日本 細 菌 学 雑 誌 52 (4): 719-726, 1997 (C) 1997日 本 細 菌 学 会
微生物学の進歩
反芻動 物 の第 一 胃内 に生息 するセルロー ス分解 菌
Fibrobacter succinogenes の特 性
-セルロ
ー ス へ の 付着 を 中 心 と
して-三
森
真
琴1・ 湊
一2
1農林 水産 省畜産試験場飼養環境部 〒305
茨誠県稲敷郡茎崎町池の台2
2茨 城大学 農学部生物 生産学科 〒300-03 茨城県稲敷郡阿見町中央3-21-1
〔受 理: 1997年9月2日 〕は
じ
め
に
牛, 羊, 山羊 な ど の反 芻 動 物 は 第 一 胃か ら第 四
胃 ま で の4つ
の 胃 を 持 ち, 単 胃動 物 とは 異 な る
方 法 で飼 料 を消 化 して い る。 口腔 内で 咀 嚼 され た
飼 料 が 最 初 に入 る第 一 胃 (ル ー メ ン) は, 成 牛 で
150∼200リ
ッ トル もの 容 積 が あ る 大 き な発 酵 槽
で あ る。 こ こに 生 息 す る細 菌, プ ロ トゾ ア, 真 菌
類 な ど の微 生 物 は 互 い に 関 連 しな が らル ー メ ン微
生 物 生 態 系 を 形 成 して い る。 この ル ー メ ン微 生 物
生 態 系 が 多 量 の 飼 料 を 分 解 す る こ とで反 芻動 物 に
特 有 なル ー メ ン発 酵 を 成 立 させ て い る。 ル ー メ ン
内に 生 息 す る細 菌 (ル ー メ ン細 菌) は1010∼1011
/g, プ ロ トゾア は105∼106/gの
密 度 で存 在 し, 飼
料 を 分 解 して酢 酸, プ ロ ピオ ン酸, 酪 酸 な どの揮
発 性 脂 肪 酸 (volatile
fatty acid, VFA)
を 産 生 し
て い る。 これ ら のVFAは
胃壁 か ら吸 収 され, 家
畜 の 必 要 とす る エ ネ ル ギ ーの 約70%を
供 給 して
い る。 また, 増 殖 した微 生 物 は第 四 胃以 下 で消 化
され て, 反 芻動 物 の 主要 な タ ンパ ク質 源 とな って
い る。 ル ー メ ン細 菌 は ル ー メ ン内 のVFA生
産 の
面 で 主要 な役 割 を担 って い る と考 え られ て い る。
ル ー メ ン細 菌 が生 息 す る ル ー メ ン内 の環 境 は,
pHが5.5∼7.0,
浸 透 圧 が260∼350mOsm/kg
に 維 持 さ れ, 高 度 な 嫌 気 性 で-150∼-350mv
の酸 化 還 元 電 位 を示 して い る。 こ のた め, 多 数 の
偏 性 嫌 気 性 菌 が 生 息 して い る。 これ らの 偏 性 嫌 気
性 の ル ー メ ン 細 菌 は, 1940年
代 に 米 国 の
Hungate が培 地 の 調 製, 検 査 材 料 の処 理, 接 種,
釣 菌 な どの操 作 を 酸 素 を 含 まな い 状 態 で 実 施 す る
嫌 気 性 培 養 法 お よび ル ー メ ン内 環 境 を 考 慮 した
ル ー メ ン内環 境 類 似 培 地 を 開 発 した こ とに よ り初
め て分 離 ・培 養 が 可 能 とな った。 この 手 法 に よ り
Hungateは,
1950年 に セ ル ロー ス を 分 解 す る細
菌 (セル ロー ス分 解 菌) を ル ー メ ンか ら初 め て分
離 した (15)。 こ れ が Bacteroides (Fibrobacter)
succinogens で あ る。 しか し, か れ が 分 離 した 株
は 現 存 して い な い。Bryant らが1954年 に 分 離 し
たS85株
が 基 準 株 と され, 今 日 ま で多 くの 研 究
に 使 わ れ て い る。
1. Fibrobacter
succinogenes
の細 菌 学 的 特 徴
F. succinogenes は, 偏 性 嫌 気 性, グ ラム陰 性 の
桿 菌 (0.3∼0.8×0.9∼2μm) で あ る が, セ ル ロー
ス に 付 着 した菌 は セ ル ロー ス との接 触 面 で多 形 性
Makoto MITSUMORI1 and Hajime MINATO2
Characteristics
of the Cellulolytic Ruminal Bacterium
Fibrobacter
succinogenes
and
Its
Attachment
to
Cellulose
1 National Institute of Animal Industry, Kukizaki, Ibaraki
305
2 Faculty of Agriculture, Ibaraki University, Ami, Ibaraki
300-03
を 示 し て い る。 こ の 多 形 性 は セ ル ロ ー ス と の 接 触 面 積 を 広 くす る こ と で セ ル ロ ー ス 分 解 を 促 進 し て い る と考 え ら れ て い る。 本 菌 は 糖 源 と し て セ ル ロ ー ス, グ ル コ ー ス, セ ロ ビ オ ー ス しか 利 用 し な い こ とか ら他 の ル ー メ ン細 菌 に 比 べ て 狭 食 性 の セ ル ロ ー ス 分 解 菌 で あ る と い え る。 セ ル ロ ー ス か ら の 発 酵 生 産 物 は ギ 酸: 酢 酸: コ ハ ク酸 で あ り, そ の モ ル 比 は お よ そ0.2:0.6:1.3で あ る。 コ ハ ク 酸 (succinate) が 主 要 な 発 酵 生 成 物 で あ る こ と か ら 本 菌 に succinogenes の 名 が 与 え ら れ た。GC 含 量 は, 42.8∼49.1モ ル%で あ る (15)。 本 菌 は, そ の 形 態 お よ び 培 養 性 状 に よ っ て Bacteroides 属 に 帰 属 し て い た が, そ の 後 の 研 究 に よ りス フ ィ ン ゴ リ ピ ッ ドを 含 ま な い こ と あ る い は 直 鎖 型 の 長 鎖 脂 肪 酸 を 多 量 に 含 む こ と な ど か ら, 本 属 へ の 帰 属 に 疑 問 が 提 起 さ れ た (15)。 1988年 に Montgomery ら は16S rRNA解 析 の 結 果 を 基 に 本 菌 を Bacteroides 属 か ら 独 立 さ せ, Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes と 命 名 し, そ の 他 に Fibrobacter succinogenes subsp. elongata お よ び F. intestinalis の 新 種 を 提 案 し (13), 現 在 に 至 っ て い る。 本 菌 は 反 芻 動 物 の ル ー メ ン か ら 分 離 さ れ る 他 に, ラ ッ ト, 豚, 馬, マ ウ ス, 野 ネ ズ ミ, サ ル (langur monkey) な ど の 腸 管 内 容 物 か ら も 分 離 さ れ て い る。 さ ら に16S rRNAの 塩 基 配 列 を 利 用 し た 研 究 で, 全16S rRNAに 対 す る Fibrobacter 属 の16S rRNAは, ル ー メ ン 内 容 物 で 約3%, 馬 の 盲 腸 お よ び 大 腸 内 容 物 で 各 々 約 12%と4%を 占 め て い る こ と が 明 ら か に な っ て い る。 2. ル ー メ ン 内 で の F. succinogenes の 生 態 反 芻 動 物 が 摂 取 す る 植 物 性 飼 料 に は, セ ル ロ ー ス, ヘ ミセ ル ロ ー ス, 糖, デ ン プ ン な ど の 炭 水 化 物 が 多 く含 ま れ て い る。 反 芻 動 物 自体 は セ ル ロ ー ス や ヘ ミセ ル ロ ー ス な ど の 植 物 性 繊 維 を 消 化 す る 酵 素 を 産 生 し な い が, ル ー メ ン 内 に 生 息 す る 細 菌, プ ロ ト ゾ ア, 真 菌 類 な ど の 微 生 物 は 植 物 性 繊 維 をVFAに ま で 分 解 す る。 反 芻 動 物 は こ の VFAを エ ネ ル ギ ー 源 と し て 利 用 し て い る。 こ れ ら の 微 生 物 の う ち, ル ー メ ン細 菌 は そ の 生 活 様 式 に よ り, ル ー メ ン 内 の 液 状 部 で 生 活 す る 遊 離 型 菌 群, ル ー メ ンに 流 入 した 植 物 片 や 穀 物 粒 に 付 着 あ る い は 局 在 して して 生 活 す る 固 形 飼 料 固 着 菌 群, ル ー メ ン 内 壁 の 重 層 扁 平 上 皮 に 付 着 あ る い は 局 在 し て 生 活 す る ル ー メ ン上 皮 固 着 菌 群 お よ び プ ロ ト ゾ ア の 体 表 に 固 着 して 生 活 す る プ ロ ト ゾ ア 体 表 固 着 菌 群 に 群 別 さ れ て い る。 固 形 飼 料 固 着 菌 群 は ル ー メ ン 内 の 総 細 菌 集 団 の う ち の 約50∼75%を 占 め, ル ー メ ン 内 の エ ン ド グ ル カ ナ ー ゼ 活 性 の 80%, ア ミ ラ ー ゼ 活 性 の70%お よ び プ ロ テ ア ー ゼ 活 性 の75%を 担 っ て い る こ と か ら, 飼 料 の 分 解 で 主 要 な 役 割 を 演 じ て い る と考 え ら れ て い る。 さ ら に, ル ー メ ン 細 菌 は 基 質 の 利 用 性 で, セ ル ロ ー ス 分 解 菌, デ ン プ ン分 解 菌, ヘ ミ セ ル ロ ー ス 分 解 菌, 水 溶 性 糖 類 分 解 菌, 中 間 代 謝 物 利 用 菌, タ ン パ ク質 分 解 菌 お よ び 脂 肪 分 解 菌 な ど に 群 別 さ れ て い る。 セ ル ロ ー ス 分 解 菌 は 粗 飼 料 の 主 な 構 成 成 分 で あ る 繊 維 質 を 分 解 す る こ とか ら, ル ー メ ン 発 酵 系 で 最 も 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る と考 え ら れ て い る。 これ ま で に ル ー メ ン 内 か ら 分 離 さ れ た セ ル ロ ー ス 分 解 菌 と し て F. succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus alus, Ruminococcus flavefaciens, Eubacterium cellulo-solvens, Clostridium polysaccharolyticum, Clostri-dium lochheadii な ど が 知 ら れ て い る。 こ れ ら の 細 菌 の な か で F. succinogenes, B. fibrisolvens, R. albus, R. flavefaciens, E. cellulosolvens は セ ル ロ ー ス に 付 着 す る こ と が 確 か め ら れ て お り (10), 固 形 飼 料 固 着 菌 群 で あ る。 ま た, F. succinogenes は セ ル ロ ー ス 分 解 能 が 高 い こ と お よ び 全 ル ー メ ン細 菌 の0.5∼7.0%も の 割 合 を 占 め る と 推 定 さ れ る こ と な どか ら, ル ー メ ン 内 の セ ル ロ ー ス 分 解 で 主 要 な 働 き を し て い る と考 え られ て い る。 F. succinogenes は, ル ー メ ン 内 で ど の よ う な 生 活 を 送 っ て い る の だ ろ うか? 推 定 さ れ る 生 活 様 式 を 図1に 示 した。 ル ー メ ン 内 で は 主 に 固 形 飼 料 に 固 着 し て い る と考 え られ る が, 一 部 の も の は 遊 離 型 と し て も 存 在 し て い る と思 わ れ る。 3. F. succinogenes の 産 生 す る セ ル ロ ー ス 分 解 酵 素 本 菌 の 産 生 す る セ ル ロ ー ス 分 解 に 関 与 す る 酵 素 と し て エ ン ド グ ル カ ナ ー ゼ が7種 類 (Aか ら G), セ ロ デ キ ス ト リナ ー ゼ が1種 類, セ ロ ビ オ
日本 細 菌 学 雑誌 52 (4), 1997
ヒ ドロ ラ ー ゼ が1種
類, エ ン ドキ シ ラ ナ ー ゼ が
3種 類, ア セチ ル キ シ ラ ンエ ス テ ラ ーゼ が1種 類
の存 在 が 確 認 され て い る。 これ ら の酵 素 が 複 合 的
に植 物 性 飼 料 に作 用 して, セ ル ロー スを 分 解 して
い る と考 え られ て い る。 本 菌 は キ シ ラ ンの分 解 産
物 で あ る キ シ ロー ス を 炭 素 源 と して 利 用 しな い
が, キ シ ラ ン分 解 酵 素 で あ る エ ン ドキ シ ラナ ー ゼ
と ア セ チ ル キ シ ラ ンエ ス テ ラ ー ゼ がS85株
で 確
認 され て い る。 これ らは 植 物 組 織 で セ ル ロー ス と
密 に結 合 して い る キ シ ラ ンを 分 解 す る こ とに よ り
埋 もれ て い る セ ル ロー スを 露 出 させ る の に働 い て
い る もの と推 察 され る。
これ ら の酵 素 が 実 際 の 飼 料 分 解 に ど の よ うに関
与 してい るか の解 明 は, 本 菌 のル ー メ ン内 で の働
き, 特 に 飼 料 の 分 解 効 率 を 高 め るた め の 重 要 な課
題 で あ る。 一 方, 飼 料 片 へ の 付 着 は セ ル ロ ース の
分 解 を開 始 す る最 初 の ス テ ップ と考 え られ, 本菌
が 産 生 す る セル ロー ス分 解 酵 素 を セ ル ロ ース に接
近 させ, 効 率 的 に 働 か せ るの に不 可 欠 な過 程 と考
え られ て い る。 また, ル ー メ ン内 で は液 体 は 固形
物 よ りも速 くル ー メ ンか ら第 二 胃以下 に流 下 す る
こ とか ら, ル ー メ ン微 生 物 系 で優 位 な生 態 学 的 地
位 を 確 保 す るた め に も飼料 片 へ の付 着 は重 要 な性
質 と考 え られ て い る。
4. F. succinogenes の セ ル ロー ス へ の付 着
1) 電 子 顕 微 鏡 に よ る観 察
ル ー メ ン内 の 固 形 飼料 の 電子 顕 微 鏡 に よる観 察
で R. albus, R. flavefaciens, F. succinogenes
な どの
セル ロー ス分 解 菌 が 植物 性 の飼 料 片 に付 着 して い
図1. ル ー メ ン内 で の F. succinogenes の生 活 様 式 (A) ル ー メ ンに 流 入 した植 物 性 飼 料 (特に セ ル ロ ース) へ の付 着。(B) セル ロ ース 分 解 の 開 始。 セ ル ロー ス との 接 触 面 で 少量 の 小胞 が形 成 され る。(C) 活 発 に セ ル ロ ース を 分 解。 多 数 の 小 胞が 形 成 され る。 セ ル ロー ス はVFAに まで分 解 され, VFAは 家 畜 の 胃壁 か ら吸 収 され る。(D) セ ル ロー ス の大 部 分 が 分 解 され た 状 態。 増 殖 した 菌 お よび 付 着 して い た セ ル ロー ス を 完 全 に 分 解 した 菌 は, 遊 離 状 の菌 と して ル ー メ ン内 の液 状 部 を 漂 う。(E) 遊 離 状 の菌 は セ ル ロー ス に付 着 して セ ル ロー ス分 解 を 開始 す るか, ル ー メ ンか ら流 出 して第 四 胃以 下 で 消 化 され て 家 畜 の タ ンパ ク 質 源 と して利 用 され る。 721る こ と が 明 らか に さ れ て い る。F. succinogenes が 植 物 細 胞 壁 に 密 着 し て 付 着 し て い る の に 対 し て, R. flavefaciens は や や 距 離 を お い て 付 着 し, R. albus はR. flavefaciens よ り も さ ら に 距 離 を お い て 付 着 し て い る こ と が 観 察 さ れ, これ ら の 細 菌 の セ ル ロ ー ス へ の 付 着 様 式 は 菌 種 に よ り異 な る と 推 定 さ れ て い る。Cheng ら は, ル ー メ ン細 菌 が ル テ ニ ウ ム レ ッ ドで 染 色 さ れ る 多 糖 体 や 糖 タ ン パ ク 質 か ら な る グ リ コ カ リ ッ ク ス で 囲 ま れ て い る こ と を 明 ら か に し, こ の グ リ コ カ リ ッ ク ス 層 の 厚 み は 菌に よ り異 な る こ と を 示 して い る。 さ ら に か れ ら は, ル ー メ ン細 菌 に よ る 飼 料 の 分 解 を 経 時 的 に 観 察 し, R. albus, R. flavefaciens, F. succinogenes
と み られ る 菌 が 植 物 組 織 の 細 胞 壁 の 切 断 面, 細 胞 表 層 の 傷 つ い た 部 分 あ る い は 気 孔 周 囲 で 付 着 ・増 殖 す る こ と に よ り植 物 組 織 内 部 に 侵 入 し, 組 織 を 破 壊 し て い く こ と を 明 ら か に した (2)。 Kudo ら は F. succinogenes の 電 子 顕 微 鏡 に よ る 観 察 で, セ ル ロ ー ス に 付 着 し た 菌 体 は メ チ ル セ ル ロ ー ス (MC) の 添 加 に よ り セ ル ロ ー ス か ら 離 脱 し, 菌 体 が 離 れ た セ ル ロ ー ス に は セ ル ロ ー ス 繊 維 の 方 向 と平 行 に セ ル ロ ー ス が 分 解 さ れ て で き た 溝 が 刻 まれ て い る こ と を 明 らか に した (図2) (6)。 Gaudet ら は, セ ル ロ ー ス に 付 着 し た F. suc-cinogenes の 菌 体 は セ ル ロ ー ス と の 接 触 面 で 外 膜 の 一 部 が 菌 体 側 で 陥 没 し, そ れ は 幅200∼800 nm, 深 さ100∼300nmの ポ ケ ッ トに 発 達 し, こ の ポ ケ ッ トは 外 膜 か ら 派 生 し た と見 られ る 直 径 約 20∼30nmの 小 胞 (vesicle) で 満 た さ れ て い る こ と を 観 察 した (図1)。 ま た, セ ロ ビ オ ー ス を 基 質 と し て 培 養 し た 場 合 に, 1%前 後 の 細 胞 で 外 膜 の 一 部 が 菌 体 表 面 か ら 突 き 出 し て 直 径 約 100nmの 小 胞 を 形 成 し, そ の 一 部 は 菌 体 か ら遊 離 し て 培 地 中 に 放 出 さ れ る こ と を 示 し た (3)。 McGavin ら は, こ の 膜 小 胞 (membrane vesicles) に 多 く の セ ル ロ ー ス 分 解 酵 素 が 含 ま れ て い る こ と を 明 らか に し, セ ル ロ ー ス の 分 解 に 重 要 な 働 き を し て い る の で は な い か と推 察 して い る (8)。 2) 生 化 学 的 研 究 Minato ら は F. succinogenes の 培 養 液 に セ ル 図2. セ ル ロ ー ス に 付 着 し た F. succinogenes (A) セ ル ロ ー ス に 付 着 した F. succinogenes。 菌 が セ ル ロ ー ス 繊 維 の 伸 長 方 向 と 同 じ方 向 に 配 列 し て い る こ と に 注 目。(B) MC処 理 で F. succinogenes を 離 脱 さ せ た セ ル ロ ー ス 繊 維。 セ ル ロ ー ス 繊 維 の 伸 長 方 向 と 同 じ方 向 に 溝 が 刻 ま れ て い る。(工 藤 博 士 提 供) A B
日本 細 菌 学 雑 誌 52 (4), 1997 ロ ー ス 粉 末 を 加 え る と 菌 液 の 光 学 濁 度 が 低 下 す る こ と か ら 本 菌 が セ ル ロ ー ス に 付 着 す る こ と を 明 ら か に した(9)。 そ の 後, 本 菌 の 付 着 に 及 ぼ す 種 々 の 条 件 に つ い て も 研 究 が 進 ん だ。 これ ら の 成 績 を 表1に ま と め た。 菌 の セ ル ロ ー ス へ の 付 着 は 低 温 お よ び 高 温 で 抑 制 され, あ る 程 度 の イ オ ン 強 度 お よ びCa2+とMg2+を 必 要 と し, 種 々 の プ ロ テ ナ ー ゼ 処 理 で 付 着 率 が 低 下 す る こ と が 明 ら か と な っ た。Gong ら は 変 異 原 を 用 い て セ ル ロ ー ス へ の 付 着 能 を 欠 い た 突 然 変 異 株 を4株 作 出 し た。 こ れ ら の 菌 株 は, セ ル ロ ー ス の 分 解 性 お よ び 糖 の 利 用 性 に よ り 区 別 さ れ, そ れ ら の う ち2株 は セ ル ロ ー ス で 培 養 す る と セ ル ロ ー ス へ の 付 着 能 が 回 復 し た こ とか ら, セ ル ロ ー ス 結 合 因 子 の 調 節 機 構 に 何 ら か の 障 害 が 起 きた た め と推 察 し て い る。 し か し, 各 菌 株 間 の 菌 体 タ ン パ ク質 のSDS-PAGE 像 に は 差 異 が 認 め られ な か っ た と し て い る (5)。 5. F. succinogenes の セ ル ロー ス 付 着 因 子 F. succinogenes の セ ル ロ ー ス へ の 付 着 に 介 在 し て い る 物 質 (セ ル ロ ー ス 付 着 因 子) は 何 で あ ろ う か? わ れ わ れ は プ ロ テ ナ ー ゼ 処 理 や 低 温 お よ び 高 温 条 件 下 で 菌 体 の セ ル ロ ー ス へ の 付 着 率 が 低 下 す る こ と に 着 目 し, 次 の 実 験 を 行 っ た。F. suc-cinogenes S85株 を 界 面 活 性 剤 で 溶 菌 さ せ, そ れ に0.1%量 の セ ル ロ ー ス 粉 末 を 添 加 し て よ く撹 拌 した。 セ ル ロ ー ス 粉 末 を 回 収 して 緩 衝 液 で 洗 浄 し た 後, 1%カ ル ボ キ シ メ チ ル セ ル ロ ー ス (CMC) ま た は10%セ ロ ビ オ ー ス で タ ン パ ク 質 を セ ル ロ ー ス か ら 溶 出 す る と い う実 験 で あ る。 も し, 菌 の セ ル ロ ー ス へ の 付 着 に 関 与 し て い る タ ン パ ク 質 が あ れ ば, 溶 出 液 のSDS-PAGE像 で バ ン ドが 観 察 さ れ る は ず で あ る。 結 果 は, い ず れ の 溶 出 液 に も 約118kDaと225kDaの タ ン パ ク 質 が 含 ま れ て い る こ と が 確 認 さ れ た (図3) (11)。 ど ち ら の 溶 出 に お い て も118kDaの タ ン パ ク質 が メ ジ ャ ー で あ っ た。 これ ら の タ ン パ ク質 は セ ル ロ ー ス 結 合 性 タ ン パ ク 質 (cellulose-binding protein, CBP) で あ る こ と か ら, 118kDaの タ ン パ ク 質 をCBP1, 225kDaの タ ン パ ク質 をCBP2と 名 付 け, そ れ ら の 精 製 を 行 っ た。 さ ら に, CBP1に 対 す る 抗 血 清 を 作 製 した。 こ の 抗 血 清 を 用 い た ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ トでF. succinogenes の10株 お よ び 表1. F. succinogenes の セ ル ロ ー ス へ の 付 着 に 影 響 を 及 ぼ す 因 子
Bhat ら (1), Gong ら (5), Minato ら(10), Mitsu-mori ら (11), Rober ら (14) よ り
F. intestinalis の1株 に お け るCBP1の 存 在 を 調 べ た と こ ろ, 全 て の 菌 株 でCBP1が 確 認 さ れ た。 こ の こ とか ら, CBP1は 属 特 異 的 な タ ンパ ク質 で あ る と 推 測 さ れ た。 こ れ ら の 実 験 で F. suc-cinogenes の セ ル ロ ー ス へ の 付 着 に 関 与 し て い る 可 能 性 の 高 い2つ の タ ンパ ク 質 が 確 認 さ れ た。 Gong ら は わ れ わ れ と類 似 の 方 法 でCBPの 検 出 を 試 み て い る。 し か し, か れ ら は セ ル ロ ー ス を SDS-PAGEの サ ン プ ル バ ッ フ ァ ー に 懸 濁 し て 煮 沸 す る 方 法 でCBPを 溶 出 し て い る。 か れ ら の 実 験 で は40, 45, 50, 120, 180, 220, 240kDa のCBPが 検 出 さ れ た (4)。 菌 細 胞 の ペ リ プ ラ ズ ム に 含 ま れ て い た の は40, 45, 50, 120kDaで あ り, 外 膜 に 含 ま れ て い た の は120, 180, 220, 240kDaで あ っ た。 外 膜 か ら 検 出 さ れ た4つ の CBPの う ち, 220と240kDaのCBPは セ ル ロ ー ス に 結 合 しな か っ た 分 画 か ら も 常 に 検 出 さ れ た た め, セ ル ロ ー ス へ の 結 合 能 が 低 い も の と 推 測 し て い る。 か れ ら は180kDaのCBPに 対 す る 抗 血 清 を 作 製 し, 特 異 的IgGを180kDaのCBPを リ ガ ン ド とす る ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー で 精 製 し た。 こ のIgGと 菌 と を 混 ぜ た と こ ろ, 49%の 付 着 阻 止 が 見 ら れ た と し て い る。 しか し, か れ ら の 使 用 し たIgG溶 液 は 自 家 凝 集 を 起 こ す ほ ど の 高 濃 度 で あ り, し か も ウ エ ス タ ン プ ロ ッ ト で 約303kDa以 上 の ほ と ん ど全 て の 菌 体 タ ン パ ク質 に 反 応 し て い る こ と か ら そ の 特 異 性 に 疑 問 が あ る。 か れ ら が 検 出 し たCBPはSDSで セ ル ロ ー ス か ら溶 出 し た も の で あ り, こ れ ら のCBP の セ ル ロ ー ス へ の 結 合 が 特 異 的 な も の か 否 か に つ い て は, 今 後 さ ら に 検 討 す る 必 要 が あ る と 思 わ れ る。 6. CBP1遺 伝 子 の ク ロー ニ ン ゲ と そ の 塩 基 配 列 わ れ わ れ は 次 に F. succinogenes のCBP1遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ を 行 っ た (12)。 ク ロ ー ニ ン グ は λgt11で 作 製 し た 遣 伝 子 ラ イ ブ ラ リ ー か ら 抗 CBP1血 清 で ス ク リー ニ ン グ し, 得 られ た 遺 伝 子 断 片 を プ ロ ー ブ と し て さ ら にZAP Expression vector (Stratagene) で 作 っ た 遺 伝 子 ラ イ ブ ラ リー か ら ク ロ ー ンを 選 択 す る 方 法 で 行 っ た。 こ れ ら の ク ロ ー ン のDNAシ ー ク エ ン ス に よ り全 長3,727 bpの 塩 基 配 列 を 決 定 し た。 決 定 さ れ た 塩 基 配 列 に は3.16kbと3.36kbのORFが 逆 向 き に 存 在 し て い た。3.16kbのORFか ら の 推 定 ア ミ ノ 酸 配 列 にCBP1の ア ミ ノ 酸 配 列 の 一 部 が 見 つ か っ た こ と か ら, こ れ がCBP1遺 伝 子 (cbp1) と 同 定 さ れ た。cbp1の 塩 基 配 列 か ら 推 定 さ れ た タ ン パ ク 質 は1,053個 の ア ミ ノ 酸 か ら な り, 分 子 量 118614でSDS-PAGEで 得 ら れ たCBP1の そ れ と 一 致 し た。 最 初 の20個 の ア ミ ノ 酸 は シ グ ナ ル ペ プ チ ド と 推 定 さ れ た。 ま た, 2つ の 繰 り返 し 配 列 が あ る こ と が 明 ら か に な っ た。 cbp1の 推 定 ア ミ ノ酸 配 列 の ホ モ ロ ジ ー 検 索 で 得 ら れ た 結 果 を 図4に 示 した。,ル ー メ ン 以 外 の 図3. セ ル ロ ー ス 粉 末 か ら 溶 出 さ れ た タ ン パ ク 質 の SDS-PAGE像 レ ー ンa: 10%セ ロ ビ オ ー ス で 溶 出 さ れ た タ ン パ ク 質, レ ー ンb: 1%CMCで 溶 出 さ れ た タ ン パ ク質。
ab
日本 細 菌 学 雑 誌 52 (4), 1997 微 生 物 生 態 系 由 来 の セ ル ロ ー ス 分 解 菌 で あ る Clostridium cellulolyticum の 産 生 す る エ ン ド グ ル カ ナ ー ゼ, EGEEDの セ ル ロ ー ス 結 合 ド メ イ ン (cellulose-binding doamin, CBD) と ホ モ ロ ジ ー の 高 い 領 域 が 見 ら れ た。 ま た, CBP1の 繰 り返 し 配 列 は, や は りル ー メ ン 以 外 の 微 生 物 生 態 系 由 来 の セ ル ロ ー ス 分 解 菌 で あ る Clostridium ther-mocellum の 産 生 す る エ ン ド グ ル カ ナ ー ゼ, Ce1J, の 一 部 の 領 域 と ホ モ ロ ジ ー が 認 め られ た。 さ ら に, F. succinogenes SD35株 の セ ル ラ ー ビがCBP1の 約45%の 領 域 で ほ ぼ 一 致 し た。 こ の た め, CBP1 を 大 腸 菌 で 発 現 さ せ て CMCase 活 性 (セ ル ラ ー ゼ 活 性) を 確 認 した と こ ろ, こ の 活 性 が 認 め られ, CBP1が セ ル ラ ー ゼ 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た。 Malburg ら は F. succinogenes S85株 の セ ル ロ ー ス 結 合 性 エ ン ドグ ル カ ナ ー ゼ と し て エ ン ド グ ル カ ナ ー ゼF (EGF) の 遺 伝 子 を ク ロ ー ニ ン グ し, こ の 遺 伝 子 はCBP1と 同 一 で あ り, 以 前 に 報 告 さ れ て い る エ ン ドグ ル カ ナ ー ゼ2 (EG2) で あ る こ と を1997年6月 に 発 表 し た (7)。 こ れ に よ りCBP1はF. succinogenes S85の 産 生 さ れ る エ ン ドグ ル カ ナ ー ゼ の 一 つ で あ る こ と が 確 定 し た。 こ れ ま で の 研 究 でEG2は 酵 素 活 性 が10.4 U/mgと 他 の エ ン ドグ ル カ ナ ー ゼ に 比 べ る と か な り低 い こ とが 示 さ れ て い る。 ま た, EG2は 菌 の 外 膜 と膜 小 胞 に 存 在 し て お り, 膜 小 胞 の エ ン ド グ
ル カ ナ ー ゼ 活 性 の 約11%を
占 め て お り, 外 膜 上
へ の 出現 は セ ル ロー ス との接 触 に よ り促 進 され る
こ とが 明 らか に な っ て い る。 セル ロース を 基 質 と
した培 養 で は, こ の タ ンパ ク質 は 菌 体 そ の もの よ
りもセ ル ロー ス との接 触 面 お よび セル ロース 上 に
多 く存 在 して い る こ とが 免 疫 電 子 顕 微 鏡 で 観 察 さ
れ て い る。
お
わ
り
に
細 菌 に よる セ ル ロー ス分 解 に関 す る研 究 は ル ー
メ ン以 外 の 微 生 物 生 態 系 由来 の Clostridium 属 の
菌 で精 力的 に行 わ れ, これ ら の菌 で は セ ル ロ ソ ー
ム と呼 ばれ る多 種 類 の セ ル ラ ー ゼの 複 合 体 が そ の
主 役 で あ る こ とが 明 らか に な っ てい る。 ル ー メ ン
内 に生 息 す る セ ル ロー ス分 解 菌 に この セ ル ロ ソ ー
ム が存 在 して い るか 否 か につ い て は 多 くの 議論 が
あ り, 一 部 の 菌 で は そ の 存 在 が 示 唆 され て い る
が, ま だ 確 実 な 証 拠 は 得 られ て い な い。F.
suc-cinogenes が セ ル ロー ス に 付 着 して そ れ を 多 種 類
の酵 素 で分 解 して い く過 程 は, これ に 関 与 す る酵
素 とCBPsが
明 らか に され つ つ あ る段 階 で, 今
だ不 明 な点 が 多 く残 され てい る。 わ れ わ れ の発 見
したCBP1は
CMCase
活 性 を 有 して お り, エ ン
ドグ ル カ ナ ー ゼ の一 種 で あ る こ とが 明 らか に な っ
た。 しか し, セ ル ロ ー ス に 結 合 したCBP1が
CMCで
セ ル ロ ー ス か ら 溶 出 さ れ る 性 質 は, F.
succinogenes がCMC等
の添 加 で セル ロー ス か ら
図4. CBP1の 推 定 ア ミノ酸 配 列 との ホ モ ロ ジ ーが 見 つ か った ア ミノ酸 配 列。 □ Signal peptide ■ Cellulase (X88561) from F. succinogenes SD35 □ CBD of EGCCD from C. cellulolyticum□ Reiterated region ■ Unknown domain of CelJ from C. thermocellum ■ CBD of EGH from C. thermocellum