免 疫 血 清 の 添 加 で は, 3菌 種 と もPMN単 独 殺 菌 効 果 と 同 程 度 の 生 残 率 で あ っ た。 正 常 血清 と非 働 化 免 疫 血 清 の 等 量 添 加 で は, Pgが 60分 後 に22.7%の 生 残 率 の 減 少 を 示 し, PMN単 独 殺 菌 効 果 に 比 べ 統 計 学 的 に 有 意 差 が 認 め ら れ た ( P<0.05) 。 しか し, AaとFnで は生 残 率 の減 少 を 示 さ なか っ た 。Fnは 正 常 血 清 や 免 疫 血 清 の添 加 と同 様, 120分 後 でPMN単 独 殺 菌 効 果 の1.4倍 の 生 残 菌 を 示 し, 統 計 学 的 に有 意 差 が認 め られ た (p<0.01) 。 ( 3) 嫌 気 条 件 下 で のPMN殺 菌 能 へ の 血 清 添 加 の 効 果 (表8) 嫌 気 条 件 下 で は血 清 の 有 無 に 関 わ らず, PgとFn で生 残 率 の 減 少 を認 め なか っ た 。 考 察 歯 周 炎 患 者 の 患 部 歯 肉 溝 中 に滲 出PMN, 活 性 化 補 体, 高 い抗 体 価 が 存 在 して い る に もか か わ らず 病 勢 は 進 行 す る。 この状 況 を 明 らか にす る た め, マ ウ ス実 験 系 にお け る歯 周 病 原 性 細 菌 (Aa, Pg, Fn) に対 す る 生 菌 免 疫 に よ る抗 体, 補 体, PMNの 作 用 を 検 討 し た 。
歯周 病 原性 細 菌 に対 す る補 体 ・抗 体 の 白血 球 機能 にお よ ぼす 影 響 635 表3Aa, Pg, Fnに 対 す るPMNの 食 菌数 への血 清添加 に よる影響 (好 気 条件 下) 表4Pg, Fnに 対 す るPMNの 食 菌率, 食菌 数 へ の血 清添 加 に よる影 響 (嫌 気 条件 下) 細 菌 感 染 に お け る第 一 次 生 体 防 御 と して の 役 割 を持 っPMNは, ま ず 補 体 や 抗 体, マ ン ナ ン な ど の レ セ プ ター を介 す る食 菌 を行 う。 この 際, 細 胞 表 面 に お け るNADPHオ キ シーダ ー ゼ 系 の 作 用 で 産 生 さ れ る 02-, H2O2, OH, 'HOClな どが 酸 素 依 存 性 殺 菌 に関 与 す る。 さ ら に 細 胞 内 に存 在 す る特 殊顆 粒, ラ イ ソ
636 日歯 周 誌37 (4) : 628∼640, 1995
表5Aa, Pg, Fnに 対 す る正 常血 清 お よび免 疫血 清 の殺菌 効果 と 非働 化 に よる影 響
表6PMN殺 菌 に よるAa, Pg, Fnの 生残 率 に対 す る 影 響 (血 清 無添加)
Aa, Pg, Fnは 炭 酸 ガス培 養器 中 (5% CO2, 95% Air) で反 応 させ た。 ゾー ム の食 胞 へ の 融 合 に よ って 酸 素 非 依 存 性 殺 菌 が行 わ れ る。 また, 補 体 に よ る溶 菌 反 応 (非 特 異 反 応) や 抗 体 ま た は両 者 の協 同作 用 (特 異 反 応) は, 食 ・殺 菌 の 有 力 な 手 段 と して利 用 され る。 しか し, この よ う な強 力 な 生体 防 御 機 構 に対 して も エ ス ケ ー プ機 構 を駆 使 して生 き残 る もの が あ る。 まず, 歯 周 炎 患者 は生 菌 で感 作 を受 け る こ と を想 定 して マ ウ ス に生 菌 で 十 分 感 作 を行 っ た と こ ろ, Aaと Pgで は ヒ トの場 合 と同様 にIgGの 高 い反 応 を認 め, FnはIgGが 中 等度 に反 応 して 出 現 した 。 十 分 に上 昇 した抗 体 価 を有 す る血 清 の オ プ ソ ニ ン活 性 と, 活 性 酸 素 産 生 (主 と して酸 素 依 存 性 殺 菌) へ の 血 清 の 関与 をCL反 応 で 測 定 した 。 Aa刺 激 に お け るCL反 応 は, 正 常 血 清 や 免 疫 血 清 の 添 加 で増 加 を認 め た が, 血 清 の 非 働 化 に よ り失 わ れ た こ と, 正 常 血 清 と非 働 化 免 疫 血 清 の 等 量 添 加 の増 加 が 正 常 血 清 単 独 添 加 の増 加 と有 意 差 を認 め な か っ た こ と か ら, 補 体 の み に 依 存 す る増 加 で あ っ た 。Holm ら14) や 加 藤 ら15) もAa刺 激 に お け るCL反 応 の増 加 に 補 体 の関 与 を報 告 し て い るが, 抗 体 の協 同 作 用 の検 討 は行 っ て い な い 。 Pg刺 激 にお け るCL反 応 の 増 加 は, 正 常 血 清 や 非 働 化 免 疫 血 清 単 独, す な わ ち補 体 や 抗 体 単 独 で は増 加 を 認 め ず, 両 者 を 同 時 に加 え る と4倍 程 度 に 増 加 し た。 この 結 果 か らCL反 応 に対 す る補 体 と抗 体 の 協 同 作 用 の 存 在 を 明 らか に し, 特 に 抗 体 価 に お け るIgG の高 度 な 増 加 を示 して い る こ と を考 慮 す る と, IgGと C3に お け る古 典 経 路 が 関 与 して い る と考 え られ た 。 Fn刺 激 に お け るCL反 応 は, Whyteら16) が 報 告 し て い る通 り, 血 清 の 添 加 と は無 関 係 に高 い 値 を 示 し た 。 また, リンパ 球 やPMNとFnの 接 着 にGalNAc な どの レ ク チ ン ・レセ プ タ ー が 関与 す る報 告17, 18) も あ る。 本 実 験 で の 糖 添 加 に よ るCL反 応 阻 害 試 験 もGal やGalNAcで 強 く阻 害 し, この レ ク チ ン ・レセ プ タ ー 系 がCL反 応 に 関 与 す る こ と を示 し た。 また, CL反 応 はmannanに よ っ て50%程 度 阻 害 さ れ, 前 二 者 よ り弱 い なが ら関係 の あ る こ と を示 した 。 次 に, PMNの 食 菌 能 (食 菌 率, 食 菌 数) に お よ ぼ す血 清 の 影 響 を検 討 した 。 血 清 無 添 加 時 の食 菌 能 は3菌 種 と も低 い結 果 とな っ た が, 特 にAa Y4株 とPgは 英 膜 を有 し19) , 食 菌 の 抵 抗 性 因 子 で あ る こ とが 原 因 の一 つ で あ る と考 え られ た 。 また, Fnは 最 も低 い食 菌 能 を 示 した が, 形 態 的 に大 き く菌 体 をPMN内 に 取 り込 む の が 難 し い 可 能 性 もあ っ た 。
歯周病原性細菌に対 する補体 ・抗体の白血球機能 におよぼす影響 637
表7Aa, Pg, Fnに 対 す るPMN殺 菌 へ の正常血 清 お よび免疫血 清 の添加 効果 と 非 働化 によ る影響 (好 気条 件下)
表8Pg, Fnに 対 す るPMN殺 菌へ の正 常血清 お よび免 疫血清 の添 加効 果 と非働 化 に よる影 響 (嫌 気 条件下)
638 日歯 周 誌37 (4) : 628∼640, 1995 本 実 験 に お け るAaに 対 す る食 菌 機 能 はCL反 応 と 同 様, 正 常 血 清 や 免 疫 血 清, 正 常 血 清 と非働 化 免 疫 血 清 の 等 量 添 加 で 同 程 度 の増 加 が あ り血 清 の 非働 化 に よ り失 わ れ た こ とか ら, 特 別 な 抗 体 の関 与 が 少 な く, 補 体 の み に依 存 した 食 菌 能 の 著 しい 増 加 で あ る こ とを示 した 。 これ は, Aaに 対 す るPMNの 効 果 的 な 食 菌 が 主 と し て補 体 古 典 経 路 を介 さ ず, 副 経 路 に依 存 す る可 能 性 を示 唆 し, こ れ はWilsonら の 報 告20) に あ るC3 biに よ るオ プ ソニ ン化 の 可 能 性 も考 え られ た。 Pgは オ プ ソ ニ ン効 果 が 少 な い とい う報 告21) も あ る が, 本 実験 に お け るPgに 対 す る食 菌 機 能 は正 常 血 清 と非 働 化 免 疫 血 清 の等 量 添 加, す な わ ち 補 体 と抗 体 の 存 在 下 で増 加 が 認 め られ た 。 病 原 性 の 高 いPgの 食 菌 促 進 に は補 体 と抗 体 が 必 要 との 報 告22) も あ る 。 本 実 験 で も同 様 の結 果 を得 た こ とか ら, 本 菌 が 強 毒 株 で あ る と推 察 さ れ, 恐 ら く抗 原 抗 体 反 応 か ら始 ま る古 典 経 路 を利 用 す る もの と考 え られ た。 Fnに 対 す る食 菌 機 能 はAaと 同様, 正 常 血 清 や 免 疫 血 清, 正 常 血 清 と非 働 化 免 疫 血 清 の 等 量 添 加 で 同 程 度 の増 加 を示 し, 特 異 抗 体 の関 与 の低 い こ とを 明 らか に した 。 また, 血 清 の 非働 化 に よ る食 菌 能 の低 下 は, Fnの 食 菌 に補 体 の 関 与 が 主 体 と な る こ と を強 く示 唆 した 。 PgとFnに つ い て 嫌 気 条 件 下 の 食 菌 能 に つ い て も 検 討 を加 え た が, 食 菌 能 の 多 少 の 減 少 は認 めた もの の 血 清 添 加 に よ る影 響 は好 気 条 件 下 と同様 の傾 向 を示 し た 。 血 清 添 加 に よ りCL反 応 や食 菌 能 の 増 加 が 認 め られ た が, 実 際 の殺 菌 効 果 を知 る 目 的 で, まず 血 清 に よ る 殺 菌 効 果 を経 時 的 に 生 残 率 か ら検 討 した 。 定 常 期 に達 した細 菌 は抗 体 に対 して感 受 性 を持 た な い23) こ とか ら, 本 実 験 で は対 数 期 の細 菌 を使 用 した 。 し か し, Aa, Pg, Fnは50%濃 度 免 疫 血 清 中 で も生 残 率 の減 少 を認 め る こ とが で き なか っ た 。 Aa, Pgの 免 疫 血 清 に よ る殺 菌効 果 が 低 い こ と を示 す報 告 が あ る。
Aaは, Miyasakiら24) , Holmら25) , Sandqvist ら26) が, Pgで はOkudaら27) が報 告 し て い る。Okuda ら は107個 以 下 の 菌 数 で は免 疫 血 清 の 効 果 を 認 め た が, 同 時 に107個 以 上 の菌 数 で は効 果 が 少 な い こ と も 観 察 し て い る。本 実 験 で は100%近 くの 生 菌 率 を 得 た 。 これ は5×107個 の 菌 数 を用 い た こ とが 理 由 の 一 つ で あ る か も し れ な い 。 しか し, 患 部 歯 肉 溝 中 に は 107∼8個の菌 が 存 在 し, 口腔 内 に近 い条 件 だ とす れ ば, 口腔 内 で の 殺 菌 は 困 難 で あ る と思 わ れ た 。 さ ら に, Pgに はIgGやC3, C5を 破 壊 す る プ ロ テ ア ー ゼ 活 性 の 存 在28) も知 られ て い る。 これ が 生 残 率 を減 少 させ な い原 因 の 一 つ で あ る可 能 性 もあ るが, 本 実 験 は血 清 濃 度 が50%と 高 濃 度 で あ る こ と, 血 清2%の 存 在 が Pgの 線 維 芽 細 胞 に対 す る傷 害 を抑 制 す る報 告29) も あ る こ とか ら, この プ ロ テ ア ー ゼ 作 用 を考 慮 に い れ る必 要 性 は な い と考 え られ た 。 Evansら30) はFn殺 菌 効 果 にIgMが 関 与 す る こ と を報 告 し て い る。 本 実 験 で は, 免 疫 血 清 のIgM抗 体 価 が25×107と 中等 度 の 上 昇 だ っ た こ とや 菌 株 の 違 い か ら, 生 残 率 の減 少 を示 さ な か った 可 能 性 も あ る。 ま た, 血 清 添 加 に よ って 生 残 菌 が血 清 無 添 加 時 よ り多 く な っ た 結 果 か ら, 血 清 成 分 がFnの 発 育 また は生 残 環 境 を整 えて い る こ とが 示 唆 さ れ た 。 最 後 に, PMN殺 菌 能 を経 時 的 に 生 残 率 か ら検 討 し た 。 好 気 条 件 下 で の菌 の み の対 照 と比 較 して, PMN単 独 で は3菌 種 と も生 残 率 の減 少 を認 めず, PMN単 独 殺 菌 効 果 は 得 ら れ な か った 。 これ は, 菌 のPMN殺 菌 に対 す る感 受性 の低 さ の 他, 血 清 無 添 加 時 の食 菌 能 の低 さ も関 与 して い る と思 わ れ た 。 Aaは, CL反 応 や 食 菌 能 に お い て 補 体 依 存 性 の 増 加 を 示 し た が, 生 残 率 の 減 少 を 認 め ずPMN殺 菌 促 進 効 果 は得 られ な か った 。 そ の 原 因 と し.てロ イ コ トキ シ ン に よ るPMNの 傷 害 作 用 が あ る が, MPO-H、02 -halideの 作 用 で 不 活 化 す る31) こ と, PMN傷 害 作 用 を示 す前 に食 菌 さ れ る32) こ とか ら, 本 実 験 に お い て ロ イ コ トキ シ ンの 作 用 を考 慮 に い れ る必 要 は な い と考 え られ る。 ま た, Aaは カ タ ラ ー ゼ 産 生 能 を有 し33) て お りH、0、 に よ る殺 菌 に抵 抗 性 を 示 す34) こ と も本 実 験 の 結 果 を裏 付 け る と考 え られ た 。 さ ら に マ ウ スPMN に お け る デ ィフ ェ ン シ ンの欠 如35) も考 慮 す べ き点 で あ る が, 加 藤 ら (未 発 表) は ヒ トPMNと 血 清 を用 い 検 討 した 結 果, 100%の 食 菌 率 を示 す に もか か わ らず 生 残 率 の 減 少 を認 め て い な い。 Pgで は, PMNと 補 体, 抗 体 の 協 同 作 用 に よ り 22.7% (60分 後) の 減 少 を 示 し た。 し か し こ の 減 少 は5×108個 の菌 数 に対 し て4×108個 の生 残 が あ り, 効 果 的 なPMN殺 菌 促 進 効 果 と は 考 え 難 か っ た。 さ ら にPgの 持 つSOD活 性 が 酸 素 耐 性 獲 得 と相 関 が あ る36) こ とや, 全 体 量 と してCL反 応 の 上 昇 がFnな ど に比 べ 低 い こ と も酸 素 依 存 性 殺 菌 を主 体 と した 殺 菌 機 構 に抵 抗 性 を示 す と考 え られ た 。 FnもPMN殺 菌 促 進 効 果 は認 め られ な か っ た が, 血 清 を添 加 す る こ とで 生 残 菌 が 多 くな った 。 この 結 果 か ら, Fnで はPMNに 摂 取 さ れ て も血 清 成 分 に よ っ て 菌 体 が コー トされ て い れ ば, 活 性 酸 素 や顆 粒 成 分 に よ る殺 菌 に対 し抵 抗 性 を 示 す と推 察 され た 。 本 実 験 に お け る結 果 か ら, 歯 周 炎 患 者 の 患 部GCF
歯 周病 原 性細菌 に対 す る補 体 ・抗 体 の 白血 球 機 能 に お よぼ す影 響 639 に お け る補 体 や 抗 体, PMNはAa, Pg, Fnに 対 し て生 体 防御 的 な役 割 が 少 な い と考 え られ た 。 謝 辞 稿 を終 える にあた り, 論文 作成 に御協 力 頂 き ました 口腔 微 生物 学教室 各位 に心 か らお礼 申 し上 げ ます。
文
献
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